三七NAC转录因子基因PnNAC1的克隆及表达特性分析

王国东，李金晶，白智伟，关瑞攀，杨 野，曲 媛，崔秀明，刘迪秋

(昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500)

三七NAC转录因子基因PnNAC1的克隆及表达特性分析

王国东，李金晶，白智伟，关瑞攀，杨 野，曲 媛，崔秀明，刘迪秋

(昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500)

为了揭示三七抗病防卫反应的调控机制，对三七的一个NAC转录因子的全长cDNA进行了克隆和表达特性分析。以一年生三七幼苗为材料，根据编码NAC转录因子的三七转录组Unigene设计引物，采用快速扩增cDNA末端技术，克隆得到一个新的NAC转录因子基因，命名为PnNAC1。序列分析表明，该基因全长815 bp，含有24 bp的5′非翻译区和215 bp的3′非翻译区，以及576 bp开放阅读框，共编码191个氨基酸，具有保守的NAC结构域。实时荧光定量PCR结果显示茉莉酸甲酯预处理三七根部大幅提高了PnNAC1在根中的转录水平，接种茄腐镰刀菌后，PnNAC1的表达进一步上升，在接种后4 h转录水平达最大值；无菌水预处理的三七中，PnNAC1也快速响应茄腐镰刀菌的侵染，但表达水平明显低于茉莉酸甲酯预处理的样品。接种人参链格孢后PnNAC1在叶片的表达量受抑制。茉莉酸甲酯、乙烯利、水杨酸和过氧化氢4种信号分子处理三七根部均诱导PnNAC1的表达。表明PnNAC1响应几种逆境相关信号分子，并参与三七对茄腐镰刀菌和人参链格孢的防卫反应。

三七；NAC转录因子；茄腐镰刀菌；人参链格孢；防卫反应

转录因子又称反式作用因子，通过调节基因表达水平参与调控生物体的生长代谢过程。NAC (NAM，ATAF and CUC)转录因子是植物中特有的最大的一类转录因子之一。最早在矮牵牛(Petuniahybrida)中分离出第一个NAC转录因子NAM[1]，紧接着在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中发现了具有类似功能的ATAF1/2和CUC2基因[2]，它们编码的蛋白质N端都有一段保守的氨基酸序列。分别取自矮牵牛NAM、拟南芥AT-AF1/ATAF2和CUC2基因的首字母将这类蛋白质命名为NAC[3]。大部分NAC转录因子结构中含有一个保守的N端DNA结合域和一个核定位信号以及一个 C端可变结构域[4]，N端保守的NAC结构域可进一步分为A～E 5个保守的子结构域，具有结合DNA或蛋白质的功能及二聚体化的作用。与N端的高度保守性不同，NAC转录因子的C端无论是在氨基酸序列还是序列长度上都表现出多样性，C端具有转录激活、抑制或结合蛋白质活性[5]。

NAC类转录因子在植物的生命活动中发挥重要作用。拟南芥AtNAC2主要在花和根中高度表达，在拟南芥中超表达AtNAC2能够促进侧根的发育，同时增加植株的耐盐性，AtNAC2的超表达以及促进侧根的形成受乙烯和生长素的诱导[6]。大豆GmNAC004通过促进生长素信号，抑制ABA信号，从而促使侧根的发育[7]。此外，NAC类转录因子还参与调控叶片的衰老和凋亡[8]、顶端分生组织的形成[2,9]、木质部形成及生长调节[10]、促进次生壁的形成和增厚[11-13]。NAC类转录因子也参与植物对生物和非生物胁迫的防卫反应。小麦(Triticumaestivum)TaNAC5参与非生物逆境胁迫及相关信号分子的应答，在小麦受渗透和低温胁迫下TaNAC5基因的表达受诱导并上调，而高盐胁迫则抑制TaNAC5基因表达[13]。水稻(Oryzasativa)SNAC2过表达提高了转基因水稻植株对冷和盐胁迫的抗性，还增强植株对ABA的灵敏度[14]。在水稻中过量表达水稻SNAC1能通过调控保卫细胞的闭合来增强水稻的抗旱性[4]，在小麦植株中表达SNAC1基因增加了小麦对ABA的敏感性，并提高了转基因小麦对干旱和盐碱化的耐受性[15]。

三七(Panaxnotoginseng(Burk) F.H. Chen)是我国传统中药材的一颗璀璨明珠，有“南国神草”、“参中之王”等美称。三七主要分布在云南、广西等地，尤其云南省文山州，主要化学成分有皂苷、多糖、氨基酸和挥发油，具有止血、活血、补血、抗肿瘤、降血糖、调节免疫和抗炎等作用。三七药材的市场需求量逐年上升，然而三七的生长周期长，三年生三七才能入药，三七喜温湿环境，生长过程中极易滋生病虫害，尤其是根腐病、黑斑病等几种真菌病害[16]。揭示三七的抗病机制，培育三七抗病品种，对保证三七种植业及相关产业的可持续发展具有重要意义。外源茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)能明显诱导三七对根腐病菌茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)的抗性，从MeJA预处理三七受茄腐镰刀菌侵染过程的转录组序列中发现了一个差异表达的Unigene编码NAC转录因子。为了揭示MeJA对三七抗病性调控的分子机制，本研究对一个NAC转录因子基因的全长cDNA进行了克隆和表达特性分析。

1 材料和方法

1.1 试验材料

植物材料为一年生三七幼苗，种于昆明理工大学的遮阴大棚中。试验所用茄腐镰刀菌以及人参链格孢(Alternariapanax)菌株由昆明理工大学国家中医药管理局三七资源可持续利用重点实验室从三七根腐病及黑斑病病株中分离、鉴定并保存。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 用剪刀对正常生长的一年生三七根部进行受伤处理，然后用MeJA (100 μmol/L)和无菌水(对照) 蘸根处理三七30 min，24 h后用200 mL茄腐镰刀菌分生孢子悬液(2×106个孢子/mL) 蘸根接种三七30 min，最后收集接种后4，12，24，48，72 h的三七根；一年生三七叶片受伤处理后接种人参链格孢菌丝，采集接种后2，12，24，48，72，96 h的三七叶片；分别用200 mL茉莉酸甲酯(100 μmol/L)、水杨酸(Salicylic acid，SA，200 μmol/L)、H2O2(1 mmol/L)以及乙烯利(Ethephon，ETH，1 mmol/L)溶液蘸根处理三七30 min，收集处理后4，12，24，48，72 h的三七根。所有样品先经液氮速冻，然后保存于-80 ℃备用。

1.2.2 RNA提取、mRNA分离及RACE (Rapid-amplification of cDNA ends) 用TRIGene总RNA提取试剂盒(GenStar Biosolutions)提取上述各样品中的总RNA。分别从各RNA样品中取等量混匀，然后按照张南南等[17]的方法分离mRNA，并采用SMARTRACE cDNA Amplification Kit (Clontech，USA)分别合成5′-RACE和3′-RACE 的cDNA模板。依据MeJA预处理三七受茄腐镰刀菌侵染过程转录组测序产生的编码NAC转录因子的Unigene序列，设计并合成基因特异引物。5′-RACE及3′-RACE特异引物序列分别为5′-CATCGTCGTAGTTGTGCTCGTAAACTCG-3′和 5′-TAGATGGTAAAGCTATGGCAGAAGGCAA-3′。扩增DNA条带经TA克隆后转化至大肠杆菌中，并挑选单克隆进行测序。

1.2.3 全长ORF的克隆以及生物信息学分析 5′-RACE扩增序列、3′-RACE扩增序列和三七NAC转录因子Unigene序列进行拼接，然后查找拼接序列中的最大开放阅读框(Open reading frame，ORF)。根据所拼接的cDNA序列设计扩增全长ORF的特异引物，再次进行PCR扩增，然后将扩增产物经T-A克隆后测序。扩增ORF的特异引物序列为5′-TTAATTAATCATGGGGGATAATAAT-3′和 5′-TATTGATGGGTTACACTTTTGTGAT-3′。接着对克隆所得 cDNA序列及编码的蛋白质序列进行生物信息学分析，具体方法见参考文献[18]。

1.2.4 Quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) 本研究采用qRT-PCR分析三七PnNAC1的转录水平。三七NAC转录因子基因的特异引物为5′-GTTGTGCTCGTAAACTCGACAGAC-3′和5′-ATATAGGCTTTGGCATGGTACTGG-3′。内参基因选择、qRT-PCR反应体系、程序以及相对表达水平的计算等参照陈瑞等[19]的qPCR方法进行。

2 结果与分析

2.1 三七PnNAC1全长cDNA的克隆

根据前期研究中三七转录组测序产生的编码NAC转录因子的EST序列，通过快速扩增cDNA末端技术扩增获得该EST的全长cDNA序列。RACE的结果见图1，序列测定结果显示NAC转录因子基因的5′-RACE产物长511 bp，3′-RACE产物长为633 bp。经过序列拼接获得NAC转录因子基因的全长cDNA序列长为815 bp，其中包含一个长度为576 bp的ORF、24 bp 5′-UTR (Untranslated region)以及215 bp 3′-UTR。ORF编码的蛋白质由191个氨基酸残基组成。根据拼接的全长cDNA序列，设计并合成特异性引物，成功扩增出了576 bp的全长ORF (图1)。后续序列分析结果表明该基因编码NAC蛋白，因此将该基因命名为PnNAC1 (GenBank登录号KX530029)。

M.DL2000标记；1.5′-RACE扩增结果；2.3′-RACE扩增结果；3.PnNAC1基因全长ORF的扩增结果。M. DL2000 Marker；1.Amplification result of 5′RACE；2.Amplification result of 3′RACE；3.Amplification result of ORF of PnNAC1.

2.2 序列分析、多重序列比对及进化树构建

BlastN分析结果显示，三七PnNAC1的第25-405位核苷酸序列与马铃薯(Solanumtuberosum)StNAC25 (XM015310658.1)的第250-627位核苷酸序列的相似性为80%。PnNAC1 ORF编码的蛋白质序列与芝麻(Sesamumindicum) SiNAC25 (XP_011092697.1)、可可(Theobromacacao) TcNAC (XP007043034.1)和StNAC25 (XP_015166144.1)的同源性较高，分别为75%，74%和74%。PnNAC1与StNAC25、烟草(Nicotianatomentosiformis) NtNAC25 (XP_009622295.1)、大豆(Glycinemax) GmNAC56(XP_003531559.1)的多重序列比对见图2。PnNAC1编码的蛋白质序列与其他3种植物的NAC转录因子高度相似，其中一些碱性氨基酸(R、K、H)和酸性氨基酸(D、E)残基高度保守。在几个NAC转录因子的C端分布较多的酸性氨基酸，碱性氨基酸则主要集中于N端。

使用MEGA6软件对11个NACs以及PnNAC1蛋白构建系统进化树。如图3所示，所选NAC转录因子聚类为两大支，Group Ⅰ和Group Ⅱ。PnNAC1与StNAC25、NtNAC25、GmNAC56、LOC Os04g35660.1和LOC Os02g34970.1属于Group Ⅰ，包括AT2G02450.1在内的另外6个NAC转录因子属于Group Ⅱ。Group Ⅰ又分为两小支，PnNAC1与StNAC25、NtNAC25、GmNAC5位于同一小支，LOC Os04g35660.1和LOC Os02g34970.1聚为另一小支，可见PnNAC1与StNAC25和NtNAC25具有更高的同源性。

黑色倒三角标识的是保守的酸性氨基酸；星号标识的是保守的碱性氨基酸；黑色下划线是预测的可能的DNA结合结构域。The conserved amino acid acid residues were labelled with black triangle；The conserved basic amino acid residues were labelled with asterisk；The putative DNA binding domain was underlined.

图3 PnNAC1与一些植物NACs的进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequence of PnNAC1 and some plant NACs

2.3PnNAC1编码蛋白质的理化性质及信号肽预测

利用ProtParam在线工具对PnNAC1的理化性质进行预测，结果显示PnNAC1的分子量约为22.13 kDa，等电点约为5.08。PnNAC1蛋白由191个氨基酸残基组成，富含Asp (19，9.9%)、Leu ( 16，8.4%)、Ser (16，8.4%)、Gly (14，7.3%)，此外，有29个氨基酸残基(Asp+Glu)带负电，21个氨基酸残基(Arg+Lys)带正电。PnNAC1蛋白在酵母和大肠杆菌中的半衰期分别大于20 h和10 h。SignalP 4.1分析结果表明PnNAC1中不存在信号肽。此外，PredictProtein分析结果显示该蛋白在植物细胞中定位于细胞核中，PnNAC1编码的蛋白质可能为核内蛋白。

2.4PnNAC1编码蛋白质的二级结构及三维结构预测

根据PredictProtein分析结果，PnNAC1蛋白结构中含有α-螺旋(H)、β-折叠(E)以及无规则卷曲(L)这3种二级结构，且它们的百分比分别为5.24%，21.99%和72.77%。蛋白质功能在很大程度上取决于蛋白质的三级结构。PnNAC1与水稻SNAC1 (Stress-responsive NAC1，3ULX)的一级结构相似，以水稻SNAC1为模板预测PnNAC1的三级结构。PnNAC1的三维结构二聚体模型如图4所示，主要特征为几个螺旋环绕一个由反向平行β-折叠组成的桶状结构。

2.5PnNAC1的表达特性分析

MeJA预处理明显增强了PnNAC1在三七根中的转录水平，接种茄腐镰刀菌后PnNAC1的表达量继续上升，4 h表达量最高，约为无菌水预处理对照的28倍，4 h后PnNAC1的转录水平明显下降。对照(无菌水预处理三七)接种茄腐镰刀菌后PnNAC1的表达量迅速上升，与接种前相比，4 h转录水平增加了16倍，之后表达量开始降低(图5)。人参链格孢是三七黑斑病的致病菌，人参链格孢接种三七叶片后96 h内，PnNAC1的表达水平不同程度地受到抑制(图5)。

图4 PnNAC1二聚体的三维结构模型Fig.4 The putative 3D structure of dimer of PnNAC1

分别用4种信号分子MeJA、ETH、H2O2、SA处理三七均会迅速诱导三七根中PnNAC1的转录水平，只是PnNAC1受这4种信号分子的诱导程度不同(图6)。MeJA处理三七后，PnNAC1的转录水平升高，与对照相比处理后24 h转录水平增加了14倍，之后表达量持续下降，至72 h，其表达量仍高于对照。ETH处理三七后的4 h时，PnNAC1的表达量达到最高，约为处理前的4倍，随后表达量开始下降，在12～48 h又开始上升，48 h以后表达量下降到处理前的3倍。H2O2处理三七后24 h内，PnNAC1表达量持续上升，在24 h时达到最高，约为处理前的7.5倍，然后其表达量又开始持续下降，到72 h时的表达量只到处理前的1.5倍左右。三七根部受SA处理后4 h，PnNAC1的表达量达到最高，约为处理前的5倍，随后表达量下降。综上所述，PnNAC1在转录水平响应茄腐镰刀菌、人参链格孢的侵染以及外源MeJA、ETH、H2O2、SA处理，在三七应对几种真菌病害的防御过程中PnNAC1可能起重要作用。

图5 茄腐镰刀菌和人参链格孢侵染过程PnNAC1的相对转录水平Fig.5 The relative transcription levels of PnNAC1 during F.solani and A. panax infection

图6 茉莉酸甲酯、乙烯利、过氧化氢和水杨酸处理后PnNAC1的相对转录水平Fig.6 The relative transcription of PnNAC1 after treatment by MeJA，ETH，H2O2 and SA

3 讨论

三七是我国特有的名贵中药材，随着三七原药材的需求量和种植面积逐年上涨，三七栽培过程中连作障碍和病虫危害等问题也日益受到关注。三七需在遮阴网下栽培，喜阴湿环境，病害多发，尤其是根腐病和黑斑病，严重影响了三七药材的产量和品质。本研究从三七中分离了一个参与根腐病和黑斑病防卫反应的NAC转录因子基因，PnNAC1。PnNAC1的全长cDNA序列为815 bp，编码一个由191个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量约为22.13 kDa，等电点约为5.08。进化树分析表明PnNAC1编码的蛋白质属于Group Ⅰ。NAC是植物中一类重要的转录因子，其N端相对保守，而C端的氨基酸残基高度多变[20]。PnNAC1与几个来自其他植物的NAC转录因子的序列比对结果表明，C端有2个部位高度可变，一个是丝氨酸(S)富含区，另一个是天冬氨酸(D)富含区。

NAC转录因子的表达受多种不同环境因素及植物自身发育时期的诱导，在不同植物不同时期以及不同组织中表达程度存在差异。拟南芥中NAC1在根、茎、叶中表达水平各不相同，根中表达水平最高，在茎和叶中表达水平相对较低[9]。SbNAC0584参与了高粱(Sorghumvulgare)的整个生长发育过程，在各个组织(根系、气生根、叶片、穗、茎、旗叶)中均有表达，但SbNAC0584在高粱气生根和旗叶中的表达量相对较高，其次是在根中，而在高粱茎和穗中的表达量相对较低[21]。拟南芥中，ANAC019和ANAC055基因能够激活JA诱导基因LOX2 (Lipoxygenase2)和VSP1 (Vegetativestorageprotein1)的转录，从而提高植株抗病能力[22]。致病疫霉(Phytophthorainfestans)侵染马铃薯后，显著诱导了StNAC2的表达[23]。水稻接种稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)后，ONAC122和ONAC131表达受诱导[24]。水稻OsNAC19的表达响应外源MeJA、ABA和ETH的诱导，且更易于被MeJA所诱导[25]。本研究qRT-PCR结果显示，茉莉酸甲酯预处理三七根部大幅提高了PnNAC1在根中的转录水平，接种茄腐镰刀菌后，PnNAC1的表达进一步上升，在接种后4 h转录水平达最大值；无菌水预处理的三七中，PnNAC1也快速响应茄腐镰刀菌的侵染，但表达水平明显低于茉莉酸甲酯预处理的样品。而接种人参链格孢后PnNAC1在叶片的表达量受抑制。茉莉酸甲酯、乙烯利、水杨酸和过氧化氢4种信号分子处理三七根部均明显诱导PnNAC1的转录水平，暗示PnNAC1可能通过这些信号通路介导三七对茄腐镰刀菌、人参链格孢等生物胁迫的防卫机制。

NACs是一类多功能蛋白，不仅调节植物的生长发育，还参与植物的自身免疫过程。上述结果表明，在三七应对几种真菌病害的防卫反应中PnNAC1可能起重要作用，因此有必要对其功能及生物学活性进行深入研究。下一步我们将验证PnNAC1的反式激活能力，并验证PnNAC1的生物学功能。

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Cloning and Expression Analysis of a NAC Transcription Factor GenePnNAC1 fromPanaxnotoginseng

WANG Guodong，LI Jinjing，BAI Zhiwei，GUAN Ruipan，YANG Ye，QU Yuan，CUI Xiuming，LIU Diqiu

(Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China)

To reveal the regulatory mechanism of defense response inPanaxnotoginseng(Burk) FH Chen against diseases，a NAC transcription factor gene was cloned fromP.notoginseng，and its expression pattern was analyzed in the present study. One year oldP.notoginsengseedlings were used as materials. According to an Unigene fromP.notoginsengtranscriptome which encoded a NAC transcription factor，the gene-specific primers were designed. Using the rapid amplification of cDNA end technology，a new NAC transcription factor gene ofP.notoginsengwas obtained which was namedPnNAC1. The cDNA sequence ofPnNAC1 was 815 bp in length and contained an intact open reading frame (ORF) of 576 bp，a 24 bp 5′-untranslated region (UTR)，and a 215 bp 3′-UTR. The ORF ofPnNAC1 encoded a putative protein with 191 amino acid residues which had a conserved NAC domain. Real-time PCR results indicated that pre-treatment with methyl jasmonate to roots ofP.notoginsengseedlings increased the transcription level ofPnNAC1 in roots，then the transcription level ofPnNAC1 was further risen after inoculation withFusariumsolani，and its expression level was maximal at 4 h post inoculation withF.solani. For the control (pretreatment with sterile water)，PnNAC1 also rapidly responded to infection ofF.solani，but its expression level was evidently lower than that in samples which were pre-treated with methyl jasmonate. Moreover，the expression ofPnNAC1 was inhibited in the leaves after inoculation withAlternariapanax. Furthermore，the transcription level ofPnNAC1 was induced by treatment with four kinds of signaling molecules including methyl jasmonate，ethylene，salicylic acid，and hydrogen peroxid. The above results suggest thatPnNAC1 responds to several stress-related signaling molecules and is involved in the defense response ofP.notoginsengagainst the infection ofF.solaniandA.panax.

Panaxnotoginseng；NAC transcription factor；Fusariumsolani；Alternariapanax；Defense response

2017-07-06

国家自然科学基金项目(81560610)；云南省应用基础研究计划项目(2014FA003)

王国东(1993-)，男，云南普洱人，主要从事生物工程研究。

刘迪秋(1979-)，女，湖北建始人，教授，博士，主要从事植物抗病基因工程研究。

S567.03;Q78

A

1000-7091(2017)04-0091-07

10.7668/hbnxb.2017.04.015