猪流行性腹泻病毒山西分离株ORF3基因序列分析

刘文俊，王娟萍，姚敬明，吴 忻，孟 帆，韩一超，樊振华，薛翼鹏，米瑞娟，李红丽，赵 岳

(山西省农业科学院 畜牧兽医研究所，山西 太原 030032)

猪流行性腹泻病毒山西分离株ORF3基因序列分析

刘文俊，王娟萍，姚敬明，吴 忻，孟 帆，韩一超，樊振华，薛翼鹏，米瑞娟，李红丽，赵 岳

(山西省农业科学院 畜牧兽医研究所，山西 太原 030032)

为了研究山西地区猪流行性腹泻病毒ORF3基因的遗传变异情况，2014-2015年从山西地区11个地市收集的PEDV阳性病料中扩增到4株PEDV 的ORF3基因，并进行序列比对及遗传分析。序列分析结果表明，4株PEDV 山西分离毒株的ORF3基因与CV777毒株相比，无核苷酸插入和缺失，有部分核苷酸及氨基酸发生变异；4株PEDV 山西分离毒株的ORF3基因之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.6%～100.0%和98.7%～99.6%，与CV777、疫苗株CV777 truncated和attenuated DR13核苷酸同源性分别为96.6%～97.0%，90.6%，97.6%～98.1%，氨基酸同源性分别为95.1%～96.0%，88.0%，97.1%～98.1%。遗传进化分析结果显示，4株PEDV 山西分离毒株与12株2010-2015年我国各地方分离的毒株和2009年分离的CH/JL/09毒株亲缘关系较近；与CV777、LZC、Brl/87和2个疫苗株(CV777truncated和attenuated DR13)亲缘关系较远。

猪流行性腹泻；山西分离株；ORF3基因；序列分析

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种急性、高度传染性肠道传染病，临床上以呕吐、水样腹泻和脱水死亡为特征[1-2]。1978年比利时和英国首次报道该病[3-4]，宣化等[5]在1984年研究证实，该病在我国存在。猪流行性腹泻病毒是冠状病毒科、冠状病毒属的成员，为有囊膜单股正链RNA病毒，基因组全长约28 kb，包括5′端非编码区、3′端非编码区以及至少7个开放阅读框(ORF1a、ORF1b、ORF2～ORF6)[6-7]。ORF3基因与病毒毒力有关[8-10]，当ORF3表达被抑制时，PEDV对细胞侵袭能力下降[11]。PEDV弱毒疫苗株的ORF3基因有49～51个核苷酸的缺失。因此，可以根据ORF3基因的差别来区别鉴定野毒毒株和疫苗毒株[12-15]。

本研究通过RT-PCR方法对2014-2015年采集自山西省11个地市的PEDV阳性病料的ORF3基因进行测序和进化分析，旨在了解山西地区PEDVORF3基因的遗传变异情况，为山西地区的PED防控提供理论依据和参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料 于2014-2015年从山西省太原、晋中、吕梁等11个地市规模化猪场采集疑似猪流行性腹泻病料。

1.1.2 病料的处理 将采集的小肠及肠内容剪碎后研磨，加入PBS缓冲液匀浆后，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，收集上清液，-80 ℃保存备用。

1.1.3 主要试剂 RNAiso Plus、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Premix TaqTM、DNA Marker DL2000、pMD18-T Vector购自宝生物(大连)工程有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；E.coliDH5α菌株购自天根生物科技(北京)有限公司；乙醇、异丙醇、氯仿等试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank中收录的PEDV CV777ORF3基因保守区设计了扩增ORF3基因全序列的引物，扩增产物片段预期长度为675 bp。引物序列如下：ORF3-F：5′-ATGTTTCTTGGACTTTTTCAATACA-3′，ORF3-R：5′-TCATTCACTAATTGTAGCATACTCGTC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 病毒总RNA的提取 按RNAiso Plus试剂盒说明书操作，从阳性病料中提取病毒基因组RNA，用适量的DEPC水溶解，-20 ℃保存备用。

1.2.3ORF3基因的扩增、克隆和测序 以提取的RNA为模板制备cDNA，参照PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行操作。在PCR管中依次加入RNase free H2O 7 μL，RNA 1 μL，dNTP 1 μL，下游引物1 μL；混匀后，65 ℃保温5 min后，冰上迅速冷却；在上述的PCR管加入5×PrimeScript Ⅱ Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，PrimeScript Ⅱ RTase 1 μL，RNase free dH2O 4.5 μL，缓慢混匀，42 ℃ 60 min，95 ℃保温5 min，冰上冷却。PCR反应体系：Premix Taq 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，灭菌蒸馏水21 μL，混匀后进行扩增。扩增反应条件：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；再72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。将PCR产物纯化后与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，经鉴定后将阳性菌液送上海生工生物有限公司进行测序。1.2.4 序列分析 对所获得的4株PEDV 的ORF3基因序列用DNAStar软件与GenBank中收录的12株国内外PEDV的ORF3基因进行同源性分析，并构建进化树。

2 结果与分析

2.1 PEDVORF3基因的扩增结果

从阳性病料中提取 RNA，用引物ORF3-F和ORF3-R进行RT-PCR扩增，分别获得与预期片段大小相符的特异片段，大小约为675 bp，结果如图1所示。

2.2ORF3基因序列变化

4株PEDV山西分离株ORF3基因全长均为675 bp，无核苷酸插入和缺失；与CV777ORF3基因相比，其中3株PEDV山西分离株ORF3基因有21个相同的核苷酸突变，分别为62，162，360，393位核苷酸T→C，54，60，235，301位核苷酸G→A，63，237，243，264，274，369，439，450位核苷酸C→T，238，546位核苷酸T→G，438位核苷酸T→A，497位核苷酸A→G，631位核苷酸T→A；另外，CH_SXCH11_2015株的第616位核苷酸A→T，第630位核苷酸A→C。4株PEDV山西分离株ORF3基因推导的氨基酸序列与CV777相比，相同核苷酸突变的有第21位氨基酸V→A，第54，79位V→I，第80位F→V，第92位L→F，第101位A→T，第165位N→S，第182位H→Q；另外，CH_SXCH11_2015株的第206位氨基酸I→F，第211位F→I。4株PEDV山西分离株ORF3基因与attenuated DR13相比，在244-245位核苷酸间多了51个核苷酸(图2)，推导的氨基酸序列比attenuated DR13在81-82位氨基酸间多了17个氨基酸(图3)。

图2 PEDV ORF3基因核苷酸序列分析Fig.2 Nucleotide sequence analysis of the ORF3 gene of PEDV

图3 PEDV ORF3基因氨基酸序列分析Fig.3 Amino acid sequence analysis of the ORF3 gene of PEDV

2.3ORF3基因同源性分析

4株山西分离毒株ORF3基因之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6%～100.0%和98.7%～99.6%。与CV777、疫苗株CV777 truncated和attenuated DR13核苷酸同源性分别为96.6%～97.0%，90.6%，97.6%～98.1%，氨基酸同源性分别为95.1%～96.0%，88.0%，97.1%～98.1%。

2.4ORF3基因的遗传进化分析

利用DNAStar对获得的ORF3基因与GenBank中收录的PEDV的ORF3基因序列比对，并构建进化树，结果如图4所示。由图4可知，PEDV毒株可分为3大群：G1包括CV777、LZC和Brl/87；CV777 truncated和attenuated DR13属于G2；G3又分为3个小群，其中，G3-1群包括DR13、Chinju99和CH/S；3个韩国株(CPF299、PFF188、PFF285)和3个中国株(CH/FJND-3/2011、CH/ZKXH/11、CH/SHH/06)组成G3-2；G3-3包括本研究中得到的4株山西分离毒株、12株2010-2015年我国各地方分离的毒株和2009年分离的CH/JL/09毒株。遗传进化分析结果表明，4株山西分离毒株与12株2010-2015年我国各地方分离的毒株、2009年分离的CH/JL/09毒株亲缘关系较近，与CV777、LZC、Brl/87和2个疫苗株(CV777 truncated和attenuated DR13)亲缘关系较远。

图4 PEDV ORF3基因的进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the ORF3 gene of PEDV

3 讨论

2010年10月，我国南方暴发PED[16]，给养猪业造成巨大损失。2014年冬季至2015年春季，山西省部分规模化猪场哺乳仔猪暴发腹泻病，山西省农业科学院畜牧兽医研究所动物基础医学研究室对山西11个地市仔猪腹泻进行了流行病学调研，结果显示，PEDV阳性率为73.26%，TGEV阳性率为7.36%。表明山西省猪群发生的腹泻，主要是由猪流行性腹泻病毒所引起。

4株PEDV山西分离毒株的ORF3基因与GenBank中收录的PEDV进行对比分析，4株山西分离毒株与12株2010-2015年我国各地方分离的毒株和2009年分离的CH/JL/09毒株亲缘关系较近，与CV777以及2个疫苗株(CV777truncated和attenuatedDR13)亲缘关系较远，同源性较低。Park等[12]研究发现，经过细胞适应的毒株比亲本毒株和野生毒株的ORF3基因有51个核苷酸的缺失。4株山西分离毒株与attenuated DR13相比，在244-245位核苷酸插入51个核苷酸，表明4个山西分离毒株为野生毒株。4个山西分离毒株与CV777ORF3基因相比，无核苷酸插入和缺失，有多处核苷酸发生变异，与董彦鹏等[17]、顾超逸等[18]、黄冬妮等[19]、邓小红等[20]分离的毒株既有相同的变异位点，又有不同的变异位点，可能是由于受到各个地方当地的环境、免疫压力或药物等因素的影响产生不同变异，变异的多样性，增加了PED的防控难度。因此，各地应及时收集分析当地的PEDV变异情况，为PED的防控提供理论参考。

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Sequence Analysis of theORF3 Gene ofPorcineepidemicdiarrheavirusin Shanxi Provine

LIU Wenjun，WANG Juanping,YAO Jingming，WU Xin，MENG Fan，HAN Yichao，FAN Zhenhua， XUE Yipeng，MI Ruijuan，LI Hongli，ZHAO Yue

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030032，China)

To investigate the variation theORF3 gene ofPorcineepidemicdiarrheavirus，4 PEDV field strains were cloned and sequenced which were isolated from 11 cities of Shanxi from 2014 to 2015. These strains were analyzed and compared with the other published PEDV strains. Sequence analysis ofORF3 gene revealed that the 4 PEDV field strains had several specific nucleotides and amino acids which were different from CV777. The nucleotide and amino acid homologies were 99.6% to 100.0% and 98.7% to 99.6% among 4 PEDV field strains. Compared with CV777，CV777 truncated，attenuated DR13，the nucleotide homologies were 96.6% to 97.0%，90.6%，97.6% to 98.1%,and amino acid homologies were 95.1% to 96.0%，88.0%，97.1% to 98.1%，respectively. Phylogenetic analysis showed that the 4 PEDV field strains were genetically close to other prevalent strains from other parts of China from 2010 to 2015，CH/JL/09 isolated in 2009;However,there were genetically different from CV777，LZC，Brl/87，CV777 truncated，attenuated DR13.

Porcine epidemic diarrhea；Shanxi strains；ORF3 gene；Sequence analysis

2017-07-06

山西省科技攻关项目(20140311020-2-A；20150311018-3)

刘文俊(1979-)，男，山西河津人，助理研究员，硕士，主要从事动物疫病分子生物学检测与诊断技术研究。

王娟萍(1958-)，女，山西太原人，研究员，主要从事畜禽传染病研究。

S852.65；S432.4

A

1000-7091(2017)04-0103-04

10.7668/hbnxb.2017.04.017