周口地区大豆根瘤菌的分离与分子鉴定

张 怡，张 超，杨艳杰，于 洁，季慧佳，陈 红，刘文婷，李晓博，李 蒙，李成伟,3

(1.周口师范学院，植物遗传与分子育种重点实验室，河南 周口 466001；2.杭州师范大学 医学院，浙江 杭州 310000；3.河南科技学院，河南 新乡 453007)

周口地区大豆根瘤菌的分离与分子鉴定

张 怡1，张 超2，杨艳杰1，于 洁1，季慧佳1，陈 红1，刘文婷1，李晓博1，李 蒙1，李成伟1,3

(1.周口师范学院，植物遗传与分子育种重点实验室，河南 周口 466001；2.杭州师范大学 医学院，浙江 杭州 310000；3.河南科技学院，河南 新乡 453007)

为了进一步研究发掘新的根瘤菌资源库，采用平板划线分离的方法从大豆根瘤中分离纯化根瘤菌，并且将获得的菌株进行盆栽回接试验，结果表明，分离获得的大豆根瘤菌菌株均可在大豆和苜蓿上结瘤，具有结瘤能力。根据已公布大豆根瘤菌共同结瘤基因nodA、nifH、16SrDNA保守区域设计引物，并且对nodA、nifH、16SrDNA序列进行扩增分析和系统发育分析，由此鉴定分离的根瘤菌为费式中华根瘤菌，从而在分子水平上实现了对大豆根瘤菌的快速鉴定。

大豆；根瘤菌；回接鉴定；费式中华根瘤菌

根瘤菌需要特定的基因才能与豆科植物形成有效的共生。包括编码产生nod因子的nod基因，该基因能刺激植物产生共生节结和固氮基因，从而产生固氮酶。nod基因是根瘤菌中一类独特的基因[7]，包括nodA、nodB、nodC，这些基因是根瘤形成的关键，参与了共生早期阶段，其中任何一个基因的突变，都会使菌株失去结瘤的能力[8-9]。相比之下，发现nif基因在许多细菌中均存在。在大豆固氮菌中，研究最多的固氮基因是nifH和nifD[10-11]。在固氮生物的进化历程中，其编码固氮酶铁蛋白成分的基因nifH核苷酸序列具有高度良好的保守性，它常常用来证明固氮菌的存在[12]。

在细菌基因组中，编码16S rRNA的rDNA基因具有较强的保守性[13]，片段大小适宜检测，所以一直成为细菌分子鉴定的标准序列，但是由于16SrRNA序列的高度保守性，使它在种属以下的分类水平具有很大的不稳定性；而亲缘关系在种属以上分类水平的菌株具有非常良好的分辨率[14]。所以，16SrDNA全序列的分析在分类学的地位上具有非常明显优势，可广泛用于细菌和真菌的分类鉴定。

本研究对周口师范学院试验田中的大豆进行根瘤菌的分离纯化和回接试验，并且根据已经公布的大豆根瘤菌共同结瘤基因nodA、nifH、16SrDNA保守区域设计引物，从分子水平进一步鉴定分离的根瘤菌，并对nodA、nifH、16SrDNA序列构建系统发育树分析，以期对周口的大豆根瘤菌资源的分类和研究提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 周口师范学院试验田大豆根瘤菌株。

1.1.2 培养基与试剂 YMA固体培养基：酵母粉3 g，甘露醇10 g，NaCl 10 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，K2HPO40.25 g，pH值 7.0，琼脂粉15～18 g。

根瘤菌提取试剂(缓冲液GUTC)：称取23.26 g的异硫氰酸胍和0.078 g反式环己二胺四乙酸，溶解于40 mmol/L Tris-HCl (pH值 8.0)缓冲液20 mL，待试剂完全溶解后，再用相同浓度的Tris-HCl定容为50 mL，即最终浓度为4 mol/L的GUTC缓冲液。

洗涤缓冲液：2 mmol/L EDTA (pH值 8.0)，40 mmol/L Tris-HCl (pH值8.0)，无水乙醇600 mL，800 mmol/L NaCl，定容至1 L，存放于锥形瓶中。

硅藻土吸附缓冲液：称取5 g的硅藻土，用1×TE缓冲液洗涤硅藻土2～3次，最后按照1∶1的量加入1×TE缓冲液，即为硅藻土吸附缓冲液。

1.2 试验方法

1.2.1 根瘤菌的分离和纯化 大豆根瘤菌的分离和纯化参考Peter等[15]方法，具体如下：在超净台中，选取新鲜饱满的根瘤，用剪刀将其剪下，先将根瘤放在无菌水中浸泡5～6 min，清除表面的杂质，用75%无水乙醇表面消毒3～5 min后，再用3.5%的NaClO消毒8 min，之后用无菌水将其冲洗9～10次，用消过毒的刀子将单个根瘤切开后，再用镊子夹住根瘤在刚果红培养基上划线，在28 ℃恒温培养箱中培养2～3 d后就会有清晰的菌落长出，并且根据菌体的形态、大小、透明度、黏稠度、颜色、光泽等特征，对分离得到的根瘤菌单克隆进行3～4次的划线分离，直到长出清晰的单克隆。

1.2.2 根瘤菌的抗性鉴定 在含有100，200 μg/L抗生素(利福平、羧苄青霉素、头孢菌素)的YMA固体培养基上，挑取单菌落进行平板划线，对照采用无抗性的YMA固体培养基，放置于28 ℃恒温培养箱中培养2～3 d直到对照有清楚的单菌落出现。1.2.3 根瘤菌的回接诱导根瘤 将灭过菌的营养土装入塑料杯中，供试大豆的根瘤菌为本研究所分离的菌株。首先将大豆种子用70%无水乙醇表面消毒3～4 min，苜蓿种子消毒1～2 min后，再用3.5% NaClO消毒大豆种子7～8 min，苜蓿种子4～6 min，然后用无菌水将其冲洗7～8次，待大豆和苜蓿的种子在无菌水中吸水膨胀后，倒出多余的水并保留一层水，在28 ℃培养箱培养至发芽后，播入装有营养土的塑料杯中。将植株放置于白天25～30 ℃、夜间13～20 ℃、每天12 h的光照培养室中培养观察。等到大豆和苜蓿植株长出真叶后再接种根瘤菌菌液。供试菌株经摇菌活化培养后，在塑料杯中接根瘤菌菌液7 d 3次，每次约10 mL，接种30 d后洗根观察结果。

1.2.4 根瘤菌总DNA提取 根瘤菌总DNA的提取方法参考陈强等[16]的试验方法。提取总的根瘤菌DNA经琼脂糖凝胶电泳检测后，质量较好的可作为模板进行PCR检测(图1)。

M.DL2000；1～3.根瘤菌DNA。M.DNA Ladder 2000；1-3.DNA of rhizobium.

1.2.5nodA、nifH、16SrDNA序列分析及系统发育分析 根据NCBI上公布的nodA、nifH、16SrDNA基因序列，Blast后在保守区设计3对特异性引物(表1)[13,17]，对根瘤菌的基因组进行PCR扩增，检测出目的基因。PCR反应的总体积为20 μL，其中模板1 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，TaqDNA聚合酶Mix 10 μL。反应程序：94 ℃，5 min预变性；94 ℃ 30 s变性，56 ℃ 45 s退火，72 ℃ 2 min延伸，35个循环；72 ℃ 10 min延伸，12 ℃保存。

PCR扩增产物切胶纯化后连接pEASY-T1 克隆载体，进行测序，将所测的序列用NCBI软件中Blast比对分析其同源性。并利用DNAMAN软件对同源性较高的序列进行系统发育分析及进化树的构建。

表1 根瘤菌分子鉴定中所使用的PCR引物Tab.1 PCR primers used in the identification of rhizobium

2 结果与分析

2.1 表型鉴定

通过稀释平板划线分离得到根瘤菌的表型发现，所得到的菌落其表面光滑、湿润，同时菌落呈圆形，稍有凸起，不透明，这些均符合根瘤菌的基本形态特征(图2)。

图2 大豆根瘤菌的平板划线分离Fig.2 Screening separation of soybean rhizobia on plate

2.2 根瘤菌的抗性分析

通过抗性鉴定表明，本研究所分离的根瘤菌具有羧苄青霉素、头孢菌素抗性，而基本不具有利福平抗性(图3)。

2.3 回接试验的结瘤情况

回接试验是鉴定根瘤菌的有效方法，采用盆栽接种大豆根瘤菌的方法，均能使大豆和苜蓿结瘤，且根系发达，结瘤数量较多(图4)，初步可证明分离的细菌为根瘤菌。

A.羧苄青霉素；B.头孢菌素；C.利福平；D.对照。A.Carbenicillin；B.Cephalosporin；C.Rifampicin；D.Control.

A.大豆；B.苜蓿。A.Soybean;B.Alfalfa.

2.4 根瘤菌的分子鉴定

提取总的根瘤菌DNA经琼脂糖凝胶电泳检测后，质量较好的可作为模板进行PCR检测。对根瘤菌的16SrDNA、nodA和nifH保守基因序列进行PCR扩增后，各个基因的目的片段都和已知基因片段大小相似，进一步对该片段进行胶回收后，连接pEASY-T1克隆载体进行测序，所扩增的片段分别和已知的16S rDNA、nodA和nifH基因序列高度同源(图5)。且各个基因序列均与费式中华根瘤菌的同源性达到98%以上，进一步鉴定该菌株为费式中华根瘤菌。

2.5nodA、nifH、16SrDNA的系统发育分析

根据上述16SrDNA、nodA和nifH保守基因序列的比对结果，从NCBI数据库中获得了多个同源性较高的序列，构建系统发育树，通过nifH、nodA、16SrDNA序列的系统发育分析后发现，nodA的进化树明显分为2支，nodA序列与德国的费式中华根瘤菌(CP003572.1)的亲缘关系在99%以上，聚集在一个分支上(图6)。nifH的进化树枝也分为2支，nifH序列与费氏中华根瘤菌菌株的nifH基因同源性在99%以上，并且聚集在同一个分支(图7)。而16SrDNA的序列也分为2支，但本研究所分离菌株的16SrDNA序列(KX371347)单独成为一支，而其他几个序列聚集在一个分支，且它们的同源性在98%以上(图8)，由此鉴定本研究所分离的大豆根瘤菌为费式中华根瘤菌。

M.DL2000, DNA Ladder 2000；1～3.nifH的PCR产物；4～6.nodA 的PCR产物；7～9.16S rDNA的PCR产物。M.DNA Ladder 2000；1-3.nifH，PCR product of nifH；4-6.nodA，PCR product of nodA；7-9.16S rDNA，PCR product of 16S rDNA.

图6 分离菌株nodA序列分析及系统发育树

图7 分离菌株nifH序列分析及系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of isolates and reference strains based upon aligned sequences of nifH gene

图8 分离菌株16S rDNA部分序列分析及系统发育树Fig.8 Phylogenetic tree of isolates and reference strains based upon aligned sequences of 16S rDNA gene

3 结论与讨论

大豆根瘤菌是一种活的微生物制剂能与豆科植物互利共生：豆科植物通过光合作用产生的有机物，一部分供给根瘤菌；根瘤菌则通过生物固氮产生的氨，并供给豆科植物[18-19]。根瘤菌是主要存在豆科植物根部和茎部的一种内生细菌，不仅能与宿主植物形成共生体系，还能促进植物的快速生长，提高其抗逆性、抗病虫害等能力[20]。大豆根瘤菌与苜蓿和大豆建立的共生体系，是农业大规模生产中氮源的充分有效补充，共生体系分子机制的研究可以大大促进根瘤菌在农业生产上的应用，在新型农业的推广中发挥着重要的作用。

本研究对根瘤菌菌株的16SrDNA、nodA和nifH保守基因进行序列扩增分析和系统发育分析的分子生物学方法，经过对比GenBank中同源性较高的序列并通过对根瘤菌的分子鉴定及进化树的构建，发现根瘤菌的nodA序列和德国的费式中华根瘤菌聚在同一个分支上，种间差异很小，保守性很强，与埃及、墨西哥、塞维利亚、中国(西北农林大学)和德国(日内瓦大学)的根瘤菌聚在一个大支上。nifH序列与费氏中华根瘤菌菌株的nifH基因同源性在99%以上，聚集在同一个分支上，与德国、巴西、中国(中国农业大学、四川农学院)的根瘤菌聚在一个大支上。但本研究分离的根瘤菌菌株的16SrDNA在进化树上却单独成为一支，且黑龙江的根瘤菌与美国的根瘤菌在同一分支，且同源性很高，但与中国农业大学的根瘤菌种间距离较远，由此推断，根瘤菌的进化并不与地域远近有直接的关系。

本试验通过对分离纯化的根瘤菌菌株通过表型鉴定和分子鉴定，并通过回接结瘤验证，最终鉴定为费式中华根瘤菌，本研究对周口的大豆根瘤菌进行系统的分离和鉴定，丰富了河南省大豆根瘤菌的资源，为进一步对其分子机制研究奠定了理论基础。

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Isolation and Molecular Identification of Soybean Rhizobium in Zhoukou

ZHANG Yi1，ZHANG Chao2，YANG Yanjie1，YU Jie1，JI Huijia1，CHEN Hong1，LIU Wenting1，LI Xiaobo1，LI Meng1，LI Chengwei1,3

(1.Key Laboratory of Plant Genetics and Molecular Breeding，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China；2. Medical College of Hangzhou Normal University，Hangzhou 310000，China；3. Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453007，China)

In order to explore new rhizobium resource，the method of separating and purifying the root nodule bacteria from soybean root nodules was studied，and a pot experiment was carried out. The results showed that the isolated rhizobium of soybean could form nodules in soybean and alfalfa. According to the published soybean rhizobium common node tumor genes ofnodA,nifH,16SrDNA，all the three genes were amplified. Phylogenetic analysis demonstrated that the strain isolated from Zhoukou was highly conserved withSinorhizabiumfrediiof Germany，which convinced that rhizobium strain wasS.fredii. The research provided the quick and accurate method for identification of soybean rhizobium at the molecular level.

Soybean；Rhizobium；Re-inoculation and identification；Sinorhizabiumfredii

2017-07-15

国家自然科学基金项目(31272168)；河南省教育厅科学技术研究重点项目(14A180038)；河南省国际科技合作项目(144300510072)；周口师范学院校本项目(ZKNUB215202)

张 怡(1985-)，女，河南洛阳人，讲师，硕士，主要从事植物与微生物互作研究。

李成伟(1972-)，男，河南商丘人，教授，博士，主要从事植物与病原体互作、抗性分子育种及生物反应器制药等研究。

S432.4

A

1000-7091(2017)04-0098-05

10.7668/hbnxb.2017.04.016