向日葵核心种质资源基础类群划分研究

郭树春，张艳芳，孙瑞芬，李素萍，于海峰，刘腊青，王洪波，安玉麟

(1.内蒙古大学 物理科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；3.和林格尔县黑老夭乡农技推广综合服务站，内蒙古 呼和浩特 011500；4.鄂尔多斯生态环境职业学院，内蒙古 鄂尔多斯 017010)

向日葵核心种质资源基础类群划分研究

郭树春1,2，张艳芳2，孙瑞芬2，李素萍2，于海峰2，刘腊青3，王洪波4，安玉麟2

(1.内蒙古大学 物理科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；3.和林格尔县黑老夭乡农技推广综合服务站，内蒙古 呼和浩特 011500；4.鄂尔多斯生态环境职业学院，内蒙古 鄂尔多斯 017010)

向日葵是一种重要的油料作物，同时也是一种潜在的能源植物，其核心种质资源基础类群的划分可为向日葵远缘杂交提供理论依据。采用形态学标记与RAPD标记相结合的方法，利用UPGMA聚类法对50份向日葵核心种质资源材料亲缘关系进行了深入研究。形态学标记法结果显示，50份供试种质资源可分为三大类群，其中第Ⅰ类群27份种质，第Ⅱ类群22份种质，第Ⅲ类群只包含1份种质，进一步研究表明，供试种质资源的种质地理分布以及用途与聚类结果关联性较强。同时，分子标记的UPGMA聚类结果也验证了上述结论；RAPD分子标记聚类法也将供试材料分为三大类群，其中第Ⅰ类群26份种质，第Ⅱ类群23份种质，第Ⅲ类群包含1份种质，形态学与RAPD聚类结果的吻合率为96.30%；形态学标记结果与RAPD标记分类结果可靠。

向日葵；形态学；RAPD；类群划分

向日葵(HelianthusannuusL.)是一种集观赏、药用、油用于一身的优良资源植物[1-2]，其具有耐盐碱、耐干旱、耐瘠薄、适应性强的特点，特别适合在我国西部干旱少雨地区栽培种植[3]。20世纪70年代法国人用向日葵雄性不育系三系配套技术育成杂交种[4-5]，我国20世纪80年代开始从国外引进向日葵杂交种。目前，远缘杂交在向日葵育种中占据重要地位，种质资源基础类群划分是实现远缘杂交的基础，因而很多学者开始运用分子标记技术对向日葵种植资源类群划分进行了深入研究[6-7]，从而揭示向日葵种质资源间的亲缘关系，寻找产量、抗性、品质与基因的对应关系，提高向日葵育种的准确性，并为育种材料的深入研究提供依据。

自从20世纪80年代向日葵杂交种在得到大面积推广、应用以来，我国乃至其他国家收集了丰富的向日葵种质资源，并提出了核心种质(Core collection)理念，其有效促进了种质资源利用与发掘重要基因的效率。目前，可利用已建立向日葵的核心种质为多元化向日葵育种打下良好基础，对选育高产、优质、抗逆向日葵新品种具有重要的现实意义。向日葵种质资源蕴藏产量基因、品质基因及抗性基因是现代多元化向日葵育种的物质基础，为了促进有利基因发掘及其在生产上有效利用，对其种质资源进行系统评价显得十分重要，也是向日葵研究的先决条件，可减少亲本选配的盲目性进而提高育种工作的预见性和准确性。运用传统手段与生物技术结合的方法辨识资源亲缘关系在常规育种中尤为常见，特别是形态学标记与分子标记技术结合的方法对向日葵核心种质资源类群划分已成为向日葵育种的应用典范，本研究采用了形态学标记与RAPD相结合的方法，运用聚类分析对50份向日葵种质材料的基础类群进行了划分研究，将50份核心向日葵种质资源材料分为4个基础类群，并对其与地理分布的关系做了进一步分析，该研究结果可直接指导向日葵育种，并为优良基因的挖掘提供有价值的信息。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验在内蒙古农牧业科学院完成，参试种质是内蒙古农牧业科学院从国内外收集的50份向日葵核心资源材料，包含：25份恢复系、10份不育系、15份自交系(表1)。

表1 50份参试向日葵材料Tab.1 50 sunflower germplasms in the study

1.2 试验方法

1.2.1 形态学标记分析 将50份材料3次重复种植，每份材料重复种60株，并保持各重复的培养条件(光照、温度、湿度等)相同，并分阶段对其不同性状进行调查统计，调查性状包括：出苗期、现蕾期、茎粗、株高、花盘的直径、形状、倾斜度，叶片的数量、大小、粒型、粒色、产量等。

1.2.2 RAPD分子标记分析 挑选饱满度、大小一致的各参试向日葵种子播种在营养钵中，播种深度2～3 cm，每钵播种10～12粒，设3个重复，每钵浇水50～100 mL，在光照培养箱中培养，每天定时浇水1～2次，保持营养钵表面土壤湿润为宜，出苗后保留每钵5～6株整齐一致的向日葵幼苗待用。

从每份制备好的材料中选择3～5个生长良好的向日葵幼苗，取幼嫩叶片提取DNA(提取方法参考Plant Genomic DNA Kit产品说明)。各样品DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后保存在-70 ℃超低温冰箱。RAPD反应体系优化结果：体系大小20 μL；2×Taq MasterMix 10 μL；引物(10 μmol/L)2 μL；植物总DNA(20 ng/μL)100 ng；ddH2O 3 μL[8-9]；PCR扩增程序(RAPD)：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，38 ℃退火90 s，72 ℃延伸70 s，40个循环；72 ℃ 10 min[10-11]。

本试验选用的RAPD引物共100条，经筛选得到19条特异性好的引物作为向日葵RAPD标记特异引物，序列信息见表2。

表2 筛选出的RAPD引物序列及扩增结果 Tab.2 The RAPD sequences and results of selected primers

1.3 数据统计分析

根据形态学性状调查的数据，采用SPSS软件，利用欧氏距离法对50份核心资源材料进行UPGMA聚类分析[12]。根据RAPD扩增结果，同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，本试验分别以DL1200和DL500为标准分子量标记，对照反应物在琼脂糖凝胶上的位置，按照相同迁移率位置上有扩增带记为1无带记为0的方法记录电泳谱带，并建立0、1矩阵，该过程由Quantity one软件完成[13]，本试验中3次重复都出现的条带记为1，否则记为0。

条带多态性计算方法：

相异性系数与聚类分析方法：相异系数与聚类分析均采用SPSS分析软件进行分析，以RAPD条带为基础建立的0，1矩阵计算Jaccard相异系数[14]，公式如下：Jij=a/(n-d)，a为i品种和j品种的多态性条带数之和，n为RAPD总带数，d为i和j品种都记为0的带数。然后用非加权配对算术平均聚类方法(UPGMA)对其进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 形态学标记分析结果

为研究参试向日葵种质资源在形态学上的亲缘关系，采用SPSS软件，利用12个性状的田间调查结果计算50份种质间的遗传距离。经计算50份种质的遗传距离为8.00～360.11，均值为123.13，可见参试种质在形态学性状上具有较广泛的变异，形态多样性较丰富。在种质间的遗传距离中，以种质17(T785)与24(T837)间的最大，为306.11；遗传距离最小的是种质3(T364)与2(T361)，为8.25。根据12个形态学性状计算种质间的遗传距离，对50份种质进行聚类分析，将供试种质分为三大类群(图1)。

图1 基于形态学性状的向日葵种质聚类图Fig.1 The dendrogram of sunflower germplasms on morphological characteristics

第Ⅰ类群(共27份材料、2个亚类)：

第一亚类(13份材料)包括种质1：T649；13：T702；16：T752；22：T824；12：T717；18：T764；7：T676；8：T682；48：T1295；14：T736；15：T740；17：T758；24：T837。

第二亚类(14份材料)包括种质2：T361；3：T364；6：T663；19：T794；25：T933；23：T827；4：T366；5：T660；20：T796；21：T810；9：T700；10：T707；11：T710；47：T1269。

第Ⅱ类群(共22份材料)：

第一亚类(11份材料)包含种质27：T22；29：T38；36：T590；35：T232；41：T2；39：T594；44：T11；33：T192；43：T8；38：T593；46：T18。

第二亚类(11份材料)包含种质28：T37；31：T42；30：T41；37：T592；49：T1484；32：T191；34：T231；42：T3；45：T16；50：赤葵2号；40：T595。

第Ⅲ类群只有种质26：T21。

结果表明，形态学聚类与参试种质的地理来源关系密切，第Ⅰ类群(27份种质资源材料)主要是来自国外的一些材料，其中第一类亚类(13份材料)包含：以色列的8份(12、13、14、15、16、17、18、24)，美国的3份(1、7、8)；第二亚类(14份材料)包括：以色列4份(9、10、11、23)，美国的6份材料(2、3、4、5、6、25)，其余6份为国内材料。第Ⅱ类群(22份材料)均为国内的材料。第Ⅲ类群(1份材料)：26为国内材料，详细信息见表3。

表3 形态学聚类向日葵种质地理来源分析Tab.3 Analysis of sunflower origin on morphological characteristics

2.2 RAPD分子标记分析结果

利用筛选出的19条引物对50份向日葵基因组DNA进行PCR扩增，19条引物共扩增出150条DNA条带，每个引物扩增的条带数在4～11条，平均每个引物产生7.42条，扩增出的DNA条带的大小在300～1 200 bp。进一步分析表明，在扩增的150条带中，多态性条带数为123条，占总条带的82.00%，表明试用材料的遗传多样性丰富，可作为杂交育种的核心资源库(图2)。

编号见种质名称表1；M.100 bp Ladder。See number of germplasm in Tab.1;M.100 bp Ladder.

为研究参试向日葵种质资源在分子水平的遗传关系，采用SPSS软件，利用19条RAPD引物计算了50份种质间的遗传距离。这些种质资源的遗传距离为0.812～0.241，均值为0.563，可见参试种质在分子水平上遗传差异较大，从而验证了各材料多态性研究结果。在种质间的遗传距离中，种质16(T752)与24(T837)间的遗传距离最大，为0.812；种质6(T663)和种质5(T660)遗传距离最小，为0.241。根据19条RAPD引物计算得到的种质间遗传距离，对50份种质进行聚类分析，供试种质可分为三大类群(图3)。

图3 RAPD标记遗传聚类图Fig.3 The dendrogram of sunflower germplasms on RAPD markers

RAPD聚类结果显示，第Ⅰ类包括26份种质资源材料：

第一亚类(3份材料)包含种质1：T649；22：T824；48：T1295。

第二亚类(23份材料)包含种质2：T361；3：T364；12：T717；13：T720；15：T740；16：T752；14：T736；9：T700；10：T707；47：T1269；6：T663；7：T676；18：T764；21：T810；8：T682；24：T837；19：T794；20：T796；25：T933；17：T758；23：T827；4：T366；5：T660。

第Ⅱ类(包括23份材料)：

第一亚类(19份材料)包含种质26：T21；28：T37；29：T38；30：T41；31：T42；32：T191；40：T595；37：T592；41：T2；50：赤葵2号；42：T3；45：T16；34：T231；35：T232；39：T594；27：T22；46：T18；33：T192；43：T8。

第二亚类(4份材料)包含种质36：T590；38：T593；44：T11；49：T1484。

第Ⅲ类(包括1份材料)包含种质11：T710。

RAPD聚类与参试种质的地理来源也密切相关，第I类群(共26份)主要是来自国外的一些材料，其中包含：美国的9份种质(1、2、3、4、5、6、7、8、25)，以色列的11份种质(9、10、12、13、14、15、16、17、18、23、24)，其余6份为国内种质；第Ⅱ类群(共23份)均为我们收集的国内的种质资源材料，第Ⅲ类群是以色列种质T710(表4)。

表4 RAPD聚类向日葵种质地理分布分析Tab.4 Analysis of sunflower origin on RAPD

2.3 形态标记结果与RAPD标记结果的比较分析

从聚类分析来看，形态学性状与RAPD标记的遗传关系基本一致。2种方法根据遗传距离分别把50份向日葵种质资源划分为三类，在第Ⅰ类群中只有11号种质是不同的，第Ⅱ类群全部相同。为进一步研究形态标记和RAPD标记之间的关系，综合考虑聚类图特点和适宜的分组数，本研究把2种方法的聚类结果划分为4组，将2种聚类结果进行比较时，首先选择吻合率最大的2个组进行比较，然后在剩余的组中再选择吻合率最大的比较，依此类推，从表5中可以看出，形态标记与RAPD标记吻合率达到90%以上，而且材料较多的前2组之间的吻合率达96.30%和95.65%，并且前两类的聚类结果和地理分布有密切的关系。

表5 形态标记和RAPD标记聚类结果比较Tab.5 The comparation between morphological characteristics and RAPD

3 讨论与结论

本研究采用了形态学标记与RAPD分子标记相结合的方法，运用聚类分析工具UPGMA对50份向日葵种质材料的基础类群进行了划分。采用形态标记方法对参试种质的12个形态学性状进行聚类，结果表明：50份种质的遗传距离为8.00～360.11，其可分为三大类群：第Ⅰ类群27份种质，第Ⅱ类群22份种质，第Ⅲ类群只包含1份种质，聚类结果与种质的地理分布有密切联系。利用RAPD技术，得到19条多态性高、重复性好的引物共扩增出150条特异带，其中有123条多态性条带，占82.00%，种质间遗传距离在0.812～0.241。UPGMA聚类结果显示，供试种质可分为三大类群：第I类群共有26份种质，第Ⅱ类群23份种质，第Ⅲ类群1份种质，且聚类结果也与地理分布有相关性。进一步研究发现形态学与RAPD吻合率高达96.30%，形态学标记与RAPD标记的聚类结果基本一致。

从上述结果可知，形态学方法虽然是一种最古老的类群划分方法，它简单、直观、容易获得，具有不可替代的作用，但是它的均一性和稳定性容易受到环境条件和发育时期的影响[15-16]。本研究利用形态学标记方法对50份核心向日葵资源材料进行基础类群划分，经计算50份种质的遗传距离在8.00～360.11，50份种质可分为三大类群。RAPD标记稳定性好，不受环境影响，缺点是难以区分杂合和纯合基因型，而且容易受到反应条件的影响，重复性较差，但可以通过固化反应条件得到解决，已经成为植物种质资源研究的重要手段[17]。RAPD分子标记方法在本研究中对供试材料的类群划分结果显示，筛选出的19条引物共扩增出150条DNA带，每个引物扩增的条带数在4～11条，平均每个引物产生7.42条，扩增出的DNA条带大小在300～1 200 bp。分析表明，在扩增的150条带中，多态性条带数为123条，占总条带的82.0%，UPGMA方法聚类结果显示50份向日葵核心资源可分为三大类群[18-20]，将2种方法的结果综合分析可以有效降低因其自身缺陷造成的误差，将分析供试材料分为4个基础类群。

综上所述，通过对向日葵核心种质资源的类群划分研究，可以为选育优良品种以及对各资源特定性状改良打下基础。我国向日葵品种资源比较丰富，利用传统标记方法和分子标记方法对向日葵核心资源库遗传多样性进行分析，并且得到一批稳定性好且具有丰富多态性的RAPD标记，通过对2种方法的比较发现，向日葵种质资源的亲缘关系和地理分布具有紧密联系，因而地理分布可作为杂交育种亲本选择的一个依据，并且2种方法的结果一致性较好，形态学标记和RAPD标记可以作为研究类似问题的核心方法。

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Analysis of Classification and Genetic Relationship among Core Sunflower Germplasm Resources

GUO Shuchun1,2，ZHANG Yanfang2，SUN Ruifen2，LI Suping2，YU Haifeng2，LIU Laqing3，WANG Hongbo4，AN Yulin2

(1.School of Physical Science and Technology，Inner Mongolia University，Huhhot 010010，China；2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Huhhot 010031，China；3.Helingeer Heilaoyao Township Agricultural Extension Service Station，Huhhot 011500，China；4.Ordos Vocational College of Eco-environment，Ordos 017010，China)

Sunflower is one of most important oil crops,and is also a kind of potential ornamental plants. Analysis of classification among the core sunflower germplasm resources is helpful for utilizing hetero.Morphological characteristics and RAPD markers were employed in detecting the genetic diversity among 50 sunflower germplasm resources with UPGMA method. The genetic diversity among the resources was revealed by cluster analysis on morphological characteristics. Clustering analysis indicated that the germplasms could be divided into three groups：27 germplasms were classified into group Ⅰ；group Ⅱ had 22 germplasms and group Ⅲ had 1 germplasm.Clustering analysis on morphological characteristics was associated with geological distribution.Furthermore，the results of RAPD cluster indicated that the germplasms could be divided into three groups，which were confirmed by the result of morphological characteristics cluster.The germplasms could be divided into three groups：26 germplasms were classified into group Ⅰ;group Ⅱ had 23 germplasms；group Ⅲ had 1 germplasm. Coincidence rate between morphological characteristics and RAPD was 96.30%. The results of the morphology and RAPD were identical.

Sunflower；Morphological characteristics；RAPD；Classification

2017-06-01

国家向日葵产业技术体系项目(CARS-16)；内蒙古农牧业科学院创新基金项目(2013CXJJN06)

郭树春(1981-)，男，内蒙古乌兰察布人，助理研究员，博士，主要从事生物信息学研究。

安玉麟(1954-)，男，内蒙古包头人，研究员，主要从事作物遗传育种研究。

S595.5

A

1000-7091(2017)04-0107-07

10.7668/hbnxb.2017.04.018