水稻种子H2O2流速和种子活力的关系研究

李俊周，李梦琪，刘 磊，刘 娟，杜彦修，赵全志

(河南粮食作物协同创新中心，河南省水稻生物学重点实验室，水稻河南省工程实验室，河南农业大学，河南 郑州 450002)

水稻种子H2O2流速和种子活力的关系研究

李俊周，李梦琪，刘 磊，刘 娟，杜彦修，赵全志

(河南粮食作物协同创新中心，河南省水稻生物学重点实验室，水稻河南省工程实验室，河南农业大学，河南 郑州 450002)

研究了水稻种子H2O2流速与种子活力的关系，为快速无损伤鉴别水稻种子活力方法提供依据。以粳稻日本晴、籼稻金农丝苗为材料，采用高温高湿人工老化方法处理种子0，7，10 d获取不同活力水平种子，测量3种类型种子的发芽率、根长、芽长、电导率、H2O2含量、CAT活性等性状，并利用非损伤微测系统(NMT)测量种子的H2O2流速。结果表明，老化处理造成水稻种子发芽率、根长、芽长和CAT活性降低，而电导率、H2O2含量及外排流速增加；老化处理10 d，老化程度加重，趋势更明显。H2O2流速与种子发芽率表现极显著负相关的线性关系。种子的H2O2流速大小及方向反映了种子内部的氧化还原平衡和细胞膜的状态，通过非损伤微测技术测定H2O2流速可以作为水稻种子活力判断的一种方法。

水稻；种子老化；非损伤微测技术；H2O2流速；种子活力

老化在种子贮藏过程中经常发生，导致种子发芽率降低，造成粮食产量的严重损失。种子活力是反映种子迅速整齐出苗以及幼苗正常生长的主要指标[1]，测量种子活力，预测种子在田间的发芽、出苗和生长情况，科学指导农业生产，可以减少因种子老化给农业带来的损失。常用检测种子活力的方法有种子发芽试验、电导率测量、TTC染色法等[2-4]，但是这些方法都存在对种子造成伤害、周期较长的缺点。非损伤微测技术(NMT)就是利用离子/分子选择性/特异性电极在不接触被测样品的情况下获得进出样品的各种离子/分子浓度、流速及运动方向的信息，具有非损伤、多电极、多角度、高灵敏度、高分辨率等优点[5-7]，该技术已经在植物抗盐、植物病理、植物耐重金属等多种植物研究领域得到应用。Xin等[8]利用非损伤微测系统测量了不同活力水平种子的氧分子流速，发现种子活力与氧分子流速存在极显著的正相关关系。

种子老化过程，活性氧自由基(ROS)逐渐积累，种子体内产生抗氧化酶以维持正常的代谢[9-10]。一旦胁迫加剧，平衡被打破，会导致脂质过氧化和细胞膜损害[11-12]。过氧化氢(H2O2)是一种氧化剂，植物体内低浓度H2O2可以作为一种信号分子，抵御各种非生物胁迫，高浓度的H2O2则能够诱导细胞死亡[13]。种子老化过程，H2O2含量有一个显著上升的趋势；种子老化加重，与抗氧化有关的酶活力急剧下降，细胞程序性死亡，细胞膜受到破坏，H2O2大量积累并外流，种子衰老加速[14]。因此，H2O2流速大小及方向可能能够作为判断种子活力的指标。本试验利用非损伤微测系统测定粳稻和籼稻2个代表性水稻品种不同老化程度种子的H2O2分子流速及流动方向，以期确定H2O2分子流速与种子活力之间的关系，为快速无损伤鉴别水稻种子活力提供一种新的方法。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为粳稻品种日本晴和籼稻品种金农丝苗。所有种子晒种2 d后，利用种子老化箱采用高温高湿方法进行人工老化。具体为种子分散均匀置于老化网上，设置温度为(45±1)℃，湿度为RH=100%。种子分别老化处理0，7，10 d。种子老化后，室温自然风干，然后进行以下指标的测定。

1.2 试验方法

1.2.1 种子发芽试验 标准发芽试验，10% H2O2将所有种子消毒10 min后，用蒸馏水冲洗干净，于黑暗条件下蒸馏水浸泡24 h。然后转移到直径10 cm的培养皿中，2层滤纸做介质，每个培养皿加入20 mL蒸馏水，放置光照培养箱(25 ℃)进行发芽试验。3次重复，每重复100粒。第5天测量根长和芽长，第14天测量发芽率。

1.2.2 电导率测定 每个品种设3次重复，每次重复随机选取50粒种子并称重，用去离子水冲洗3次，滤纸吸干浮水。将种子置于洁净的100 mL烧杯中，加入50 mL去离子水，于恒温下(25 ℃)浸泡48 h，浸泡摇匀后用电导率仪(DDS-307A)测定浸泡液的电导率。最后将各个样品煮沸10 min，冷却至室温(25 ℃)，再测定电导率。以去离子水为对照，计算公式：相对电导率=(浸泡液的电导率/煮沸后的电导率)×100%[15]。

1.2.3 CAT活性和H2O2含量测定 CAT活性测量参照李合生[16]的方法，3次重复。具体步骤如下：①试剂配制：0.15 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.0)：取A母液457.5 mL 和B母液292.5 mL混合后用蒸馏水定容至1 000 mL。A母液：取Na2HPO4·12H2O 71.7 g定容至1 000 mL；B母液：取NaH2PO4·2H2O 31.2 g定容至1 000 mL。磷酸缓冲液(pH值7.8)的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75 mL，B母液(NaH2PO4)21.25 mL，用蒸馏水定容至1 000 mL。②酶液制备：每个样品取20粒去壳种子，称重。洗净后置于预冷的研钵中，加入5 mL 50 mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH值7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管，12 000 r/min 4 ℃离心20 min，上清液即为酶液。③反应液配制：取200 mL磷酸缓冲液(pH值7.0)，加入0.309 2 mL 30%的H2O2(原液)摇匀即可。④样品测定：取3 mL反应液加入0.1 mL(可视情况调整)酶液，以磷酸缓冲液(pH值7.0)为对照调零，测定OD240(测定3 min，每隔30 s测定一次)。⑤酶活性计算：以每分钟OD值减少0.01为1个酶活性单位(U)。CAT((μmol/(g·min))=(ΔA240×Vt)/(W×Vs×0.01×t)，ΔA240为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜质量(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积(5 mL)；Vs为测定时取用酶液体积(0.1 mL)。

H2O2含量测量参照邹琦[17]的方法，3次重复。步骤如下：①试剂：100 mol/L H2O2；丙酮试剂：取30%分析纯H2O257 μL，溶于100 mL丙酮中，稀释100倍；2 mol/L硫酸；5%(m/v)硫酸钛；丙酮；浓氨水。②标准曲线制作：取7个10 mL离心管，每支离心管按梯度加入0，1，2，4，6，8，10 μL的100 μmol/L H2O2丙酮试剂，每个管用4 ℃预冷的丙酮补足到1 mL，然后每个管依次加入0.1 mL 5%硫酸钛，0.2 mL浓氨水；3 000 r/min离心10 min，弃去上清，留沉淀。每个管再加入5 mL 2 mol/L的硫酸，待沉淀完全溶解后，将其小心转入10 mL容量瓶中，蒸馏水多次冲洗，定容至10 mL刻度，415 nm波长比色，光径1 cm。③提取液制备：每个样品取20粒去壳种子，称重。洗净后置于预冷的研钵中，加入4 ℃预冷的丙酮研磨，用丙酮定容至5 mL，3 000 r/min离心，上清即为样品提取液。4、样品测定：每个样品用1 mL提取液，415 nm波长比色，光径1 cm测定比色值。H2O2(μmol/g)=[C×Vt]/(FW×V1)，其中C为标准曲线查得样品H2O2浓度(μmol/mL)；Vt为样品提取液总体积；V1为测定时用样品提取液体积(mL)；FW为植物组织鲜质量(g)。

1.2.4 H2O2流速测定 H2O2流速的检测用非损伤微测系统NMT100-SIM-YG(北京旭月科技有限公司)，系统软件imFlux，微电极为尖端直径为2～4 μm的玻璃电极，型号为XY-DJ-502。配制试剂：配制测试液、校正液1、校正液2和校正液3，测试液配方为100 mmol/L KCl、300 mmol/L C6H13NO4S、100 mmol/L CaCl2，pH值6.0，现配现用；校正液1的配方为0.01 mmol/L H2O2、100 mmol/L KCl、300 mmol/L C6H13NO4S、100 mmol/L CaCl2，pH值6.0；校正液2的配方为0.1 mmol/L H2O2、100 mmol/L KCl、300 mmol/L C6H13NO4S、100 mmol/L CaCl2，pH值6.0；校正液3的配方为1 mmol/L H2O2、100 mmol/L KCl、300 mmol/L C6H13NO4S、100 mmol/L CaCl2，pH值6.0，校正液现配现用。测定方法包括以下步骤：①将配置好的校正液1、2、3分别倒入3个培养皿中，将盛有校正液1的培养皿放到载物台上，将参比电极冲洗干净，放入校正液1中，随后将微电极也放入校正液1中开始校正，观察仪器“tip”读数；若变化波动小，读取校正液1的电流读数；将参比电极取出，用去离子水冲洗干净，用滤纸将表面水分吸干；再利用校正液2和校正液3进行校正，方法同校正液1；当电极校正合格，即可开始测量；②将种子去壳后在测试液中浸泡3 h，再用校正后的微电极在种子外表面靠近胚轴处检测；检测为振动检测，检测时微电极的运动方向垂直于种子表面，每次电极移动距离为30 μm，检测的间隔时间为10 s，每粒水稻种子检测10 min；测定完成后，记录好读数；③对检测结果进行处理和分析；采用非损伤微测系统NMT100-SIM-YG和系统软件imFlux对种子检测后得到电势的差值ΔI(fA)，该值通过系统软件imFlux利用公式J0=-D×(dc/dx)计算得到H2O2分子流速，单位是pmol/(cm2·s)；其中，dc为H2O2分子的浓度梯度；dx为电极移动距离；D是H2O2分子在测试液中的扩散常数。

1.3 数据分析

利用Excel 2007进行常规数据统计、一元线性方程线性拟合和作图等，用SPSS 17.0软件进行相关分析、方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同水稻老化种子的发芽特性

老化处理后两品种种子发芽率、根长和芽长出现不同程度的下降(表1)。老化7 d后种子萌发显著降低，3个性状都显著低于正常未老化，日本晴的发芽率、根长和芽长较老化0 d种子分别下降了30.85%，84.97%，50.98%，金农丝苗的发芽率、根长和芽长较老化0 d种子分别下降了67.46%，86.67%，48.72%。老化10 d后，日本晴的发芽率、根长和芽长较老化0 d种子分别下降了72.88%，94.12%和71.76%，金农丝苗完全没有萌发。

表1 不同老化处理时间水稻种子的发芽和电导率Tab.1 The germination and electric conductivity of rice seeds after different aging times

注：不同字母表示同一品种不同老化时间差异达5%显著水平。

Note：Different letters within each column means significant difference at 5% level between aging times for same variety.

2.2 不同水稻老化种子的生理特性

随着老化处理时间的延长，种子的相对电导率呈逐渐上升的趋势(图1)。相比于老化0 d，老化7，10 d日本晴种子的相对电导率分别升高了20.43%和88.82%，金农丝苗种子的相对电导率分别升高了49.59%和90.59%，且两品种电导率的增高都达显著水平。CAT活力随着老化处理时间的延长而逐渐降低(图1)。相比于老化0 d，老化7，10 d日本晴种子的CAT活力分别下降了36.91%和55.95%，金农丝苗分别下降了70.65%和75.00%，且两品种CAT活力的降低都达显著水平。H2O2含量随着老化处理时间的延长而逐渐升高(图1)。相比于老化0 d，老化7，10 d日本晴种子的H2O2含量分别升高了100.18%和178.51%，金农丝苗分别升高了53.81%和161.43%，且两品种H2O2含量的升高都达显著水平。结果表明，人工老化处理造成水稻种子的CAT活性降低、电导率和H2O2含量升高，种子活性下降。

不同字母表示差异显著，P<0.05。Different letters means significant difference,P<0.05.

2.3 不同水稻老化种子的H2O2流速及与种子活性指标的关系

H2O2流速负值代表种子H2O2内流，正值代表外排。相同老化处理时间，种子的H2O2流速值基本都在一个稳定的区间内波动，金农丝苗的H2O2流速大于日本晴(图2)。随着老化时间的延长，H2O2流速逐渐升高。相比于老化0 d，老化7，10 d日本晴种子的H2O2流速分别升高了3.69，5.90倍，金农丝苗种子的H2O2流速分别升高了4.19，8.02倍。

通过拟合线性方程得出H2O2流速与各种子活性指标的关系(表2)，H2O2流速与发芽率拟合的线性方程式为：y=-1.471 5x+1.391 6，R2为0.96，显示H2O2流速与发芽率的相关性达极显著水平。H2O2流速与种子活性相关的指标电导率和H2O2含量呈显著的线性正相关关系，与CAT活性的R2达0.74，但是相关性不显著。

A.日本晴；B.金农丝苗；0、7和10分别表示老化处理0，7，10 d。A.Nipponbare; B. Jinnongsimiao；0，7 and 10 represents aging time of 0，7，and 10 d.

项目ItemH2O2流速/(pmol/(cm2·s))VelocityofH2O2发芽率/%Germinationrate0.96**电导率/%Relativeelectricconductivity0.91**CAT活性/(μmol/(g·min))CATactivity0.74H2O2含量/(μmol/g)H2O2content0.88*

注：*.**分别表示达5%和1%显著水平。

Note:*,**means significant difference at 5% and 1% level respectively.

3 结论与讨论

为了准确了解种子活力情况，播种前需要对种子的发芽率、电导率、CAT活性、H2O2含量等进行检测，这些指标与种子活力都有较好的相关性和一致性[1，18-19]。一般来说，低活力种子的发芽率、CAT活性较低，而电导率、H2O2含量较高，本研究也得到相同的结果，人工老化7，10 d的种子比未老化种子发芽率和CAT活力大幅度降低，电导率和H2O2含量显著升高。此外，一些快速非损伤的方法逐渐被开发出来，如激光散斑技术通过对种子散斑进行质量和数量上的测定来准确分析种子活力[20]，Asbrouck等[21]通过测定单粒种子氧气消耗评价番茄种子的活力，非损伤红外热呈像法也用于评价种子活力[22]。本试验非损伤微测技术只对单粒水稻种子表面进行H2O2流速测量，就可以准确预测种子活力和种子发芽率。相比其他种子活力检测方法，检测方法要求低、简单、方便、快速、准确性高，评价方法简单可靠。利用非损伤微测技术测定种子H2O2流速的方法有望成为一种水稻种子活力的无损、快速、活体检测的新方法。

H2O2是植物的一种信号物质，它在植物细胞内或者细胞之间流动，并引发一系列分子、生理学和表型上的响应[23]。H2O2是一把双刃剑，低浓度的H2O2可以增强植物对逆境胁迫的抵御；高浓度会造成细胞程序性死亡，加速衰老[24-25]。CAT主要存在于水稻细胞的过氧化物酶体中，催化H2O2分解为水和氧气。种子老化过程中，和CAT一起参与过氧化保护的酶有SOD、POD、APX等[26]。大量研究表明，随着老化时间的延长，种子的抗氧化酶活力呈现一个逐渐下降的趋势[19，27-28]。由于抗氧化酶活力的下降，清除活性氧能力下降，H2O2含量逐渐升高。不同老化时间种子的H2O2流速和含量分析发现，H2O2流速和含量都随老化程度而出现升高的趋势，这也与前人类似研究结果相一致[29]。较低的H2O2流速(或负值)和含量表明水稻种子活力好，种子质量高。较高的H2O2外排流速和含量表明种子老化严重，种子活性较低。未老化种子，由于抗氧化酶活力较高，种子的H2O2含量较低，所测得的H2O2流速负值多于正值。老化后，种子的H2O2含量较高，H2O2外排。种子严重老化，H2O2含量缓慢下降至趋于稳定，种子的膜脂不稳定增加、细胞膜透性增大，清除H2O2分子能力减弱，H2O2外排流速继续升高[30]。所以，活力强的种子H2O2外流作用弱；老化活力弱的种子，种子内的H2O2含量上升，H2O2会出现外流；老化程度加重，与抗氧化有关的酶活力急剧下降，H2O2大量积累，细胞膜受损，细胞程序性死亡，H2O2大量外流。因此，种子H2O2流速与发芽率、电导率、H2O2含量有显著的线性相关，H2O2流速和方向可以用来评价种子活力。

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Study on the Relationship Between H2O2Velocity and Seed Vigor of Rice Seeds

LI Junzhou，LI Mengqi，LIU Lei，LIU Juan，DU Yanxiu，ZHAO Quanzhi

(Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops，Henan Key Laboratory of Rice Biology,Henan Engineering Laboratory of Rice，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

In order to clarify the relationship between H2O2velocity and seed vigor of rice seeds to provide method for rapid and noninvasive identification of rice seed vigor，germination percentage，root length，shoot length，electrical conductivity，H2O2content，CAT activity，and H2O2velocity of rice seeds forjaponicaNipponbare andindicaJinnongsimiao after 0，7，10 d of aging times were measured. The results showed that the germination percentage，root length，shoot length and CAT activity were decreased after aging treatment，and the electrical conductivity，H2O2content，and efflux velocity were increased. This trend was more obvious after more serious aging treatment of 10 d. H2O2flow rate and the seed germination percentage showed a significant negative correlation. The magnitude and direction of the H2O2fluxes of the seed reflect the state of redox equilibrium and the cell membrane, H2O2fluxes measured by the non-invasive micro-test technique may be a reliable and sensitive method to evaluate seed germination and vigor.

Rice; Seed aging; Non-invasive micro-test technique; H2O2flux; Seed vigor

2017-07-02

河南省重大科技专项(141100110600)；河南省高校科技创新人才支持项目(16HASTIT016)；郑州市节水农业重点实验室建设项目(112PYFZX185)

李俊周(1978-)，男，河南开封人，副教授，博士，主要从事水稻遗传育种研究。

赵全志(1968-)，男，河南驻马店人，教授，博士，主要从事水稻栽培生理研究。

S511.01

A

1000-7091(2017)04-0189-06

10.7668/hbnxb.2017.04.030