花生MAPK基因的筛选和盐胁迫分析

孔祥远，陈冠旭，秦贵龙，隋炯明，乔利仙，王晶珊，徐丽丽

(青岛农业大学 生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109)

花生MAPK基因的筛选和盐胁迫分析

孔祥远，陈冠旭，秦贵龙，隋炯明，乔利仙，王晶珊，徐丽丽

(青岛农业大学 生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109)

促有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在植物生长发育及抗逆胁迫过程中发挥重要作用。为了解花生中MAPK基因的情况，利用RNA测序技术对花生耐盐突变体(S2)和对照(S4)进行了转录组分析，筛选出了14个MAPK基因，位于花生野生种基因组A组的6条染色体上。聚类分析表明，花生14个MAPK基因中13个可以聚到已报道的4个亚类中。利用花生S2和S4构建了盐胁迫处理前后的表达谱，根据调整后的P值，筛选出6个MAPK基因在S2和(或)S4受盐胁迫诱导表达，分别属于A(1个)和D亚类(5个)。为花生MAPK基因的功能验证和利用奠定了基础。

花生；MAPK基因；盐胁迫；RNA测序

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应是重要的信号通路之一，在植物的生长发育过程起着重要作用[1]。MAPK级联反应涉及MAPK、MAPKK和MAPKKK 3个蛋白激酶。MAPK传导通路主要过程为：MAPKKK被磷酸化后激活MAPKK，MAPKK被磷酸化之后再激活MAPK，最后由MAPK对细胞的生理周期进行一系列的调控，其中MAPK是位于级联途径的最下游区域[2]。

MAPK基因与某些生物和非生物胁迫有着密切关系。拟南芥的AtMAPK基因在抵抗非生物胁迫和病害中有重要作用[3-5]。将玉米中ZmMAPK1基因转到拟南芥中可提高转基因植株抵抗干旱和热胁迫的能力[6]。亚麻LuMAPK基因受盐碱胁迫诱导表达[7]。GhMAP16是棉花MAPK基因D组中一个新的胁迫响应基因，转入拟南芥后可提高转基因植株的抗旱和抗病能力[8]。烟草的17个NtMAPK基因在植株防御病害中有重要作用，并且有6个NtMAPK基因对干旱胁迫有响应[9]。西瓜中很多ClMAPK成员对不同非生物胁迫(如干旱、盐、冷、热处理)有响应[10]。此外番茄和黄瓜的MAPK基因也具有抵抗非生物胁迫的作用[11-12]。

为了分析花生MAPK基因的情况，笔者构建了花生叶片转录组文库，筛选了花生MAPK家族基因，并进行基因结构分析、染色体定位和聚类分析。然后利用盐胁迫处理前后的表达谱，分析了MAPK基因在盐胁迫处理前后表达量的变化，为了解花生MAPK基因和盐胁迫之间的关系奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

在前期试验中，利用化学诱变(以平阳霉素为诱变剂)进行了花生离体诱变，并在含羟脯氨酸的培养基中进行定向筛选，经过多代检测后获得了1个稳定遗传的耐盐突变体(S2)，其种子在0.7% NaCl 溶液中的发芽率显著高于对照花育20(S4)。

1.2 试验方法

1.2.1 花生叶片转录组数据库构建 用250 mmol/L NaCl处理生长1个月的耐盐突变体(S2)和对照(S4)植株，在0，6，12，24，48 h取叶片，每个样品2次生物学重复，所有20个样品混合后构建转录组文库。用NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO、KEGG这七大数据库进行了基因功能注释。

1.2.2 花生叶片表达谱数据库构建 对上述20个样品进行数字化表达谱测序，构建表达谱数据库，并以上述转录组数据库为参考，对表达谱数据库Unigene序列进行分析。

1.2.3MAPK基因的筛选和分析 根据上述七大数据库的基因功能预测，搜索MAPK基因。利用生物信息学软件分析蛋白的分子量和理论等电点。从花生全基因组数据，并根据数据库的预测和比对结果进行外显子-内含子结构分析。根据与A组野生种比对后的结果，绘制每个基因在染色体上的位置。

1.2.4 系统发育树的构建 通过ClustalX 程序对MAPK蛋白进行多序列联配分析，序列联配结果使用MEGA 7.0程序。采用邻接法生成MAPK基因的系统进化树，Bootstrap 值设置为1 000。

1.2.5 蛋白多序列的比对分析及部分保守基序(Motif)分析 使用ClustalX软件的多序列比对功能对MAPK蛋白进行多序列比对，参数均使用默认值。使用MEME 4.11.1在线分析系统(http：//meme-suite.org/index.html)对MAPK蛋白进行保守基序预测。

1.2.6MAPK基因的盐胁迫响应分析 将S2或S4样品中，在0，6，12，24，48 h，某一基因在任意2个时间段间的表达量进行比较，如果达到显著水平(调整后的P<0.05)，则认为该基因对盐胁迫有响应。根据FPKM (Fragments kilobase of exon model per millon mapped reads)值利用软件HemI_1.0制作热图。

2 结果与分析

2.1 花生MAPK基因的鉴定、结构及其在染色体位置上的分布

根据上述七大数据库的基因功能预测结果及SMART在线工具分析其结构域，从花生叶片转录组数据库筛选出23个候选MAPK基因。将其与公布的花生A组野生种基因组序列比对，其中c31753_g1、c40388_g1、c41119_g3和c44286_g1 4个基因不含有完整读码框且比对不到A组野生种基因组，c37067_g2与c37067_g3、c38354_g1与c43036_g1、c58235_g1与64143_g1、c30953_g1与c33764_g1、c37424_g1与c39725_g2 分别比对到同一位置，最终得到了14个完整的花生MAPK基因，其基本信息列于表1和图1。

由表1可以看出，不同成员间氨基酸残基个数差别很大，为206～669个，分子量为22.82～76.39 kDa，等电点在5.63～9.89，外显子数目2～16个。除c40125_g2、c33764_g1基因编码产物定位到叶绿体和细胞壁外，其余基因编码产物定位到细胞核和细胞质上。

通过与花生A组野生种基因组序列比对后，发现14个MAPK基因共分布于6条染色体上，多数位于3，5号染色体上，分别有4，3个基因；1，4，7号染色体各有2个基因；2号染色体上有1个基因，其他染色体上暂时没有发现MAPK基因(图2)。

2.2 花生MAPK基因的聚类和基序分类

拟南芥中至少有20个MAPK基因，可分为A、B、C、D 4个亚族[10]。根据MAPK基因家族成员长度差异、含不同特征的结构域等特点，对花生14个MAPK基因与拟南芥的MAPK基因进行了多重序列比对和系统进化分析。结果表明，13个花生MAPK基因能聚到拟南芥的A、B、C、D 4个亚族中，这4个亚类分别包含1，4，1，7个基因；而c39725_g2单独聚为一类，可能是新的成员(图3)。

表1 14个花生MAPK 基因的基本信息

图1 14个花生MAPK 基因的结构示意图

通过MEME 4.11.1在线分析软件对14个MAPK基因进行motif分析，共发现15个motif，其中motif4和motif8是14个MAPK基因共有的，c39725_g2只含有4个motif，分别为motif4、motif5、motif7、motif8。motif15只出现在c33764_g1和c37067_g3这2个基因中(图4)。

2.3 花生MAPK基因的盐胁迫响应分析

利用盐胁迫处理前后的表达文库谱，对14个MAPK基因在胁迫处理前后的任何2个时间段间的表达量进行比较，根据调整后的P值，确定其是否受盐胁迫诱导表达。结果发现，2个基因(c42537_g2、c38354_g1)在S2和S4中均受胁迫诱导表达；4个基因(c41648_g2、c40125_g2、c33764_g1、c43948_g1)只在S2中受胁迫诱导表达。14个花生MAPK基因在各个时间段的表达量也不同，S2中FPKM值为0～94.55，S4中FPKM值的变化为0～97.04(图 5)。c40125_g2、c42537_g2和c43948_g1在S2、S4的表达模式相同，但它们的表达曲线并不一致，c40125_g2为上调-上调-下调-上调，c42537_g2为上调-下调-下调-上调，c43948_g1为下调-下调-上调-下调。c40125_g2、c33764_g1、c41648_g2这3个基因在S2与S4的表达模式不同(图 5)。

图2 14个花生MAPK基因在染色体上的位置

图3 拟南芥和花生MAPK基因的进化树

结合聚类分析结果发现，上述6个受盐胁迫诱导的MAPK基因涉及A和D 2个亚类，其中A亚类(1/1)和D亚类(5/7)的基因受盐胁迫诱导表达；而B和C 2个亚类的6个基因均不受盐胁迫诱导表达。

3 讨论

MAPK基因在植物中广泛存在，他们在帮助植物抵御非生物胁迫中发挥重要作用，有些成员在受到非生物胁迫时可被诱导表达。当植物体在经历各种情况下的环境胁迫时，如干旱、极端温度、辐射胁迫等[13-14]，MAPK的级联反应能将细胞外的刺激透过细胞膜传导到细胞膜内乃至细胞核，使膜外的刺激物与膜内的受体结合起来从而使细胞做出一系列反应[15]。MAPK的级联反应还参与细胞的防御反应等多条途径[5]。由此可见，深入研究MAPK的功能对于作物抗逆育种具有重要的理论和实际应用价值。目前，许多植物的MAPK基因均已被分离出，其中MAPK基因家族在拟南芥中共发现20个AtMAPK基因[16]，水稻有17个OgMAPK基因[17]，玉米有19个ZmMAPK基因[18]。烟草有17个NtMAPK基因[19]，番茄有16个SiMAPK[20]。目前在花生中还没有关于MAPK基因的报道。

为了分析花生中MAPK基因的情况，利用花生叶片转录组数据库筛出了14个MAPK基因，他们位于花生A组野生种的6条染色体上，不同染色体上的MAPK基因数目差异很大。根据已有报道，拟南芥MAPK基因可分为A、B、C、D 4个亚类，对花生的14个MAPK基因进行了聚类分析，结果表明其中13个MAPK基因分别聚到拟南芥的4个亚类中。

图4 14个花生MAPK基因的基序分析

单位为FPKM。

利用花生耐盐突变体(S2)和对照(S4)构建了盐胁迫处理前后各时间段的表达谱，进行基因盐胁迫表达分析，结果表明14个MAPK基因中6个受盐胁迫诱导表达，这6个基因涉及A和D 2个亚类，D亚类中受盐胁迫诱导表达的成员最多(5个)，同一亚家族内的基因表达模式并不完全相同；而B和C亚类中的6个成员均不受盐胁迫诱导。本试验为今后花生中MAPK基因的研究与利用提供了理论依据。

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Screening and Salinity Stress Analysis ofMAPKGenes in Peanut

KONG Xiangyuan，CHEN Guanxu，QIN Guilong，SUI Jiongming，QIAO Lixian，WANG Jingshan，XU Lili

(College of Life Science，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong，Qingdao 266109，China)

Mitogen activated protein kinase (MAPK) plays an important role in plant growth and development，and stress resistance in plant.In order to improve our understanding of theMAPKgenes in peanut，RNA-seq was used to analyze one transcriptomic library constructed using a mutant with higher salinity resistance (S2) and its control (S4) in this study，14MAPKgenes were screened and located on six chromosomes of A genome from wild species.Clustering analysis showed that 13 out of 14MAPKgenes were assorted to four subgroups reported previously.Digital gene expression profiles were constructed using S2 and S4 samples before and after salinity treatment，according to the adjustedPvalue，sixMAPKgenes were found to be responsive to salinity treatment in S2 and (or) S4，which belonged to A (1)and D (5) subgroups，respectively.This study can provide the basis for functional identification and application ofMAPKgenes in peanut.

Peanut；MAPKgene；Salinity stress；RNA-seq

2017-03-25

国家自然基金项目(31571705；31301356；31471542)；山东省科技发展计划项目(2014GNC110002)

孔祥远(1989-)，男，山东菏泽人，在读硕士，主要从事作物分子育种研究。

徐丽丽(1979-)，女，山东诸城人，讲师，硕士，主要从事基因工程研究。

Q78；S565.03

A

1000-7091(2017)03-0027-06

10.7668/hbnxb.2017.03.005