长期定位秸秆还田对土壤真菌群落的影响

辛 励,陈延玲,刘树堂,刘锦涛,袁铭章,南镇武

(青岛农业大学,山东 青岛 266109)



长期定位秸秆还田对土壤真菌群落的影响

辛 励,陈延玲,刘树堂,刘锦涛,袁铭章,南镇武

(青岛农业大学,山东 青岛 266109)

为了研究不同秸秆还田条件对土壤真菌群落的影响,利用连续进行6年的莱阳潮土区长期定位秸秆还田试验与ITS rRNA扩增子测序技术,研究了小麦、玉米秸秆还田条件下,各处理土壤真菌群落的微生物多样性变化。结果表明,施用秸秆和有机肥能够提高土壤真菌群落多样性。秸秆还田后土壤真菌优势种群为子囊菌、接合菌和担子菌。主成分分析表明,各处理间微生物含量存在差异。两季秸秆还田配施氮肥处理能显著增加土壤全氮、有效磷、有效钾、有机碳含量。两季秸秆还田配施氮肥处理的土壤全氮、有效磷、有效钾、有机碳含量与蔗糖酶、脲酶、纤维素酶活性显著高于两季秸秆还田处理,与此同时,两季秸秆还田配施氮肥提高了当季玉米产量。这说明,秸秆还田施用氮肥显著增加土壤养分含量,增强土壤酶活性,有利于土壤真菌群落的多样性和稳定性的提高,改善土壤生态环境,从而促进作物增产。

长期定位;ITS rRNA;真菌群落;秸秆还田

秸秆是普遍存在的有机物料。大量研究表明,连续的秸秆还田能够提高土壤微生物群落多样性,为土壤提供大量养分,可建立一个良好的土壤生态体系[1]。土壤真菌广泛分布在各种土壤环境中,与土壤微生物活性密切相关,是评价土壤质量的重要生物活性指标[2-3]。在大多数酸性土壤中(pH值低于5),真菌数量相对较多,因此在这些土壤中,真菌所起作用较大[4]。土壤真菌是农田生态循环的重要调解者之一。由于真菌对农田生态系统循环的重要作用,土壤真菌一直受到广大学者的关注。

Kjouer等[5]研究表明长期单施化肥会明显降低土壤真菌的多样性;而李秀英等[6]研究表明长期单施化肥对土壤微生物影响并不明显。单施氮肥会使真菌的丰度降低。土壤微生物的种群数量直接关系到土壤中有机质的分解和矿质元素的转化,影响作物对营养元素的吸收和利用[7]。目前,土壤微生物群落多样性对长期秸秆还田配施化肥的响应机制还不明确。

迄今为止,对于华北地区潮土真菌的多样性研究,多数以其分布规律、酶活性等为基础来研究土壤真菌群落结构以及代谢特征;而在分子水平上,特别是利用ITS rRNA基因测序技术对土壤真菌的微生物多样性进行的研究报道很少见[8-9]。本研究依托华北潮土区长达6年的小麦-玉米轮作秸秆还田长期定位试验,在不同秸秆还田施肥处理下,通过高通量测序以及DNA扩增因子测序反映出秸秆还田各处理真菌的物种的丰度、变化程度以及均匀度,揭示了农田生态系统的真菌群落组成与结构的基本差异,较为客观地反映了真菌群落的真实情况,从而为农田生态系统的健康管理提供了量化依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计

试验设在青岛农业大学莱阳实验站。土壤为非石灰性潮土。施肥前耕层土壤全氮量0.60 g/kg,全磷量0.64 g/kg,土壤有效磷16.34 mg/kg,土壤速效钾72.00 mg/kg,阳离子代换量为13.80 cmol/kg,pH 值6.8,土壤有机质含量为5.01 g/kg。

试验始于2009年秋。试验设置5个处理:分别为对照(CK)、单施有机肥60 000 kg/hm2(M)、两季秸秆还田(WC)、一季秸秆还田+施氮肥276 kg/hm2(WN)、两季秸秆还田+施氮肥276 kg/hm2(WCN)。每个处理3个重复,同时设置空白对照(CK),随机区组排列,其间均设保护行。

试验地实行冬小麦-夏玉米轮作制,每年两作。冬小麦品种为烟优361;夏玉米品种为鲁玉16号。无机肥用尿素,高量氮肥每年施用276 kg/hm2。有机肥用猪圈粪,含全氮量为2～3 g/kg,含全磷量为0.5～2.0 g/kg,有机质含量为20～50 g/kg,干燥的玉米、小麦秸秆其全氮含量平均为1.93%,施用高低量均以与无机氮肥等含氮量计算。

1.2 样品采集

土壤样品在2014 年玉米收获期采集,各小区按“S”形多点采样法取表层(0～20 cm)土壤混合,混匀后作为该施肥处理的1个土壤样品,取200 g 新鲜土壤冷冻后保存,供分子生物学研究。

1.3 土壤养分的测定

有机质测定采用重铬酸钾容量法;碱解氮测定采用碱解扩散法;速效磷测定采用0.5 mol/L NaHCO3法;速效钾测定采用醋酸铵浸提-火焰光度计法;用pHS-3c仪器测定pH值[10]。

1.4 高通量测序及数据处理

采用CTAB方法对样本的基因组DNA进行提取,之后采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,取适量的样品于离心管中,使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。稀释后的基因组DNA为模板;根据测序区域的选择,使用带Barcode的特异引物;使用New England Biolabs公司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。使用高效和高保真的酶进行PCR,确保扩增效率和准确性。 引物对应区域:16S V4区引物为515F-806R;18S V4区引物为528F-706R;18S V9区引物为1380F-1510R;ITS1区引物为ITS1-5F-ITS2;ITS2区引物为:ITS2-3F-ITS2-4R。PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测;根据PCR产物浓度进行等浓度混样,充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,使用Thermo Scientific公司的GeneJET 胶回收试剂盒回收产物[11]。

1.4.1 文库构建和上机测序 使用New England Biolabs公司的NEB Next®UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库的构建,构建好的文库经过Qubit定量和文库检测,合格后使用MiSeq进行上机测序[12]。

1.4.2 信息分析流程 为了使信息分析的结果更加准确、可靠,首先对原始数据进行拼接、过滤,得到有效数据。然后基于有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类分析,并将OTU和物种注释结合,从而得到每个样品的OTUs和分类谱系的基本分析结果。再对OTUs丰度、多样性指数等进行分析,同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。 最后在以上分析的基础上,可以进行一系列的基于OTUs、物种组成的聚类分析,PCA统计比较分析,挖掘样品之间的物种组成差异,并结合环境因素进行关联分析[13-17]。

2 结果与分析

2.1 不同施肥对土壤养分的影响

与CK处理相比,长期秸秆还田(WN、WC、WCN)和有机肥(M)处理显著增加土壤全氮、有效磷、有机碳含量,尤其是长期秸秆还田与氮肥或有机肥单独应用。长期秸秆还田和施肥处理不影响土壤的pH值(表1)。各处理玉米产量差异显著,不同处理间M>WCN>WN>WC>CK。从表2可以看出,WCN处理与WC、WN处理相比玉米产量显著增加31.7%,26.9%。3种不同秸秆还田和有机施肥处理的土壤蔗糖酶、脲酶、纤维素酶活力的影响均显著提高。其中,WC处理土壤酶活性最低,WCN处理酶活性最高,WN和M处理次之。

表1 不同处理土壤养分含量与pH值

注:CK.对照;WC.玉米-小麦两季秸秆还田;WN.小麦秸秆还田配施276 kg/hm2氮肥;M.有机肥,6 000 kg/hm2猪粪;WCN.小麦玉米秸秆还田配施276 kg/hm2。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。表2同。

Note:CK.Control;WC.Maize-wheat season straw;WN.Wheat straw returned to the field with application of 276 kg/ha N.M.Organic fertilizer,6 000 kg/ha,pig manure;WCN.Wheat and maize straw returned to the field with 276 kg/ha N.The different small letters represent significant difference (P<0.05).The same as Tab.2.

表2 不同处理土壤蔗糖酶、脲酶、纤维素酶活性与玉米产量相关性

2.2 稀释曲线

对Illumina MiSeq/HiSeq 测序平台得到的下机数据进行预处理,获取Tags值,默认提供以97%和95%的一致性将序列聚类成为OTUs,绘制稀释曲线。如图1 所示,测序数据量足够大,各处理曲线趋向平滑,表明样品物种的丰富程度较高,本试验可信度较高,能够反映各处理样品中绝大多数的微生物信息。各处理中,WCN处理OTU数最高。

2.3 物种分类鉴定结果

通过序列优化过程中获得了1 200多个有效读取,并计算了真菌群落丰富度指数,如表3所示。WC、WN、M和WCN样品OTUs值分别高出CK处理163,77,185和72。Shannon和Chao1表明,与CK处理相比,秸秆还田和有机肥处理提高土壤真菌群落多样性。

图1 物种丰富度稀释曲线

处理TreatmentsObservedOTUsShannonChao1真菌Fungus细菌Bacteria真菌Fungus细菌Bacteria真菌Fungus细菌BacteriaCK13525133.1249.11163.702825.6WC29829645.6899.73541.083217.6WN21231373.5909.80398.483413.8M32029485.3669.85358.613241.2WCN20732642.7699.98269.573766.5

注：Shannon.香浓-威廉姆指数，表示群落多样性与复杂度，数值越大群落多样性越高。

Note:Shannon.Aromatic-William index,community diversity and complexity,the greater the value the higher the community diversity.

2.4 土壤真菌物种聚类OTU分析及物种注释

用 Uparse 软件对所有样品的全部Tags 序列聚类,默认提供以97%的一致性将序列聚类成为OTUs结果,按所有样品间序列最小值对OTUs聚类结果进行标准化处理后,对不同样品的Tags数据进行初步统计,平均有效序列得到了290个OTUs,注释到7个门。这些土壤样本中有7个门水平存在差异,其中子囊菌门在所用样本中丰度最高,接合菌亚门(Zygomycota)、担子菌门(Basidimoycota)以及子囊菌门(Ascomycota)相对丰富也较高,同时也发现了一些含量稀少的门(图2)。

对CK、WN、WCN、M、WC处理的样品的OTUs进行比较分析,其他各处理相较于CK条带数量都较多,表明秸秆还田土壤环境中,真菌的多样性比较高。各个处理的条带数目和位置均不同。这表明在经过不同秸秆还田方式处理后土壤真菌群落的多样性有一定的变化。发现237个重叠的微生物种属,推断这些微生物物种可能是玉米或者小麦携带的真菌。

横坐标是处理名;纵坐标表示相对丰度;其他物种表示最大相对丰度(某个门在所有样品中相对丰度的最大值)最高的10个门之外的所有门的相对丰度的和。

Abscissa is the treatments names;Ordinate represents the relative abundance;Others said maximum relative abundance (a door in all samples in the maximal relative abundance values outside).The highest relative abundance of all the doors outside the 10 gates.

图2 土壤真菌物种聚类OTU分析

Fig.2 Analysis of soil fungal species cluster OTU

横向为处理信息,纵向为物种注释信息,图中左侧的聚类树为物种聚类树;上方的聚类树为样品聚类树;中间热图对应的值为每1行物种相对丰度经过标准化处理后得到的Z值,即一个处理在某个分类上的Z值为样品在该分类上的相对丰度和所有处理在该分类的平均相对丰度的差除以所有处理在该分类上的标准差所得到的值。

Transverse treatment information,longitudinal species annotation information,clustering tree on the left side of the figure as a species tree clustering;Above the clustering tree to treatment cluster tree;Intermediate thermography corresponding values for each species relative abundance after standard treatment after the Z value,namely a treatment in a classification of Z value for treatments in the classification of the relative abundance of and all treatments in divided by the difference of the classification of the mean relative abundance of all the treatments in the classification of standard difference the obtained values.

图3 真菌物种丰富度聚类图

Fig.3 The species richness of fungi

2.5 不同施肥处理物种丰度聚类

根据所有样品在属水平的物种注释及丰度信息,选取丰度排名前35的属及其在每个样品中的丰度信息绘制热图,并从分类信息和样品间差异2个层面进行聚类,结果展示见图3。

不同的施肥处理创造了不同的土壤环境,进而影响土壤真菌的数量以及不同处理间种类分布特征。秸秆还田后的土样相对于对照组,土壤真菌的多样性显著增加,WN、WCN、M、WC处理酒香酵母菌(Brettanomyces)、篮状菌(Talaromyces)、玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus)以及圆盘菌科(Un-s-Orbiliaceae_sp)4种菌类丰度Z值较低,说明这4种菌类为CK处理特有的菌类。WN处理的粉褶蕈属(Entoloma)、翘孢霉属(Emericella)、隐球菌(Cryptococcus)以及外瓶霉(Exophiala)菌类丰度热度值较高,说明这4种菌类为WN处理的特有菌类。WCN处理伞菌纲(Un-s-Agaricomycetes_sp)、糙孢孔菌(Un-s-Trechisporales_sp)、柔膜菌(Un-s-Helotiales_sp)丰度热度值值较高,为WCN处理特有菌类。WC处理为曲霉(Aspergillus)、卷旋孢霉(Helicoma)、锥盖伞霉(Conocybe)、茶树菇(Agrocybe)热度值较高。

2.6 样品复杂度分析

2.6.1 主成分分析 如图4所示,第一主成分贡献率达42.43%,第二主成分贡献率达28.62%,因子1和因子2代表总变量的71.05%。 在这2个主成分为坐标轴构建的二维坐标系中,各个处理在主成分分析图上分布差异显著,M处理明显与其他处理分布位置不同,5组样本间的微生物组成存在差异,不同秸秆还田处理与对CK比都发生了明显的位置变化,但又明显被分为3组,其中WC、WN、WCN距离较近,WN与其他处理相比最接近WCN处理说明秸秆还田处理的土壤真菌的多样性优于CK与M处理,其中WCN处理对土壤真菌群落组成影响最大,各处理对土壤真菌群落结构的影响存在差异。在图4

坐标系中,WCN处理与WC处理相距最远,这表明相同秸秆还田条件下,WCN与WC处理相比土壤真菌群落结构发生了较大的变化,氮肥的施用对土壤真菌的作用效果不同,造成了相应处理间土壤真菌群落结构的差异。

横坐标表示第一主成分,百分比则表示第一主成分对处理差异的贡献值;纵坐标表示第二主成分,百分比表示第二主成分对处理差异的贡献值;图中的每个点表示一组具有代表性的样品。

The abscissa said the first principal component and percentage said value contribution of the first principal component of different treatments;the ordinate represents the second principal component,expressed as a percentage value of the second principal component contribution of different treatments,each point in the graph said a important sample.

图4 基于门水平的PCA分析结果展示

Fig.4 PCA analysis based on the phylum level of the fungus

2.6.2 样品聚类分析 在图5中,由在门水平上物种丰度统计结果所做的UPGMA聚类分析可以看出,不同处理之间真菌群落结构有明显的差异,各处理均有其优势门。各处理子囊菌门(Ascomycota)、接合菌亚门(Zygcmycota)、担子菌门(Basidiomycota)含量较高,为三大常见真菌类。其中WN处理子囊菌门(Ascomycota)相对丰度较大;CK处理接合菌亚门(Zygcmycota)距离最大,说明其含量较为丰富;WCN处理担子菌(Basidiomycota)担子菌距离较大。WC处理真菌丰度分布与M处理相近,这表明秸秆降解以及追加的肥料(氮肥)对微生物的繁殖和生长具有一定的促进和诱导作用,特别是可利用秸秆的土壤微生物的种群增多。

图5 真菌 UPGMA聚类分析

3 讨论与结论

秸秆结构非常复杂,它是由多种不同成分组合而成。主要包括纤维素、半纤维素、木质素以及水溶性多糖等物质[17]。这些物质的充分降解往往需要多种酶类的共同作用,甚至多种微生物类群的联合作用。作物秸秆本身含有丰富的氮磷钾等主要营养元素,秸秆还田后,伴随秸秆的分解,养分得到释放,增加了土壤养分含量。本试验也表明秸秆还田,尤其是秸秆还田配施氮肥能增加土壤养分含量。因此,秸秆还田必须结合有机、无机肥料的施用方可发挥最大的作用。

Kimura等[18]的研究结果显示,秸秆降解过程中确实存在着复杂的微生物群系。有机和无机肥料可提供作物生长所必需的元素,根系的生长和生理活性增加,根系分泌物能促进土壤真菌的繁衍,使其生命活动旺盛,引起与根际效应直接相关联的子囊菌门、接合菌门相对丰度增加。真菌构成了土壤的大部分微生物生物量[19]。物种丰度图谱分析表明秸秆还田后土壤具有较高丰度的子囊菌门和接合菌类。比较不同处理之间的差异,结果表明不同施肥处理间真菌群落结构差异显著,其中秸秆和氮肥是影响真菌群落组成的主要因素。另外,从物种丰度聚类分析的结果中可以发现,在不同的施肥条件下,不同耕作处理和秸秆管理(化肥与有机肥,秸秆还田与不还田)对土壤真菌影响都有很大差异。

长期施肥(氮肥配施和秸秆还田)提高了土壤肥力和质量,改善了真菌生长的生境条件,真菌种群多样性明显高于不施肥(CK)处理。不同处理之间微生物的群落结构有明显的差异。这表明秸秆降解以及追加的肥料(氮肥)对微生物的繁殖和生长具有一定的促进和诱导作用,特别是可利用秸秆的土壤微生物的种群增多。虽然土壤真菌的数量和种类受土壤层次、气候变化及土壤类型等诸多因素影响,但秸秆与化肥对土壤真菌群落有较大影响,长期秸秆还田条件下,配施氮肥有利于土壤微生物群落的多样性和稳定性的提高,有利于土壤生态环境的改善[15]。

主成分的分析结果表明,施用化学肥料、秸秆还田可以显著的提高土壤的真菌数量,施肥能不同程度地促进或抑制土壤微生物数量,影响根际土壤生理活性,尤其是有机肥能够促进根际真菌的繁殖[20-22]。随着长期施氮肥,土壤真菌群落为应对外界环境的变化自发的调整结构类型,同时显示出一定的稳定性[23]。由此可见,不同秸秆还田与施肥措施不仅改变了原土壤真菌群落的微环境,也影响了土壤真菌群落结构组成。其中秸秆还田真菌数量的增幅效果最大。5个处理土壤中真菌的群落结构都具有较大的差异,其中两季秸秆还田配施氮肥这一因子对土壤真菌群落结构具有较大影响,同时结合多样性分析,可以看出,小麦秸秆和有机肥这2个因子对土壤真菌群落结构也有一定的影响,影响程度和玉米秸秆相比较小。

秸秆还田配施氮肥、单施有机肥均能极大提高土壤养分含量。秸秆还田的同时配施适量氮肥提高了植物根际和土壤中微生物活性,使植物秸秆更易分解,能快速转化成土壤中养分,从而在短时期内使作物增产。

秸秆还田与施肥能不同程度地促进或抑制土壤真菌生长,以秸秆还田为主的施肥技术能够增加真菌活力，改善土壤中真菌群落结构,提高土壤质量。

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Fungal Community Development of Long-term Straw Returning Soil

XIN Li,CHEN Yanling,LIU Shutang,LIU Jintao,YUAN Mingzhang,NAN Zhenwu

(Qingdao Agriculture University,Qingdao 266109,China)

A next-generation,Illumina-based sequencing approach was used to characterize the bacterial community development of the long-term straw returning soil.Five treatments (soil without fertilizer,wheat and corn straw returning,wheat straw returning,manure,and wheat and corn straw returning) were tested in this study.In this study,the microbial diversity of soil fungi was studied by ITS rRNA PCR technology.The results showed that the community was composed of 3 dominant groups (Ascomycota,Zygomycota,Basidiomycota).Principal component analyses revealed that the microbiota were significantly different among treatments.The WCN treatment could significantly increase soil total nitrogen,available phosphorus,available potassium,and organic carbon content.The WCN treatment showed relatively higher soil total N,available P,available K,and organic carbon and invertase,urease,and cellulase activities than WC treatment,and this treatment also had the higher maize yield.Our experimental results suggested that application of N fertilizer at straw returning soil had significantly higher soil fertility,enzyme activities than straw returning,alone,which resulted in a different bacterial community composition.

Long-term experiment;ITS rRNA;Soil fungal community;Straw returning

2016-06-12

公益性行业(农业)科研专项(201203030)；山东省现代农业产业技术体系建设经费项目(SDAIT-01-022-06)；鲁东丘陵区小麦玉米水肥自然资源高效利用综合技术集成与示范研究项目(2013BAD07B06-03)

辛 励(1991-),男,山东安丘人,硕士,主要从事植物营养方面的研究。

刘树堂(1962-),男,山东安丘人,教授,博士,硕士生导师,主要从事植物营养与施肥技术的研究。

S158

A

1000-7091(2016)05-0186-07

10.7668/hbnxb.2016.05.028