小菜蛾触角结合蛋白PxylABP结合模式的研究

邓培渊,袁 伟,李玉华,王林青,李长看

(1.郑州师范学院 生物物种资源研究中心,河南 郑州 450044;2.华北水利水电大学 环境与市政工程学院,河南 郑州 450045)



小菜蛾触角结合蛋白PxylABP结合模式的研究

邓培渊1,袁 伟2,李玉华1,王林青1,李长看1

(1.郑州师范学院 生物物种资源研究中心,河南 郑州 450044;2.华北水利水电大学 环境与市政工程学院,河南 郑州 450045)

为了研究触角结合蛋白(Antennal binding proteins,ABPs)的生理功能,利用RT-PCR方法克隆了小菜蛾PxylABP基因,并在大肠杆菌中表达,纯化的重组蛋白通过荧光竞争结合试验测定其与29种化合物的结合特性,并运用AutoDock 4.2进行PxylABP蛋白和化合物的分子对接。结果表明,PxylABP与异硫氰酸丙烯酯、己醛、己烷、2-己酮、吲哚和β-紫罗兰酮结合,解离常数分别为0.91,1.81,1.17,2.71,2.74,14.95 μmol/L;分子对接显示,Tyr100与异硫氰酸丙烯酯形成1个氢键。说明PxylABP参与了小菜蛾识别十字花科蔬菜和虫害诱导的植物挥发物的生理过程。

小菜蛾;触角结合蛋白;荧光竞争结合试验;分子对接

小菜蛾(PlutellaxylostellaL.)属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae),主要危害十字花科蔬菜,已经成为十字花科蔬菜上的第一大害虫[1],在全国各地均有危害记录,在南方的危害尤为严重,且对田间常用杀虫剂产生了较强抗药性[2];常规的化学防治效果较差,而且蔬菜害虫的防治对杀虫剂的毒性和残留要求严格,因此,有必要寻找一种更安全、高效的防治策略。

利用气味影响昆虫的嗅觉行为是取代化学杀虫剂的有效途径[3],嗅觉对昆虫寻找寄主植物、配偶和产卵场所等活动起重要作用,基于嗅觉调控的性诱剂在害虫防治中得到了广泛应用[4-5],对昆虫嗅觉感受机制的研究是探索此类防治方法的关键。气味结合蛋白(Odorant binding proteins,OBPs)是一类低分子质量水溶性酸性蛋白,溶解并运输脂溶性的化合物分子穿过亲水性的淋巴液嗅觉神经树突末梢[6],在昆虫的嗅觉行为中起重要作用,OBPs可分为性信息素结合蛋白(Pheromone binding proteins,PBPs)、普通气味结合蛋白(General odorant binding proteins,GOBPs)和触角结合蛋白(Antennal binding proteins,ABPs)[7]3个亚类,ABPs在触角中特异表达,具有气味结合蛋白的典型特征,但与PBPs和GOBPs同源性较低[8],目前已在家蚕(Bombyxmori)[7]、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)[9]和烟蚜夜蛾(Heliothisvirescens)[10]等鳞翅目昆虫中克隆到ABPs基因,通过分析ABPs的组织分布和结构特性,推测其在昆虫气味识别中的作用,但对其生理功能的研究较少。因此,本试验利用RT-PCR方法克隆小菜蛾PxylABP基因,并在大肠杆菌中表达,纯化后进行荧光竞争结合试验,参照Li等[11]和Qiao等[12]的方法,测定PxylABP蛋白与主要绿色植物挥发物[13]和虫害诱导植物挥发物[14]的结合特性;此外,运用同源建模方法构建PxylABP蛋白三维结构,以结合能力最强的外源配基为配体,采用AutoDock分子对接技术分析PxylABP蛋白与配体的作用方式,确定其结合的关键位点和氨基酸。旨在为阐明PxylABP的生理功能和作用机制提供理论依据,也为深入了解小菜蛾的气味感受机制,从而利用其控制虫害提供相关依据。

1 材料和方法

1.1 生物材料

小菜蛾采集自河南农业大学科教园区,幼虫用萝卜苗饲养,温度26 ℃,相对湿度为70%～80%,光周期L∶D=16∶8。

1.2 主要试剂和仪器

NdeⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶、rTaqDNA聚合酶、T4 ligase连接酶、MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、IPTG和低分子质量蛋白标准品购自TaKaRa公司;荧光探针1-NPN和外源气味分子化合物为Sigma公司产品;DE-52为Whatman产品；AKTA蛋白纯化系统和分子筛Superose-12预装柱为GE公司产品；荧光分光光度计为Jasco FP-750;表达载体pET-30b(+)、菌株DH10B和BL21(DE3)为郑州市生物物种资源研究重点实验室保存。其他试剂均为国产分析纯。

1.3PxylABP基因的克隆、表达和纯化

1.3.1 引物的设计与合成 从GenBank查取PxylABP(ID:AB189031.1)的CDS序列,运用在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/预测其信号肽序列,除去后依据其成熟编码区序列设计引物如下:

PxylABP-Forward(5′-3′):ATCATATGCTCACAG ACGAGCA

PxylABP-Reverse(5′-3′):GCGAATTCTTACAGG AAGATG

下划线为酶切位点(NdeⅠ和EcoRⅠ)序列,酶切位点前为保护碱基。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3.2 小菜蛾触角总RNA的提取和cDNA的合成 取小菜蛾成虫触角50对,DEPC水处理后按试剂盒说明书提取总RNA和合成第1条链cDNA。1.3.3PxylABP基因的克隆与其在大肠杆菌中的表达 取cDNA 50 ng,建立20 μL反应体系:2 μL 10×PCR Buffer,1.6 μL dNTP Mix,0.2 μL rTaq酶,正、反引物各1 μL(10 μmol/L),ddH2O补至20 μL。反应程序:95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共30个循环;72 ℃终延伸10 min,以ddH2O替代cDNA作空白对照。

PCR产物和pET-30b(+)经Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后连接,连接产物转化DH10B,经菌液PCR和验证测序得到重组表达载体pET/30b-PxylABP,将重组表达载体转化BL21(DE3)感受态细胞,挑单克隆37 ℃于LB(Kan质量浓度10 μg/mL)中过夜培养,以1∶100(V∶V)加入到新鲜LB(含抗生素)中,培养至OD600值为0.8时加入IPTG(终浓度为1 mmol/L),诱导5 h,SDS-PAGE电泳检测。

1.3.4 重组PxylABP蛋白的纯化 用1 000 mL LB培养基大量表达pET/30b-PxylABP,检测重组蛋白表达形式(包涵体或者可溶性)后,经阴离子交换树脂(DE-52)和分子筛(Superose-12)进行纯化。

1.4 荧光竞争结合试验

1.4.1 PxylABP蛋白与1-NPN解离常数的测定 设定激发光波长为337 nm,扫描波长350～500 nm,在2 μmol/L PxylABP蛋白中依次加入2～16 μmol/L的1-NPN,反应2 min,荧光强度稳定后记录峰值的红移和强度变化数据。

1.4.2 配体与PxylABP蛋白解离常数的测定 在2 μmol/L PxylABP蛋白中加入4 μmol/L的1-NPN,放置2 min,加入不同浓度的外源配体(表1),扫描发射波长350～500 nm,荧光强度稳定后记录强度值。所得数据均为3次数据的平均值。

表1 不同配基和PxylABP蛋白的IC50值和解离常数K

注:当外源配基浓度达到20 μmol/L时荧光强度未降至50%,则IC50和K值标记为空白。

Note：If the flurorescence intensity has no obvious change when external ligand concentrations reach 40 μmol/L，the IC50and K was recorded as blank.

1.4.3 数据分析 运用GraphPad Prism 5软件测定蛋白与1-NPN的解离常数K1-NPN;运用SPSS Statistics 17.0软件测定配基IC50值。

假定蛋白的活性为100%,饱和状态下与配基结合的比例是1∶1,根据IC50值计算竞争配基的解离常数K=IC50/(1+[1-NPN]/K[1-NPN])

1.5 PxylABP与配体的分子对接分析

1.5.1 PxylABP和配体三维模型的构建 小菜蛾PxylABP三维模型运用Easy Modeller 4.0中同源建模程序包构建,主要包括从蛋白质晶体数据库(www.rcsb.org)中搜索同源蛋白,将目标蛋白序列与模板蛋白序列对比,建立模型及对模型的优化和评估等。

依据荧光竞争结合试验结果选取结合能力最强的化合物并构建其结构。运用ChemBio Office 10.0程序包中ChemBioDraw模块构建配基初始结构,再运用ChemBio3D模块构建其空间结构并进行能量最小化优化。

1.5.2 PxylABP与配体的分子对接 运用分子对接软件AutoDock 4.2进行PxylABP蛋白与配体的分子对接,选择经验自由能函数和拉马克遗传算法(LGA)计算PxylABP与配体的可能构象,对接过程中PxylABP蛋白保持刚性结构,配体设为全柔性结构(所有可旋转键自由旋转),保留对接复合物的10个构象,最后选取自由能最低的构象进行分析[15]。

2 结果与分析

2.1PxylABP基因的克隆和表达载体构建

以小菜蛾触角第1条链cDNA为模板,扩增PxylABP基因,结果如图1所示,PxylABP与pET-30b(+)双酶切后连接,连接结果经测序验证表达载体pET/30b-PxylABP构建成功。

M.标准DNA分子量DL2000；1.空白对照；2.PxylABP基因扩增结果。

M.蛋白分子量标准;1.诱导的pET-30b(+);2.诱导的pET/30b-PxylABP;3.离子交换层析结果;4.分子筛纯化结果。

M.Protein molecular weight Marker;1.Induced pET-30b(+);2.Induced pET/30b-PxylABP;3.Product of ion exchange chromatography;4.Product of molecular sieve purification.

图2 PxylABP蛋白表达、纯化的SDS-PAGE分析

Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression and purification of PxylABP portein

2.2 pET/30b-PxylABP的表达和重组蛋白的纯化

pET/30b-PxylABP经IPTG诱导后,经检测在14.3 kDa附近有1条特异性条带出现(图2泳道2),而经IPTG诱导的pET-30b(+)无此条带(图2泳道1),表明PxylABP基因在BL21(DE3)中正确表达。

大量表达的重组PxylABP蛋白经检测以可溶性形式存在于上清液中,上清液经浓缩后经阴离子交换层析(DE-52)(图2泳道3)和分子筛(Superose-12)(图2泳道4)纯化,分离到重组PxylABP蛋白经检测无明显杂带,说明重组蛋白纯度较高。

2.3 荧光竞争结合试验结果的统计分析

337 nm的发射光激发PxylABP蛋白与1-NPN混合物,扫描350～500 nm波长,在407 nm处出现波峰,峰值增强。

在2 μmol/L PxylABP蛋白中逐步加入1-NPN,使其浓度达到0～16 μmol/L,荧光强度逐步增加(图3),PxylABP蛋白与1-NPN的K1-NPN为2.74 μmol/L;测定与29种外源化合物的结合能力结果如图4和表1所示:异硫氰酸丙烯酯结合能力最强,解离常数K为0.91 μmol/L,己醛、己烷、2-己酮和吲哚次之,解离常数分别为1.81，1.17，2.71，2.74 μmol/L,β-紫罗兰酮最低,K为14.95 μmol/L;其他化合物在浓度达到20 μmol/L时荧光强度没有明显的降低。

图3 PxylABP蛋白与1-NPN结合曲线

2.4 PxylABP蛋白三维模型构建和其与配体分子对接结果分析

运用DS 2.5软件对PxylABP进行同源搜索,发现1个与目的蛋白序列相似性较高的模板,晶体库登录号及相似度分别为1C3Y和32%,构建模型(图5-A中螺旋状结构)Verify Score为44.43接近于Verify Expected High Score值(48.20),Ramachandran Plot图显示氨基酸均在最适区域,说明模型质量较高,经动力学优化后保存模型。

图4 配基与PxylABP蛋白的竞争结合曲线

由于无资料显示小菜蛾PxylABP可能的活性位点,所以在用AutoDock 4.2程序进行分子对接时,设置Grid Box分子对接格点涵盖整个模型,对接体系分子对接格点分别为124×94×84,格点间距为3.75 nm,结合模式如图5所示:配体对接后处于PxylABP结合腔内。

图5-B为PxylABP和异硫氰酸丙烯酯对接相互作用的二维图,由图5可见:PxylABP和异硫氰酸丙烯酯作用有1个氢键形成(虚线),受体为Tyr 100∶O,配体为N,键长为0.31 nm。可见氨基酸残基Tyr100在PxylABP和异硫氰酸丙烯酯结合的稳定性方面具有重要作用。

Helical structure depicts receptor and barred structure depicts ligand in A.

3 结论与讨论

特异性结合外界脂溶性气味分子是OBPs重要的功能之一。目前主要运用荧光结合试验来测定OBPs与气味分子的结合特性,已成功运用于果蝇[16]、家蚕[17]、二化螟[18]、豌豆蚜(Acyrthosiphoupisum)[19]、埃及伊蚊(Aedesaegypti)[11]和苜蓿盲蝽(Adelphocorislineolutus)[20]等多种昆虫OBPs和气味分子的结合试验中,本试验测定了小菜蛾PxylABP与部分绿叶植物挥发物和植物虫害诱导挥发物的结合特性,发现PxylABP与虫害诱导挥发物有较强的结合能力,一般认为虫害诱导的挥发物对捕食性或寄生性天敌具有较强的引诱作用[21-22],说明PxylABP在小菜蛾逃避天敌行为方面具有一定的作用;试验还发现PxylABP对普通的绿叶植物挥发物均不结合,但对十字花科蔬菜特有的气味物质-异硫氰酸丙烯酯结合能力最强,但也有研究表明异硫氰酸丙烯酯是虫害诱导的产物,正常十字花科植物并不含有此类物质[23-24];此外还发现β-紫罗兰酮与PxylABP有微弱的结合力,与之前的研究是一致的[25]。由上述研究可知,PxylABP以某种方式参与了小菜蛾特异的寻找十字花科寄主和感受虫害诱导物的行为。

PxylABP与异硫氰酸丙烯酯的分子对接结果显示,异硫氰酸丙烯酯结合于PxylABP疏水性腔内,对接复合物中有1个氢键形成,氢键具有稳定性、方向性和饱和性,分子间生成氢键可以降低物质的能量,增强化合物稳定性[26],由此推测氨基酸Tyr100在PxylABP识别异硫氰酸丙烯酯过程中具有重要作用,但更精细的研究如结合力中范德华力、静电力溶剂化能等的作用和角色还需经分子动力学模拟的方法进一步研究。

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Study on Binding Pattern of Antennal Binding Protein PxylABP inPlutellaxylostella

DENG Peiyuan1,YUAN Wei2,LI Yuhua1,WANG Linqing1,LI Changkan1

(1.Biological Species Resource Research Center,Zhengzhou Normal University,Zhengzhou 450044,China;2.School of Environmental and Municipal Engineering,North China University of Water Resources and Electric Power,Zhengzhou 450045,China)

Antennal binding proteins are soluble acidic proteins in insect antenna.It is an important way to clarify ABP physiological function by analysising the binding pattern.ThePxylABPgene ofPlutellaxylostellawas cloned using reverse transcription PCR and expressed inEscherichiacoli.The specificity of PxylABP binding with 29 compounds was tested through fluorescence competitive binding assay,and the molecular docking of PxylABP with compounds were carried out using AutoDock 4.2.The results showed that PxylABP protein had binding ability to Allylisothiocyanate,Hexane,Hexanal,Indole,2-hexanone and β-Lonone,with the dissociation constants of 0.91,1.81,1.17,2.71,2.74 and 14.95 μmol/L,respcetively;The molecular docking results showed that one hydrogen bond generated between Tyr100 and Allyl-isothiocyanate.These data suggested that PxylABP might be involved in the physiological process that discriminate the cruciferous vegetables and herbivore-induced plant volatiles inPlutellaxylostella.

Plutellaxylostella;Antennal binding proteins;Fluorescence competitive binding assay;Molecular docking

2016-07-09

河南省科技攻关重点项目(132102110175)

邓培渊(1981-),男,河南登封人,讲师,博士,主要从事昆虫分子生物学研究。

李长看(1967-)，男，河南登封人，教授，主要从事动物生态学研究。

Q78

A

1000-7091(2016)05-0233-06

10.7668/hbnxb.2016.05.036