空间诱变水稻品系T2的稻瘟病抗性分析及抗病基因定位

孙大元,陈冠州,张景欣,周丹华,王　慧,朱小源,杨祁云,陈志强

(1.广东省农业科学院 植物保护研究所,广东省植物保护新技术重点实验室,广东 广州　510640;2.华南农业大学,国家植物航天育种工程技术研究中心,广东 广州　510642)



空间诱变水稻品系T2的稻瘟病抗性分析及抗病基因定位

孙大元1,陈冠州1,张景欣1,周丹华2,王慧2,朱小源1,杨祁云1,陈志强2

(1.广东省农业科学院 植物保护研究所,广东省植物保护新技术重点实验室,广东 广州510640;2.华南农业大学,国家植物航天育种工程技术研究中心,广东 广州510642)

摘要：为了弄清水稻空间诱变稻瘟病抗性变异遗传机理,以一个空间诱变抗稻瘟病突变体T2为研究对象,采取抗谱测定,遗传分析及基因定位等方法,结果发现:2013年晚造T2抗谱达到90.6%,高于部分广东主栽品种;遗传分析表明,其对GD0193的抗性由1个显性主效基因控制,暂命名为PiTH;并通过SSR和InDel标记将该基因定位于水稻11号染色体SSR 标记T5与InDel标记K10之间约1.63 cM 的遗传区域内。目前,该位点包含Pik抗病基因簇,因抗性差异,PiTH可能为该位点一新基因。

关键词：水稻;稻瘟病;抗病基因;基因定位

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae(Hebert)barr)引起的一种水稻全球性的毁灭性病害,严重威胁世界粮食生产安全。据统计,每年因稻瘟病造成的全球水稻产量损失达11%～30%,直接经济损失约50亿美元,损失的粮食足以养活6 000万人口[1]。稻瘟病在水稻全生育期内均可发生,经常在水稻区造成巨大损失。近年来,我国西南、长江中游和东北等几个重要稻区持续大流行,年发病面积高达570万hm2,损失稻谷数亿公斤,给我国的粮食安全带来隐患[2]。长期的生产实践证明,通过鉴定和利用广谱抗性基因进行水稻抗病育种成为了防治病害的有效、经济的策略。然而,由于稻瘟病菌小种致病性的演变和遗传的复杂易变性,新选育的抗病品种往往在推广3～5 年后因为能侵染该品种优势小种的形成而丧失抗性[3]。因此,挖掘新的抗病资源、鉴定新的抗病基因以改良水稻品种的抗病持久性,是当前稻瘟病抗病育种的当务之急。

目前，至少已有84个主效稻瘟病抗病基因位点报道,这些基因成簇地分布于除第3 染色体外的所有水稻染色体上(2个隐性,其他显性),其中,Pb1、Pia、Pib、Pid2、Pid3、Pik、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p、Pish、Pit、Pita、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、pi21、Pi25、Pi36、Pi37、Pi56、Pi63、PiCO39这24个基因已被成功克隆,Pi1、Pik-h/Pi54、Pik-m和Pik-p同为Pik位点上的复等位基因[4]。分离和克隆优异的抗稻瘟病基因,开展分子标记辅助抗病育种,有利于培育具有持久、广谱抗性的水稻新品种。空间诱变育种技术在创造优异新种质、诱导新的基因资源突变和培育农作物新品种上具有其独特的优势和作用,是现代农作物遗传改良的新手段,是未来作物新技术育种的重要组成部分[5]。实践证明,空间诱变手段可有效改良水稻的稻瘟病抗性,并能产生新的抗病基因,具有抗性变异频率高、变异幅度大、有益变异增多等特点,但空间诱变稻瘟病抗性变异的机制很复杂,需要更为系统地研究[6-9]。

广东省农业科学院植物保护研究所长期与国家植物航天育种工程技术研究中心合作研究空间诱变稻瘟病抗性变异机理,通过实践卫星及神舟飞船搭载水稻干种子,获得H4、T1、T2等一批稻瘟病抗性变异突变体。其中T2是水稻品系泰航68经“实践8号”农业卫星进行空间诱变获得的稻瘟病抗性增强的突变体,前期研究表明T2的抗性可以稳定遗传给后代[10]。因此,有必要挖掘其抗稻瘟病基因,作为抗病基因资源,用于抗病育种。本研究通过构建群体对突变体T2进行抗性遗传分析,并应用SSR(Simple sequence repeats)和InDel(Insertion-deletion)对其抗病基因进行了定位。

1材料和方法

1.1试验材料

高感稻瘟病水稻泰航68原种(TC)、突变体T2、丽江新团黑谷(LTH),以及部分原广东省主栽品种三黄占2号、粤香占、粳籼89、青六矮、中二软占、培杂泰丰和粤晶丝苗2号等。

试验所需材料的干种子通过用自来水浸种2 d,置于28 ℃的环境中催芽至露白后,单粒穴播于铝制育秧盘中,秧盘的规格长宽高分别为30,20,5 cm,每盘播种28穴,每穴播放15粒种子,每一个品系分别播到32～36个育秧盘中,每一个品系在一个育秧盘中只播一穴。

选用稻瘟病菌株GD0193为抗性遗传分析菌株,其为籼型致病小种,致病型为 I-01-04;此外,GD0193 可侵染Pik、Pikp、Pi7(t)基因等多个单基因鉴别寄主,其致病谱较广,具有较好的代表性[11]。

1.2稻瘟病抗性鉴定

人工接种鉴定:催芽后将水稻种子播于秧盘中,每盘播28穴,每穴一份材料,均设有抗、感对照,播种2周后接种菌株,2012年早造至2013年晚造分别选用广东省有代表性的稻瘟病优势菌系36,36,32,32个用于接种,接种7 d后调查抗性表现[12]。

自然病圃鉴定:选择广东省粤北稻作区的从化吕田作为稻瘟病自然诱发鉴定圃,叶瘟和穗颈瘟的调查按国际水稻研究所的分级标准执行[12]。

1.3基因组DNA提取,SSR分析及抗、感基因池构建

使用简易CTAB法,从水稻苗期叶片中提取各个材料的基因组DNA[13]。

根据www.gramene.org网站查找到最新的水稻遗传图谱,选择国际水稻微卫星组织(International rice microsatellite initiative)已经公布的RM系列SSR引物。插入缺失(Insertion/Deletion,InDel)多态性标记是借助于(美国)国家微生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中对粳稻与籼稻序列的比较而设计的。先将粳稻品种Nipponbare和籼稻9311已公布的核酸序列进行序列Blast对比,根据对比结果,从中找出两者之间插入缺失在5～20 bp的序列差异,根据差异位点两侧的序列设计引物,用引物进行定位群体亲本间的多态性分析。试验用的所有引物均由上海生工合成。

PCR反应主要在PE公司9700型PCR仪上进行;反应总体积为20 μL,反应混合液包括:1.0 μL的DNA溶液,2.0 μL的10×PCR MIX Buffer,10 μmol/L 的正负引物各0.8 μL,其余由双蒸灭菌水(ddH2O)补足。反应程序:94 ℃预变性3 min,(94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s)32个循环,72 ℃再延伸10 min。扩增产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,快速银染法染色观察结果。

T2与LTH杂交的F2群体经稻瘟病菌株GD0193 接种鉴定抗病性后,分别选取15个高度抗病和15个高度感病个体等量混合其基因组DNA组成抗病池(显性池)和感病池(隐性池)。

1.4抗病基因遗传分析

T2与LTH杂交的F2群体经稻瘟病菌株GD0193 接种鉴定抗病性后,收集感病的F2个体,构建隐性遗传作图群体,采用隐性群体分离法进行遗传连锁分析,重组率按Kosambi作图函数转换成遗传距离(Centimorgan,cM)。

2结果与分析

2.1T2抗谱分析

2012年早造至2013年晚造,分4次对T2和原种TC及部分原广东省主栽品种(三黄占2号、粤香占、粳籼89、青六矮、中二软占、培杂泰丰和粤晶丝苗2号等)进行苗期叶瘟抗病性鉴定,结果见表1。4次抗谱鉴定中,T2的抗谱接近于三黄占2号和粤晶丝苗2号,明显优于原种TC,表明T2对广东省代表性的稻瘟病优势菌系具有稳定抗性表现及广谱抗性。

2012年早造至2013年晚造,分别将T2和原种TC种植于从化吕田稻瘟病鉴定圃进行穗瘟调查,结果见表2。T2 4次穗瘟分别鉴定为3级、5级、5级、0级,表现出抗至高抗水平,而原种TC 4次穗瘟都被鉴定为9级,且发病率达到90%,表现为严重的感病水平。

2.2抗性遗传分析

利用菌株GD0193对T2和原种TC,以及它们杂交衍生的F1和F2群体接种,进行抗稻瘟病遗传分析。GD0193对T2表现为抗病反应,对TC表现为感病反应,对F1表现为抗病反应,表明T2对菌株GD0193的抗性是由显性基因控制的(表3)。2个F2群体对菌株GD0193的抗感分离比均符合3∶1,表明T2对菌株GD0193的抗性是由1个显性基因控制的,暂命名为PiTH。用于构建抗病池的15株单株对菌株GD0193均表现高抗,用于构建感病池的15株单株对菌株GD0193均表现高感。

表1　T2和TC及部分广东省主栽品种苗期稻瘟病抗谱鉴定结果

表2　T2和TC苗期抗谱及田间穗颈瘟抗性鉴定结果

表3　T2对菌株GD0193的抗性遗传分析

2.3抗稻瘟病基因定位

选用均匀分布在水稻12条染色体上的SSR引物630对分别对定位群体F2的亲本LTH和T2进行多态性分析,检测到247对SSR引物在LTH和T2之间具有明显的多态性,多态性频率为39.2%,说明2个亲本间的亲缘关系比较远,遗传背景相差较远,利于抗性基因的定位。进一步利用这247对SSR引物扩增构建好的抗病池和感病池,结果表明只有11号染色体短臂上的RM224和RM27360在两池间表现出明显的多态性。

为了确定PiTH基因位点所在的位置,我们在GRAMENE数据库(http://www.Gramene.org/)中SSR标记RM224和RM27360之间的区域搜索并挑选到公共SSR标记24对,并设计了8对Intel引物;然后用这32个标记对两亲本进行分析,结果表明，只有6对引物RM27342、RM27334、MM0138、T5、K7、K10在抗感亲本间检测到有多态性。

利用上述5对SSR和3对Intel多态性标记对F2群体中获得的总共521个极端感病个体进行连锁分析,结果表明,RM224、RM27360、RM27342、T5、K7和K10 这6对引物与目的基因连锁,其中RM224和T5位于目的基因的左侧区域,分别检测出18,14个重组体,换算成遗传距离分别为1.73,1.34 cM;而K10、RM27342和RM27360位于目的基因的右侧区域,分别检测出3，6，14个重组体,换算成遗传距离分别为0.29,0.58,1.34 cM;此外,标记K7没有检测出重组体,可初步确定其与抗病基因共分离。依据这6个标记与目的基因的连锁关系及遗传距离,构建了覆盖目的基因PiTH的遗传连锁图(图1)。由图可知目的基因被定位在标记T5与K10之间约1.63 cM 的遗传区域,并与标记K7共分离。

图1　PiTH基因的遗传连锁图

3讨论

抗病基因常常在特定染色体区域以基因簇的形式成簇存在[4]。在已报道的84个稻瘟病抗性基因中,半数以上的基因以基因簇的形式分布于水稻的不同染色体区域;其中,6,11,12号染色体上分别存在着Pi2、Pik和Pita3个较大的抗病基因簇。迄今,在第11号染色体上,目前已定位22个抗性基因,多个基因成簇分布于Pik位点附近。Pik位点共鉴定了7个等位基因,Pi1[14]、Pik[15]、Pikh、Pikm[16]、Pikp[17]、Piks和Pi7,它们均由2个紧密连锁且具有完全独立功能的NBS-LRR类基因组成,它们的基因序列高度保守,特别是Pik2位点,SNP则多存在于Pik1位点。在该抗病基因簇区域同样也定位了Pi34[18]、Pi38[19]、Pi44[20]、Pikur2[21]、Pilm2[22]、Pi18[23]及Pi54等抗病基因。本研究中鉴定到的PiTH基因也被定位在这个大基因簇中,推测PiTH可能是Pik位点的一个新的等位基因。

此外,国家植物航天育种工程技术研究中心前期的研究工作中曾多次对Pik位点的等位基因进行系统的分析,发现本研究中所选用的稻瘟病优势菌株GD0193可侵染Pi1、Pik、Pi7、Pikm和Pikp等Pik位点的等位基因的近等基因系[24]。而本研究中连续2年的多次接种鉴定试验表明,突变体T2对菌株GD0193具有稳定的抗性表现,这表明PiTH基因与Pi1、Pik、Pi7、Pikm和Pikp等抗病基因对菌株GD0193的抗性反应是不一样的,而这说明了PiTH基因不是Pi1、Pik、Pi7、Pikm和Pikp等抗病基因中的一个。近期也有研究表明,由于自然界中稻瘟病菌无毒Avr-Pik存在着变异位点,致使与之相互作用的抗病基因Pik位点等位基因存在着抗谱差异和小种特异性[25]。因此,为了进一步明确PiTH基因与Pik位点等位基因之间的关系,需要开展更为深入的研究,包括对PiTH基因的克隆及功能分析,或者开展对菌株GD0193中无毒基因的克隆等。与此同时,具有稳定及广谱抗性的T2可作为一个特异的稻瘟病抗性资源,结合分子标记辅助选择等育种新技术手段,可发挥其独特的育种价值[7,26]。

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Analysis of Resistance to Blast Isolates and Mapping of Rice Blast Resistance Gene in T2

SUN Dayuan1,CHEN Guanzhou1,ZHANG Jingxin1,ZHOU Danhua2,WANG Hui2,ZHU Xiaoyuan1,YANG Qiyun1,CHEN Zhiqiang2

(1.Plant Protection Research Institute,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection,Guangzhou510640,China;2.South China Agricultural University,National Engineering Research Center of Plant Space Breeding,Guangzhou510642,China)

Abstract：To understand the genetic mechanisms of space-induced rice mutants′ resistance to blast,T2,an indica rice mutant from Taihang 68,was researched in this study.Resistant spectrum,genetic analysis and gene mapping were applied in this study.It was found that T2 conferred broader resistance spectrum than most of main cultivars from Guangdong Province.By genetic analysis,the R gene was controlled by a single dominant gene,temporarily designed as PiTH gene,which was further mapped between T5 and K10 on chromosome 11 using SSR and InDel markers.PiTH might be a novel resistance gene in the Pik cluster,which conditioned differential reactions against many isolates and contained higher resistance.

Key words:Rice;Rice blast;Resistant gene;Mapping of rice blast resistance gene

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.002

中图分类号：S435.11

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)02-0007-05

作者简介：孙大元(1984-),男,河南信阳人,助理研究员,博士,主要从事水稻抗病育种研究。孙大元、陈冠州为同等贡献作者。通讯作者：杨祁云(1966-),女,广东揭阳人,研究员,主要从事水稻抗病育种研究。陈志强(1956-),男,广东揭阳人,教授,硕士,主要从事水稻遗传育种相关研究。

基金项目：“十二五”国家“863”计划项目(2012AA101201)

收稿日期：2016-01-20