猪博卡病毒不同基因型三重PCR检测方法的建立及初步应用

宏春慧,杨　兵,覃湘婕,周宏专,徐福洲,苏　霞,薛　静,张晓东,王金洛

(1.北京农学院 动物科学技术学院,北京　102206;2.北京市农林科学院 畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京　100097;3.北京农业生物技术研究中心,北京　100097)



猪博卡病毒不同基因型三重PCR检测方法的建立及初步应用

宏春慧1,2,3,杨兵2,覃湘婕2,周宏专2,徐福洲2,苏霞2,薛静3,张晓东3,王金洛2

(1.北京农学院 动物科学技术学院,北京102206;2.北京市农林科学院 畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京100097;3.北京农业生物技术研究中心,北京100097)

摘要：为鉴别猪博卡病毒1型、2型和3型3种基因型,根据猪博卡病毒基因序列分别设计3对针对保守区域的引物进行PCR扩增,扩增目的片段大小分别为645 bp (PBoV1型)、352 bp(PBoV2型)和259 bp(PBoV3型)。通过引物浓度和退火温度等条件优化,首次建立了同时检测猪博卡病毒3种基因型的三重PCR方法。所建立的三重PCR方法扩增其他猪病病毒结果均为阴性,最低检测限为8×10-7ng/μL。结果表明，该方法具有较好的特异性和敏感性。对临床样品进行三重PCR和单项PCR检测,对比结果显示符合率为100%。该方法的建立为猪博卡病毒3种不同基因型的鉴别检测提供了有效手段。

关键词：猪博卡病毒;基因型;三重PCR;检测

博卡病毒(Bocavirus)为细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属的成员。猪博卡病毒(Porcinebocavirus,PBoV)是2009年在患有仔猪断奶后多系统衰竭综合征的猪淋巴结中,通过随机置换扩增的方法和高通量测序技术在瑞典首次发现[1]。由于对PBoV的研究仍处于起步阶段,其单独的致病性仍未见报道,则有报道认为其与患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、仔猪腹泻等疾病相关[2-3]。临床上,该病毒也可能与其他病原混合感染[4-5],进而造成更严重的经济损失。

PBoV基因组大小在5.2 kb左右,为无囊膜的单股线状DNA病毒[6]。PBoV除了与细小病毒科其他成员共有2个开放阅读框外(编码非结构性蛋白NS1的ORF1和编码重叠的衣壳蛋白VP1和VP2的ORF2),其在非结构性和结构性编码区之中有第3个博卡病毒特征性的开放阅读框ORF3,编码一个高度磷酸化的非结构性蛋白质NP1[7-8]。

研究人员起初按照病毒发现时间的先后顺序,根据ICTV(International Committee on Taxonomy of Viruses,http://www.ictvdb.org/)的分类标准,当NS1基因的核苷酸同源性低于95%时,则定义为不同的基因型[4]。近年来,新的序列甚至新的基因型不断被发现,研究人员通过对基因组序列及NS1/VP1/NP1基因序列遗传进化分析发现,猪博卡病毒属总能出现明显的3个聚簇,根据发现的先后顺序,研究人员将这些聚簇定为3个型:PBoV1、PBoV2和PBoV3[9-10]。

由于PBoV基因型众多,给临床检测带来一定困难。目前,检测PBoV的方法主要有PCR检测[11-13],实时荧光定量PCR检测[14-15]、环介导等温扩增检测(LAMP)[16]及ELISA检测[17]等,但未见能同时检测区分PboV 3种不同基因型研究的报道。本研究根据GenBank公布的PBoV1、PBoV2和PBoV3 3种基因型参考序列的特征,在同源性分析的基础上,找出保守区,进而设计引物,并优化反应条件,建立了一种可以同时检测3种PBoV基因型的方法,可以同时检测出PBoV的单独或混合感染,为临床检测提供了新的技术手段。

1材料和方法

1.1试验材料

1.1.1试剂2×Es Taq MasterMix购自康为世纪生物制品有限公司。质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒、Top10感受态细胞、病毒DNA/RNA提取试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。DL2000 DNA Marker 购自TaKaRa有限公司。RNeasy Mini Kit购自QIAGEN公司。GoldScript cDNA合成试剂盒购自Invitrogen公司。

1.1.2阳性质粒、病毒与临床样品分别含有PBoV1、PBoV2和PBoV3型VP1蛋白编码片段的阳性质粒pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3由畜禽疫病防控技术北京市重点实验室构建保存。猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪库布病毒(PKoV)、猪圆环病毒(PCV)和伪狂犬病毒(PRV)的cDNA/DNA样品和大肠杆菌(E.coli)K88由本实验室制备保存。猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗购自哈尔滨维科生物技术开发公司。猪瘟活疫苗(细胞源)购自上海海利生物技术股份有限公司。临床粪便样品来源于2015年2-8月京津冀地区的部分腹泻猪场。

1.2试验方法

1.2.1引物的设计与合成根据GenBank上公布的PBoV相关的序列信息(表1),利用Lasergene软件套装中的Megalign软件,分析不同型PBoV的保守区,在病毒保守区分析的基础之上,利用Oligo 7软件设计简并引物(表2),并由Invitrogen 公司合成。

表1　本试验参考的PBoV序列

表2　本试验所用的引物

注:引物位置分别对应序列PBoV1(HQ291308)、PBoV2(HQ291309)和PBoV3(JF713714)。

Note:Positions correspond to PBoV1(HQ291308),PBoV2(HQ291309)and PBoV3(JF713714).

1.2.2标准品的制备将含有PBoV1、PBoV2和PBoV3型VP1蛋白编码片段的阳性质粒pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3,用核酸分析仪检测浓度。根据浓度测定结果,将3种质粒用ddH2O稀释至浓度为20 ng/μL,再将其等量混合即为质粒标准品。1.2.3反应条件的优化本试验建立的PCR反应体系为25 μL,其中加入2×Es Taq Master Mix 12.5 μL,pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3阳性混合质粒模板3 μL,引物的起始浓度均为10 μmol/L,引物体积为0.5～2 μL调整,PBoV1/PBoV2/PBoV3引物量(10 μmol/L)选择如下8种组合:0.5 μL/0.5 μL/1.5 μL、0.5 μL/0.5 μL/2 μL、0.5 μL/1 μL/1.5 μL、0.5 μL/1 μL/2 μL、1 μL/0.5 μL/1.5 μL、1 μL/0.5 μL/2 μL、1 μL/1 μL/1.5 μL和1 μL/1 μL/2 μL,以确定最适宜的引物体积。在最佳引物量确定的基础上,进一步优化反应的退火温度,退火温度选择在48～60 ℃内进行优化,以确定最适宜的退火温度。

1.2.4特异性试验猪轮状病毒(RV)样品和猪瘟病毒(SFV)样品RNA分别来源于猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗和猪瘟活疫苗(细胞源),并按RNeasy Mini Kit试剂盒说明书进行抽提。相应cDNA样品按照GoldScript cDNA 合成试剂盒说明书进行反转录获得。大肠杆菌(E.coli)K88 DNA样品按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书制备而成。获取相应模板后,利用建立的三重PCR体系,检测pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3的阳性质粒模板和猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(RV)、猪库布病毒(PKoV)、猪圆环病毒(PCV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(SFV)和大肠杆菌(E.coli)K88的cDNA/DNA样品,以检测所建立的三重PCR体系的特异性。

1.2.5敏感性试验将1.2.2中稀释后等量混合的pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3阳性质粒模板(质粒标准品)10倍梯度稀释后,加入到本试验建立的三重PCR体系,利用最佳引物体积和最适宜反应温度进行扩增,以检测三重PCR体系的敏感性。

1.2.6三重PCR的初步应用来自京津冀地区的临床收集粪便样品,以1∶5(m/V)的比例加入PBS稀释,在涡旋仪上振荡混合后,4 500 r/min,2 min离心后取上清液,分装后存于-80 ℃备用。使用时按照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书提取DNA作为模板进行三重PCR检测。以部分检出过PBoV的临床样品作为模板,使用建立的三重PCR方法和单项PCR方法分别检测,以比较检测结果的符合情况。

2结果与分析

2.1三重PCR反应条件优化结果

不同引物浓度的扩增结果如图1所示,当PCR体系中PBoV1/PBoV2型引物量均为0.5 μL时,PBoV3型条带扩增较好;且PBoV3型引物量为2 μL时,PBoV1/PBoV2/PBoV3型3个目的条带均能得到很好的扩增,条带大小分别为645,352,259 bp,与预期相符。

M.DL2000 DNA Marker;1～8.PBoV1/PBoV2/PBoV3引物量:

在最适宜温度的优化试验中,使用设计的3对引物在48～60 ℃内均能扩增出预期的目的条带(图2)。随着温度的不断升高,PBoV1型目的条带(645 bp)扩增较好,但PBoV2目的条带(352 bp)和PBoV3型目的条带(259 bp)的信号先增强然后变弱。从图2中可以看出当温度为57.8 ℃时,PBoV1/PBoV2/PBoV3型3个目的条带均能得到很好的扩增,且条带大小均与预期相符。

M.DL2000 DNA Marker;1～12.退火温度:48.0,48.3,49.0,50.2,

通过对引物浓度和退火温度的优化,最终确定三重PCR反应体系为:2×Es Taq Master Mix 12.5 μL,PBoV1F/PBoV1R(10 μmol/L)各0.5 μL,PBoV2F/PBoV2R(10 μmol/L)各0.5 μL,PBoV3F/PBoV3R(10 μmol/L)各2 μL,模板3 μL,加双蒸水补足至25 μL;最佳反应条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸35 s,共35个循环；72 ℃延伸5 min。

2.2特异性试验

用建立的三重PCR方法检测pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3阳性混合质粒和单个质粒,均能得到预期的条带;而对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪库布病毒(PKoV)、猪圆环病毒(PCV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(SFV)和大肠杆菌(E.coli)K88的cDNA/DNA样品检测则没有条带出现(图3),说明该方法具有较好的特异性。

M.DL2000 DNA Marker;1.pEASY-BT1/pEASY-BT2/pEASY-BT3

2.3敏感性试验结果

用双蒸水将pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3阳性混合质粒进行10倍梯度稀释,使用建立的三重PCR体系进行扩增。从图4中可以看出,利用该三重PCR扩增体系,阳性模板稀释106后,仍能扩增出相应的目的条带,其最低检测限为8×10-7ng/μL。

M.DL2000 DNA Marker;1～8.100～107倍稀释模板DNA。

2.4临床样品检测结果

利用建立的三重PCR方法,对实验室2015年2-8月间从京津冀地区猪场采集到的12份PBoV阳性粪便样品进行检测,同时与单项PCR检测结果比较。结果显示使用三重PCR体系的扩增结果与单项PCR扩增结果一致,符合率为100%(图5)。

A.三重PCR检测;B.PBoV1型检测;C.PBoV2型检测;D.PBoV3

3讨论

PBoV自2009年发现以来,国内外许多国家均报道了它的流行。然而,PBoV基因型较多,研究认为,其可以分为PBoV1、PBoV2和PBoV 3型。其中,PBoV3型是最大的一个聚簇,其又分为PBoV3A、PBoV3B、PBoV3C、PBoV3D和PBoV3E 5个亚型,3型参考序列间同源性为76.0%～87.9%[10]。由于其基因型众多,为临床检测带来较大困难。本试验根据这一特性,在序列分析的基础上,设计了简并引物。此外,在优化引物浓度时,由于PBoV3的引物中含有较多的简并碱基,而PBoV1和PBoV2的引物中含有的简并碱基较少或不含简并碱基。因此PBoV1和PBoV2的引物选择0.5，1 μL(10 μmol/L)2个浓度梯度,而PBoV3的引物选择1.5,2 μL(10 μmol/L)2个浓度梯度相互组合,用来筛选最适宜的引物浓度。经过进一步优化建立了三重PCR检测体系,其可以在同一反应体系中,同时检测3种亚型PBoV病毒,使得PBoV的检测更加简捷。

多重PCR引物的设计,在普通PCR引物设计基础上,仍需要注意以下3点:除每对引物不形成非特异性扩增外,不同引物对之间在同一体系中,也不形成非特异性扩增;每对引物形成的扩增片段大小要合适,能够在PCR后的凝胶电泳中区分开各扩增片段;每对引物间的退火温度差异要小,以适合使用同一扩增温度进行扩增[18]。本试验设计的3对引物,在进行三重PCR检测时,未见非特异性扩增,其扩增片段大小分别为645,352,259 bp,能够在凝胶电泳中区分目的片段,且在57.8 ℃退火条件下能够扩增出清晰条带,达到了试验预期目的。

在利用本试验建立的三重PCR检测体系检测京津冀地区猪腹泻样品时发现,所有基因型的PBoV均能在京津冀地区的猪腹泻样品中检测到。同时,一份临床样品中,经常能检测到不同亚型的PBoV感染,证明PBoV存在共感染的情况。Jiang等[19]的研究也揭示了共感染这一现象,PBoV的共感染在一定程度上,增加了不同PBoV基因型间发生重组的概率,易产生新的基因型,进而加速PBoV的序列进化。

本试验根据PBoV的序列特性,建立了PBoV的三重PCR方法,在同一体系中可以同时检测3种基因型的猪博卡病毒。试验证实该方法具有较好的特异性和敏感性,并可用于临床样品的检测。该方法的建立为猪博卡病毒3种不同基因型的高效检测提供了有效手段。

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Development of a Triple PCR Method for Identifying Three Genotypes ofPorcinebocavirus

HONG Chunhui1,2,3,YANG Bing2,TAN Xiangjie2,ZHOU Hongzhuan2,XU Fuzhou2,SU Xia2,XUE Jing3,ZHANG Xiaodong3,WANG Jinluo2

(1.Animal Science and Technology College,Beijing University of Agriculture,Beijing102206,China;2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Beijing Key Laboratory for Prevention and Control of Infectious Diseases in Livestock and Poultry,Beijing100097,China;3.Beijing Agro-biotechnology Research Center,Beijing100097,China)

Abstract：To develop a method for identifying three genotypes of Porcine bocavirus,3 pairs of primers against conserved regions were designed according to the published gene sequences of Porcine bocavirus,and the PCR products were 645 bp(PBoV1),352 bp(PBoV2),259 bp(PBoV3),respectively.By optimizing the reaction conditions,a triple PCR method for detecting all three genotypes of Porcine bocavirus was established for the first time.Results showed that no specific band was amplified from other porcine viruses by the triple PCR.The detection limit of the method was 8×10-7ng/μL.The results indicated that this method had not only good sensitivity but also high specificity.The clinical samples were used to detect three genotypes of Porcine bocavirus by the triple PCR and single PCR respectively with the coincidence of 100%.The establishment of the triple PCR method is helpful for identifying the three genotypes of Porcine bocavirus.

Key words:Porcine bocavirus;Genotype;Triple PCR;Detection

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.003

中图分类号：Q78;S436

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)02-0012-05

作者简介：宏春慧(1988-),女,河北衡水人,在读硕士,主要从事免疫与动物疫病防治研究。通讯作者：王金洛(1956-),男,四川自贡人,研究员,博士,主要从事畜禽疫病防治研究。

基金项目：北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX20140409);北京市科技计划项目(Z131100003113015)

收稿日期：2016-02-13