小麦Ta-SKP2A克隆及其酵母双杂交诱饵载体的构建

许　媛,李铃仙,魏春茹,魏新燕,于秀梅,刘大群

(1.河北农业大学 生命科学学院,河北 保定　071001;2.河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心,河北 保定　071001;3.河北省植物生理与分子病理学重点实验室,河北 保定　071001;4.河北农业大学 国家北方山区农业工程技术研究中心,河北 保定　071001)



小麦Ta-SKP2A克隆及其酵母双杂交诱饵载体的构建

许媛1,3,李铃仙1,3,魏春茹1,3,魏新燕4,于秀梅1,2,3,刘大群2

(1.河北农业大学 生命科学学院,河北 保定071001;2.河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心,河北 保定071001;3.河北省植物生理与分子病理学重点实验室,河北 保定071001;4.河北农业大学 国家北方山区农业工程技术研究中心,河北 保定071001)

摘要：SKP2A是调控细胞周期转录因子降解的F-box蛋白。为研究该蛋白在小麦-叶锈菌互作过程的作用,首先克隆获得中国春小麦Ta-SKP2A全长序列,然后将其与pGBKT7载体连接,转入酵母Y187感受态细胞中,构建酵母诱饵表达载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活效应。结果表明,Ta-SKP2A编码区序列长度为1 146 bp,其ORF区编码一条由382个氨基酸组成的多肽。在ORF区两侧连接酶切位点(EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ),并将其与载体pGBKT7连接,成功构建了包含目的基因的诱饵载体pGBKT7-Ta-SKP2A,且含重组诱饵质粒的酵母菌株在 SD/-Trp 营养缺陷平板上生长良好,其过夜培养物OD600>0.8,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性。含重组诱饵质粒的酵母菌株在二缺、三缺及四缺营养缺陷平板上不能生长,表明诱饵质粒的表达产物不能自激活报告基因。成功构建了一个包含Ta-SKP2A的重组诱饵质粒,为深入筛选与其互作的靶蛋白,研究其在小麦-叶锈菌互作体系中的作用机制奠定了基础。

关键词：小麦;F-box基因SKP2A;诱饵载体构建;毒性检测;自激活效应

F-box蛋白是SCF(Skp/Cullin/F-box)复合体中泛素连接酶E3的关键组分,最初因发现存在于细胞周期蛋白Cyclin F 而得名[1]。据报道,植物中存在较多的F-box蛋白,使其成为植物中最大的蛋白质家族之一。拟南芥(Arabidopsisthaliana)中发现1 000多个F-box蛋白[2];水稻(Oryzasativa)中鉴定了687个F-box蛋白[3];耐旱耐瘠薄的作物谷子中发现了525个[4];鹰嘴豆中发现了285个F-box基因[5]。但目前作为重要粮食作物之一的小麦,其中F-box家族基因存在数量尚不明确,因此,急需深入挖掘小麦中的F-box家族基因成员,为研究其功能奠定基础。

F-box蛋白在植物中具有重要的生理功能,广泛参与到植物生长发育[6]、激素信号传导[7-8]、花器官发育[9]、自交不亲和[10]及抵抗生物和非生物逆境的胁迫反应中[11-12]。关于F-box家族基因功能的报道多见于水稻和拟南芥,而在小麦中的功能研究较少。在拟南芥中,F-box蛋白MORE AXILLARY GROWTHY2(MAX2)有助于植物抵抗病原菌的侵染,max2突变体能够增加叶片的气孔导度,从而促进病原菌进入植物的质外体中[13]。 Zhou等[14]在小麦中鉴定出一个耐干旱基因TaFBA1,在转基因烟草中过表达TaFBA1,与野生型相比,植株表现出耐干旱的表型,抗氧化酶的活性增强,表明超表达TaFBA1有助于一些抗氧化基因的上调表达,从而调节植物对干旱的耐性。秘彩莉等[15]对小麦中的耐盐相关基因进行了克隆和分析,获得了一条参与小麦盐耐受性的F-box基因TaUBA。在小麦的根中,该基因的表达受盐胁迫的抑制,而在小麦叶片中,TaUBA的表达只在胁迫早期受盐的抑制,在胁迫晚期(24 h后)其表达又逐渐增强。由此可见,F-box基因参与了小麦逆境胁迫响应过程。然而,与F-box基因互作的上游和下游因子以及具体的生理生化过程还有待于深入研究。

SKP2A是一个与细胞周期相关的蛋白,包含F-box结构域和LRR结构域。该蛋白至少控制着两类细胞分裂转录因子E2FC和DPB的稳定性[16-17]。为研究该蛋白在小麦-叶锈菌互作过程中的作用,本研究利用受叶锈菌侵染的小麦幼叶为试材,首先克隆获得包含完整ORF区的F-box蛋白基因Ta-SKP2A,然后构建包含该基因的诱饵载体,并进行毒性及自激活活性检测,旨在为进一步从小麦酵母双杂交文库中筛选到与其互作的靶蛋白,进而揭示其在小麦-叶锈菌互作过程中的作用奠定基础。

1材料和方法

1.1试验材料

试验所用供试小麦品种为中国春(简称CS)。于小麦一叶一心期接种叶锈菌05-19-43②。接种12 h后剪取叶片,液氮速冷后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2主要试剂

酵母菌株Y187及pGBKT7克隆载体均购自Clontech公司;E.coliDH5α购自TianGen公司;pGEM-T easy载体购自Promega 公司;Biozol RNA提取试剂购自BioFlus公司;SD/-Trp DO Supplement、SD/-Leu/-Trp DO Supplement、SD/-Leu/-Trp/-His DO Supplement、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade DO Supplement、酵母转化试剂盒、酵母质粒提取试剂盒均购自美国Clontech公司;M-MLV反转录酶、T4Ligase均购自 Promega 公司;BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ限制性内切酶、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit均购自 TaKaRa 公司;质粒小量快速提取试剂盒购自博迈德生物公司;Taq聚合酶购自北京泽星生物科技有限公司;胰蛋白胨(Tryptone)购自OXOID公司;酵母无氨基酸氮源、酵母提取物(Yeast extract)均购自上海生工生物工程技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.3试验方法

1.3.1总RNA的提取及cDNA第一链的合成采用Biozol法提取小麦叶片总RNA,cDNA第一链的合成按照M-MLV反转录酶说明书进行。

1.3.2引物设计与合成利用Primer Premier 5.0 软件设计引物,北京六合华大基因科技股份有限公司合成。引物名称及序列见表1。

表1　PCR引物序列及参数

1.3.3小麦Ta-SKP2A基因的克隆以Ta-SKP2A-S和Ta-SKP2A-AS为引物,以上述cDNA为模板扩增Ta-SKP2A基因,PCR扩增程序为:95 ℃预变性5 min;然后95 ℃,30 s,66 ℃,30 s,72 ℃,90 s,9个循环;95 ℃,30 s,61 ℃,30 s,72 ℃,90 s,24个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后,预期目的条带经胶回收纯化后,与pGEM-T easy载体连接,转化E.coliDH5α感受态细胞,经蓝白斑及抗生素抗性筛选后,随机挑取10个白色克隆进行菌落PCR鉴定,选取3个阳性克隆委托北京中科希林测序部进行测序。

1.3.4pGEM-Ta-SKP2A的构建与鉴定以上述获得的阳性质粒为模板,以Ta-SKP2A-EcoRⅠ-S和Ta-SKP2A-BamHⅠ-AS 为引物进行PCR扩增,反应程序为:预变性 95 ℃ 5 min;95 ℃ 50 s,61.2 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,30 个循环;72 ℃延伸 10 min。扩增后获得的目的片段经纯化后与pGEM-T easy载体4 ℃连接过夜,转入E.coliDH5α感受态细胞,蓝白斑筛选获得阳性克隆,经菌落PCR初步鉴定后送北京中科希林测序部进行测序。1.3.5pGBKT7-Ta-SKP2A的构建与鉴定EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切重组质粒pGEM-Ta-SKP2A和pGBKT7空载体,经1%琼脂糖凝胶电泳分离后,回收目的基因片段和载体片段,以目的基因片段和载体片段3∶1的比例连接后转入E.coliDH5α感受态细胞,卡那霉素(Kana,50 μg/mL)抗性筛选阳性克隆。从平板中挑取单菌落接种于LB液体培养基中(Kana,50 μg/mL),37 ℃ 240 r/min振荡培养过夜。对培养物进行PCR检测，对阳性克隆进行质粒提取，对提取的质粒进行双酶切鉴定，阳性质粒进行测序。

醋酸锂法制备酵母菌感受态细胞Y187,按照Clontech公司酵母转化手册进行操作,将转化产物涂布SD/-Trp平板,倒置培养3 d至单菌落长出。按照酵母质粒提取试剂盒说明书提取酵母质粒,以酵母质粒为模板进行PCR扩增验证,阳性质粒进行序列测定。

1.3.6诱饵重组质粒对Y187的毒性检测将构建成功的诱饵载体转入Y187酵母感受态细胞中,将其涂布SD/-Trp平板上,30 ℃倒置培养过夜,观察菌落形态和大小。从SD/-Trp平板中挑取一个较大的单克隆菌落,接种于SD/-Trp/Kan(50 μg/mL)的液体培养基中,30 ℃条件下250 r/min振荡培养过夜(16～24 h),紫外分光光度计法检测菌液OD600值。

1.3.7诱饵重组质粒自激活活性检测将含有重组诱饵质粒的Y187酵母菌株分别涂布在 SD/-Trp、SD/-Trp/-Leu、SD/-Leu/-Trp/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade的平板上,30 ℃倒置培养7 d,观察菌落生长情况。如果所构建的诱饵载体有自激活作用,则含诱饵质粒的Y187菌可在SD/-Trp、SD/-Trp/-Leu、SD/-Leu/-Trp/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生长,否则只能在SD/-Trp平板上生长。

2结果与分析

2.1Ta-SKP2A基因的克隆

Biozol法提取的受叶锈菌侵染的小麦叶片总RNA质量检测结果如图1-A,所提取RNA包含25S rRNA、18S rRNA、16S rRNA、9S rRNA和5.8S rRNA 5条带,表明总RNA完整性较好。进一步通过分光光度法测定,OD260/280比值为1.9～2.0,OD260/230比值为1.85～2.00,表明RNA质量较好,蛋白质和其他有机物以及无机离子的污染很少。

A.小麦总RNA电泳图。B.小麦Ta-SKP2A基因扩增；

以受叶锈菌05-19-43②侵染的中国春小麦叶片cDNA第一链为模板,经RT-PCR扩增,1 000 bp以上可见单一条带,与目的条带大小相近(图1-B)。所获序列经生物信息学分析,发现该序列ORF区长度为1 146 bp,编码一条由382个氨基酸组成的多肽,将该多肽与NCBI数据库中已登记的同源性较高的蛋白质进行比对,发现预测编码的蛋白与乌拉尔图小麦、二穗短柄草、短花药野生稻、粟、荷花、海枣、芝麻、雷蒙德式棉同源性分别为98%,89%,84%,79%,73%,72%,68%,66%(NJ法)。禾谷类作物的F-box蛋白同源性较高(图2),表明F-box蛋白在进化过程中进化比较慢。

2.2目的基因Ta-SKP2A编码区的扩增

利用添加酶切位点的特异引物对包含Ta-SKP2A基因的pGEM T-easy质粒进行扩增后,获得一条大小为1 280 bp的片段(图3),经测序比对,所扩增片段编码区与Ta-SKP2A编码区序列完全一致,在编码区两侧成功添加了EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ 2个酶切位点,且插入方向正确。

Ta-SKP2A.小麦-SKP2A；Tu-SKP2A.乌拉尔图小麦-SKP2A；Bd-SKP2A.二穗短柄草-SKP2A；Si-SKP2A.粟-SKP2A；Ob-SKP2A.短花药野生稻-SKP2A；Pd-SKP2A.海枣-SKP2A；Nn-SKP2A.莲-SKP2A；Si-SKP2A.芝麻-SKP2A；Gr-SKP2A.雷蒙德氏棉-SKP2A。

Ta-SKP2A.Triticumaestivum-SKP2A；Tu-SKP2A.Triticumurartu-SKP2A；Bd-SKP2A.Brachypodiumdistachyon-SKP2A；Si-SKP2A.Setariaitalica-SKP2A；Ob-SKP2A.Oryzabrachyantha-SKP2A；Pd-SKP2A.Phoenixdactylifera-SKP2A；Nn-SKP2A.Nelumbonucifera-SKP2A；Si-SKP2A.Sesamumindicum-SKP2A；Gr-SKP2A.Gossypiumraimondii-SKP2A.

图2Ta-SKP2A系统进化树

Fig.2Phylogenetic tree of Ta-SKP2A amino acid

M.DNA Marker 2000；1～5.Ta-SKP2A的ORF区扩增。

2.3酵母穿梭载体pGBKT7-Ta-SKP2A的构建

将EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切后的pGBKT7和目的基因Ta-SKP2A经过T4DNA连接酶连接,然后转入E.coliDH5α感受态细胞中进行培养,卡那霉素抗性筛选阳性克隆,随机挑取单克隆摇菌培养16 h,提取重组质粒。将重组质粒经EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切后获得约7.3 kb和1 160 bp的2条带,与预期载体片段和目的片段大小一致,测序结果表明插入的核苷酸序列正确,表明诱饵载体构建成功,命名为pGBKT7-Ta-SKP2A(图4)。提取该重组质粒后再将其转化酵母感受态细胞Y187,利用酵母质粒提取试剂盒提取质粒。质粒经双酶切鉴定,获得与预期大小一致的目的条带,测序结果与以前完全一致,表明诱饵载体pGBKT7-Ta-SKP2A已成功转入Y187酵母菌中。

M.DNA Marker DL10000;1.诱饵载体

2.4诱饵载体pGBKT7-Ta-SKP2A毒性检测

pGBKT7-Ta-SKP2A酵母诱饵载体在SD/-Trp平皿中经7 d的培养后,菌落布满平皿,长势良好。单菌落经过夜振荡培养20 h后,OD600吸光度值为2.088,数值远大于0.8,表明诱饵重组质粒对酵母细胞无毒性,证明载体构建成功,为下一步酵母双杂交筛选靶蛋白奠定了基础。

2.5酵母穿梭载体自激活活性检测

含有pGBKT7-Ta-SKP2A诱饵载体的Y187酵母菌株在 SD/-Trp平板中可以正常生长,而在SD/-Trp/-Leu平板、SD/-Leu/-Trp/-His平板以及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板中不能生长,证明pGBKT7-Ta-SKP2A酵母穿梭载体自身不能够激活报告基因的表达,无自激活活性(图5)。

A.SD/-Trp一缺培养基；B.SD/-Leu/-Trp二缺培养基；C.SD/-Leu/

3讨论与结论

F-box蛋白在植物的生长发育及逆境胁迫中发挥重要的调节作用,其通过参与SCF复合体的形成,特异性识别泛素化底物蛋白[18-19],从而实现对泛素化蛋白的降解。据报道,该家族蛋白参与了小麦抵抗白粉病菌的侵染[20],但F-box蛋白是否参与小麦抵抗叶锈菌侵染过程,以及通过何种途径参与,目前尚未可知。为此,本研究对受叶锈菌侵染的小麦中F-box基因进行克隆,并构建其酵母双杂交诱饵载体,为筛选与其互作的靶蛋白,研究其参与的抗病代谢网络奠定基础。

本研究在受叶锈菌侵染的小麦中成功获得了一条F-box基因Ta-SKP2A,其序列长度为1 280 bp,编码382个氨基酸,该基因与中国春小麦的近缘种属乌拉尔图小麦、二穗短柄草、短花药野生稻等的同源性均很高。该基因的获得一方面丰富了人们对小麦中F-box基因的认识,同时也为下一步明确该基因的组织表达特性、与叶锈菌侵染的相关性及其参与的信号网络等奠定了基础,对揭示该基因所编码的蛋白在小麦生长发育及抗叶锈菌侵染中的作用机理具有重要的意义。

酵母双杂交系统是研究蛋白质互作网络及功能的有效手段[21-22]。在植物F-box家族蛋白的互作靶蛋白筛选中发挥重要作用。Qiao等[23-24]利用酵母双杂交技术筛选到金鱼草的S位点编码的F-box蛋白AhSLF-S(2)与S-RNases有直接相互作用,AhSLF-S(2)还与金鱼草的ASK1(Arabidopsis Skp1-like 1)以及Cullin 1 类蛋白相互作用,推测它们可能形成复合体SCFAhSLF-S(2)。此外,利用酵母双杂交技术筛选与拟南芥F-box 蛋白At5g22700和At3g16740互作的靶蛋白,其N端F-box结构域都与拟南芥ASK 家族成员有相互作用,因而推测At5g22700蛋白和At3g16740蛋白都是SCF复合物的家族成员[25-26]。COI1是植物中第一个被证实具有抗病功能的F-box蛋白,Chini等[27]利用酵母双杂交技术筛选到JA阻遏蛋白(Jasmonate ZIM domain protein,JAZ)是SCFCOI1E3泛素连接酶的直接靶蛋白,并且与 COI1 互作。SCFCOI1通过识别JA的活性形式Jasmonoyl-isoleucine(JA-Ile)来促进 JAZ 的降解,从而激活 JA 防御途径[28]。

酵母双杂交系统中,诱饵蛋白若有自激活作用则会激活报告基因的表达造成假阳性的结果[29-30]。诱饵载体的表达产物若对酵母菌产生毒性,则导致酵母细胞不能生长。本研究中将含有诱饵载体的Y187酵母菌进行划线以及摇菌培养,在SD/-Trp平板上生长良好,且在摇菌20 h以内,OD600值超过0.8,表明pGBKT7-Ta-SKP2A诱饵载体对Y187酵母菌无毒性;另外,自激活活性检测结果表明所构建的诱饵表达载体不能激活酵母的转录系统。本试验获得了一条1 280 bp包含完整ORF区的小麦Ta-SKP2A基因,并成功构建了诱饵载体pGBKT7-Ta-SKP2A,为筛选小麦中与之互作的靶蛋白,明确其参与的抗/感病性途径奠定了基础。

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Cloning and Construction of Yeast Two-hybrid Bait Vector of WheatTa-SKP2AGene

XU Yuan1,3,LI Lingxian1,3,WEI Chunru1,3,WEI Xinyan4,YU Xiumei1,2,3,LIU Daqun2

(1.College of Life Sciences,Agricultural University of Hebei,Baoding071001,China;2.Biological Control Centre of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province,Baoding071001,China;3.Key Laboratory of Hebei Province for Molecular Plant-Microbe Interaction,Baoding071001,China;4.National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas,Agricultural University of Hebei,Baoding071001,China)

Abstract：SKP2A is an F-box protein that regulates the proteolysis of cell cycle transcription factors.In order to understand the role of SKP2A in the interaction between wheat and leaf rust pathogen,a full-length sequence of Ta-SKP2A was firstly obtained from wheat cv.China Spring,and ligated with pGBKT7 vector.Recombinant vector was transformed into yeast Y187 competent cell,further detected its self-activated activity and toxicity effect for yeast cells.Results showed that Ta-SKP2A was 1 146 bp and encoded a polypeptide of 382 amino acids.The ORF with restriction enzyme sites of BamH I and EcoR I was inserted into expression vector pGBKT7.The results showed that the bait vector pGBKT7-Ta-SKP2A was successfully constructed by sequencing.The recombinant bait plasmid grew well on SD/-Trp plate,which showed that the bait plasmid was not toxic to yeast cell.The yeast strains containing bait plasmid couldn′t grow on SD/-Leu/-Trp,SD/-Leu/-Trp/-His and SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade plate,so the bait plasmid didn′t have transcriptional activation.A recombinant bait plasmid with Ta-SKP2A was successfully constructed,which would lay foundation for screening for targeted protein interacted with Ta-SKP2A,and would help to understand its function in the interaction of wheat and leaf rust pathogen.

Key words:Wheat;F-box gene Ta-SKP2A;Construction of bait vector;Toxicity detection;Transcriptional activation

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.004

中图分类号：Q784

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)02-0017-06

作者简介：许媛(1987-),女,河北沧州人,在读硕士,主要从事生物化学与分子生物学研究。通讯作者：刘大群(1958-)，男，河北灵寿人，教授，博士，主要从事植物病害生物防治和分子植物病理学研究。于秀梅(1976-)，女，黑龙江肇源人，副教授，博士，主要从事生物化学与分子生物学研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(31301649);高等学校博士学科点专项科研基金项目(20121302120010)

收稿日期：2016-02-11