天津地区番茄褪绿病毒的分子检测与基因组部分序列分析

金凤媚,薛　俊,宋　建,于海涛,段红英

(1.天津市农业生物技术研究中心,天津　300192;2.天津市西青区植物保护站,天津　300380)



天津地区番茄褪绿病毒的分子检测与基因组部分序列分析

金凤媚1,薛俊1,宋建1,于海涛1,段红英2

(1.天津市农业生物技术研究中心,天津300192;2.天津市西青区植物保护站,天津300380)

摘要：为了确定天津番茄产区是否发生了番茄褪绿病毒病,了解该病毒天津分离物的主要基因是否发生变异,对该地区发生的ToCV 进行了分子检测,并对该病毒的外壳蛋白(CP)和热激蛋白70类似物(Hsp70h)的核苷酸和氨基酸进行了序列分析。结果表明,天津分离物CP蛋白的核苷酸和氨基酸序列与已报道的具有代表性的不同国家的分离物相似性均在97.3%以上。Hsp70h蛋白的核酸和氨基酸序列与已报道的具有代表性的不同国家的分离物相似性均在97.2%以上。表明CP和Hsp70h蛋白是2个最保守的蛋白。这是首次在分子水平上证明番茄褪绿病毒在天津地区为害。

关键词：番茄褪绿病毒;分子检测;外壳蛋白;热激蛋白70类似物;基因序列分析

番茄(LycopersiconesculentumMill.)是我国设施栽培的主要蔬菜作物之一,在蔬菜周年供应上占有重要地位。番茄病毒病一直是影响番茄产量的重要病害。番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus,ToCV)自20世纪90年代在美国发现以来,已在世界多地相继发生,并造成了严重的损失[1-5]。番茄褪绿病毒(ToCV)属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus),为正单链RNA病毒。2013年以来在我国的北京、山东、河南、河北及南京等地的番茄生产区陆续报道发现了番茄褪绿病毒[6-12]。感染该病毒的番茄植株,下部叶片首先发病,发病初期叶片脉间变黄,叶脉颜色加深,叶片增厚,植株死亡,极大降低了番茄品质与产量[13]。

番茄是天津地区的主要蔬菜作物,在蔬菜产业中占有重要地位。自2014年11月以来,天津部分番茄产区如西青第六阜和工农联盟一带及宝坻的方家庄等地,陆续发现了疑似番茄褪绿病毒的植株。由于其症状非常类似营养缺失的褪绿黄化,很多农户作为缺素症来进行防治,喷施了大量营养肥亦未见好转，严重影响了坐果和产量,给当地的番茄生产造成了巨大的损失。因此,开展天津地区番茄褪绿病毒病检测鉴定对于明确番茄褪绿病毒的病源及进行综合防治具有重要意义。本研究利用分子生物学技术对天津番茄主产区的病株样本进行了病原分子鉴定,并对获得分离物的2个保守蛋白—外壳蛋白(Coat protein,CP)和热激蛋白(Heat shock protein 70,Hsp70)的变异情况进行了初步分析,以期为番茄褪绿病毒病的诊断和防治提供科学依据。

1材料和方法

1.1试验材料

1.1.1病样来源2014年11-12月在天津市西青区第六阜日光温室番茄栽培田中,采集叶脉间变黄、叶脉颜色加深等典型症状的叶片样本,保存于-80 ℃冰箱,用于核酸提取的后续试验。以健康的番茄植株叶片作为对照。

1.1.2 菌株和试剂大肠杆菌DH5α、T-easy、RNA提取试剂、RNase Inhibitor、M-MLV均购自宝生物(大连)工程有限公司。

1.2试验方法

1.2.1番茄叶片总RNA的提取及第一链扩增取发病的番茄叶片0.1 g,加液氮研磨成粉,按RNA提取试剂盒进行总RNA的提取。反转录体系:模板RNA 1 μL,Random 引物1 μL,dNTP 0.5 μL,用DEPC处理水补足10 μL。70 ℃变性10 min,置于冰上2 min后,加入下列试剂:5×M-MLV Buffer 5 μL,RTaseM-MLV 1 μL,RNAase Inhibitor 0.5 μL,总体积10 μL。37 ℃保温1 h。

1.2.2引物设计与合成根据Dovas等[14]设计的1对检测ToCV的引物,用于扩增该保守区的450 bp的片段,引物名称为ToC5 /ToC6(表1)。为了增加检测的可信度,同时利用扩增ToCV的CP部分基因的引物进行检测,引物名称为CP-F/CP-R[15]。根据GenBank登录的序列信息,利用Primer 3设计引物HSPF/R和HSP2F/R,用于扩增ToCV的Hsp70h。引物序列由宝生物(大连)工程技术有限公司(TaKaRa)合成。

表1　本研究中用到的PCR引物

1.2.3PCR扩增及产物克隆PCR总体积为25 μL,其中包括10×反应缓冲液(含Mg2+)2.5 μL,dNTP混合物(2.5 mmol/L)0.5 μL,上游引物(10 μmol/L) 2.5 μL,下游引物(10 μmol/L)2.5 μL,模板 DNA 0.5～2.0 μL,DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL,其余用水补足。反应程序:94 ℃变性2 min;94 ℃30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃1.5 min,35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR 产物分离纯化后,克隆到T-easy载体(按试剂盒说明操作)。自动测序由TaKaRa公司完成,测序时选取2个阳性克隆,双向测序。

1.2.4序列分析利用Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列比较,DNAMAN Version 5.22 (Lynnon Biosoft,Quebe Canada)和MEGA 6.0进行序列比较和进化树的构建及同源性分析。

2结果与分析

2.1分子鉴定结果

对西青区2个产地采集的20个具有典型症状的病株样品,进行RNA提取和RT-PCR检测。利用引物ToC5/ToC6,进行PCR扩增,获得1条预期大小约450 bp的特异片段(图1)。利用CP-F/CP-R扩增出了840 bp大小的条带(图2)。利用DNAMAN对序列进行分析,获得了ToCV的外壳蛋白的全长序列。目前已将该序列登录到 GenBank中,序列号为KP246844。初步证明该病是由番茄褪绿病毒ToCV引起。

图1　ToC5/ToC6引物PCR扩增

2.2番茄褪绿病毒的CP基因和蛋白序列比较

利用GenBank中的Blast程序对天津地区发生的ToCV基因组部分序列进行相似性检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。由于与其相似的序列众多,选择了一些具有代表性的分离物序列来进行同源性的比较。这些序列为国内目前已报道的发生番茄褪绿病毒的分离物以及世界不同地区有代表性的分离物(表2)。

图2　CP-F/CP-R引物PCR扩增

序号No.毒株 Isolates 年份Year国家Country登录号 Accession 1SDSG2013中国山东KC7095102BJ2013中国北京KC8879993HP2015韩国KP1145374Florida2006美国AY9034485Saopaulo2012巴西JQ9526016Gr-5352008西腊EU2847447Bouches-du-Rhone2009法国EU6253508AT80/99-IC2014西班牙KJ7402579Tochigi2010日本AB513442(HSP)AB513443(CP)

利用生物信息学软件Mega 5.0对ToCV病毒CP蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列进行系统进化树分析(图3,4)。结果表明,大部分国家和地区分离物的核苷酸形成一个大分支，只有法国分离物形成单独分支。蛋白的分析表明法国和西班牙在一个分支上，其他分离物在一个大分支上。说明不同地区和国家的分离物进化关系很近。只有法国和西班牙与其他地区在蛋白水平上的进化关系较远。

利用DNAMAN进行相似性分析,表明ToCV天津分离物的CP蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列与表1中所列的亚洲国家和地区,如韩国、日本、山东、北京、巴西、希腊、美国的分离物同源性均在99.0%以上,与西班牙、法国的分离物相似性为97.3%以上(图4)。证明ToCV在全世界范围内的变异频率不是很高,保守性很强,这也符合CP蛋白的特点,而且该病毒的基因变异大部分属于无义突变。

图3　CP基因的系统进化树

2.3番茄褪绿病毒的Hsp70h基因的克隆和核苷酸及蛋白序列比较

2.3.1番茄褪绿病毒的Hsp70h基因的克隆对所采集的病株样品进行Hsp70h基因的RT-PCR检测。通过NCBI查找到相关的ToCV序列,利用HSPF/R引物扩增出了1 021 bp大小的条带(图5),利用HSP2F/R基因扩增出了911 bp的条带(图6)将2条片段进行回收克隆并测序,然后将测序结果进行拼接,得到了ToCV热激蛋白天津分离物(HSP-TJ)的全序列(登录号为KP893120)。

图4　CP蛋白的系统进化树

图5　HSPF/R引物PCR扩增

图6　HSP2F/R引物PCR扩增

2.3.2番茄褪绿病毒的Hsp70h基因核苷酸及蛋白序列比较系统进化树分析结果表明,除法国分离物以外,其余的各地区的分离物形成一个大分支,其中山东和北京的分离物关系最近,日本和韩国分离物关系最近,巴西和希腊关系较近,而天津的分离物与西班牙分离物关系较近(图7,8)。

图7　Hsp70h基因系统进化树

在核苷酸水平上,天津分离物与中国其他地区的分离物以及亚洲(韩国、日本)、美国、巴西、希腊、西班牙的相似性均为99.3%以上,与法国的相似性为98.5%。在氨基酸水平上,天津分离物与山东、北京、亚洲、巴西和西班牙的分离物相似性为98.0%以上;与法国分离物的相似性为97.2%。从同源性分析可以看出，虽然各地区分离物形成了不同的分支，但相似性均在97.2%以上，变异性不大，这也证明了Hsp70h是该科病毒最保守的蛋白之一[16]。在分离物之间的比较可以看出,地理距离较近的亚洲各分离物之间同源性均达到了100.0%。天津和法国的分离物核苷酸的同源性为98%，而氨基酸的同源性为97.2%,说明在Hsp70h基因的核苷酸发生了插入或缺失突变,从而导致了氨基酸的变异。

图8　Hsp70h蛋白系统进化树

3结论与讨论

本试验结果表明,在天津地区发生的番茄褪绿病确为番茄褪绿病毒(ToCV)引起,这是首次在分子水平验证该病毒在天津地区的发生。番茄植株感病后主要表现为叶片脉间黄化,类似缺素症。叶质变脆易碎[17]。以植株下部叶片明显,上部新叶不明显，植株感病后坐果少。我们对该病毒在分子进化中较保守的外壳蛋白CP和热激蛋白Hsp70h[16,18]进行的克隆和序列分析表明,ToCV天津分离物的外壳蛋白核苷酸及序列和氨基酸序列与空间距离较近的山东、北京、韩国、日本、美国的同源性为99.0%以上，与空间距离较远的西班牙、法国等国家的同源性为97.3%以上。这在一定程度上说明此病毒的地域性很强。同时它又与空间距离较远的美国分离物的同源性也在99.0%以上，这可能是人类的贸易活动携带了染有病毒的番茄种子或介体，从而使两地的病毒基因序列相似性高。通过对Hsp70h蛋白的分析也能看出病毒传播的地域性很强,如地理距离较近的亚洲各分离物之间相似性均达到了100.0%。

近年来,在天津地区的番茄上发生的主要病毒病为番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)[19],番茄褪绿病毒的传播介体与番茄黄化曲叶病毒一样可由烟粉虱传播,且在各型烟粉虱上均能有效传播[20]。所以在生产上,经常能发现此2种病毒复合侵染的现象。对该病的防治,在没有抗病品种问世之前,主要还是预防传播介体烟粉虱的发生。虽然目前在天津的其他番茄产区还未见具有明显症状的病株,但随着番茄种苗在不同地区的调运,也会加速该病毒的广泛传播,所以相关部门要加强对该病的检测及传播介体的防治,以最大限度地预防该病毒的传播。

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Molecular Detection and Partial Genome Sequence Analysis ofTomatochlorosisvirusin Tianjin

JIN Fengmei1,XUE Jun1,SONG Jian1,YU Haitao1,DUAN Hongying2

(1.Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology,Tianjin300192,China;2.Tianjin Xiqing District Plant Protection Station,Tianjin300380,China)

Abstract：The purpose of this study was to determine whether the tomato plants in Tianjin was infected by Tomato chlorotic virus (ToCV) and whether variation had occurred in the important genes of ToCV.ToCV isolated in Tianjin was diagnosis at molecular level.The genome sequence of coat protein and heat shock protein had been cloned and analyzed.The results showed that the homology of the CP isolate in Tianjin was 97.3% or more with the representative isolates of different countries and regions.The homology of the Hsp70h isolate in Tianjin was 97.2% or more with the representative isolates of different countries and regions.It is proved that Hsp70h and CP protein are the most conserved proteins.This is the first report of Tomato chlorosis virus occurrence in Tianjin.

Key words:Tomato chlorosis virus;Molecular detection;CP;Hsp70h;Genome sequence analysis

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.005

中图分类号：S436.412

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)02-0023-05

作者简介：金凤媚(1977-)，女，天津人，副研究员，硕士，主要从事番茄分子育种研究。

基金项目：天津市农业科技成果转化与推广项目(201302040)；国家星火计划(2015GA610002)

收稿日期：2015-12-10