甘蓝型油菜TIP4;1基因的克隆与表达分析

葛风伟,江　一,赵惠新

(新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室,新疆师范大学 生命科学学院,新疆 乌鲁木齐　830054)



甘蓝型油菜TIP4;1基因的克隆与表达分析

葛风伟,江一,赵惠新

(新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室,新疆师范大学 生命科学学院,新疆 乌鲁木齐830054)

摘要：水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白。为了分析甘蓝型油菜种子萌发过程水分调控的分子机制,采用RT-PCR法从甘蓝型油菜种子中克隆了液泡膜内在蛋白(Tonop last intrinsic proteins,TIPs)TIP4;1基因片段序列,并对甘蓝型油菜种子TIP4;1基因在种子萌发过程及干旱、低温和盐胁迫下的表达进行了qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)分析。结果表明,TIP4;1基因在干种子中表达水平很低,但是在种子萌发过程中表达量增加。此外,在干旱、低温及盐的胁迫处理下,TIP4;1基因的表达上调,结果暗示着该基因可能参与了甘蓝型油菜种子萌发和逆境响应过程。随着研究的深入,水孔蛋白的水分调控机制将进一步被揭示,这对于解决干旱胁迫和盐胁迫等实际问题具有重大现实意义。

关键词：甘蓝型油菜;水孔蛋白;TIPs;萌发;qRT-PCR

植物很多生长发育过程都依赖水分在细胞间的流动,水分对于作物的产量也至关重要[1]。水孔蛋白(Aquaporin,AQP)属于通道蛋白MIP超家族成员,AQPs可以实现水分等其他小分子溶质的跨膜运输[2-3]。高等植物的AQPs主要位于质膜和液泡膜上,分别称之为质膜内在蛋白(Plasmaintrinsicprotein,PIPs)、液泡膜内在蛋白(Tonoplastintrinsicproteins,TIPs)[4-7]。AQPs普遍存在于植物中,在种子萌发、细胞伸长、受精、逆境应答等植物生长发育过程中发挥关键作用[8-12]。特别是在种子吸水和早期胚胎发育阶段,AQPs是水分跨膜运输的主要途径[13]。另外,植物AQPs的表达受到环境条件和植物激素的调节,已知干旱、高温、低温、高盐和营养亏缺等环境胁迫均可调控AQPs的表达[12,14-16]。

迄今有关植物AQPs的研究主要集中在PIPs上。但有研究表明,TIPs的导水性能是PIPs的上千倍,更利于水分的快速转移,因而其在细胞渗透压及植物水分代谢的快速调节中可能起着更为重要的作用[17-19]。Sade等[19]研究发现,转基因番茄(Solanum lycopersicum)株系SlTIP2;2的过量表达可使其液泡膜在盐胁迫和干旱胁迫下依然具有很高的水通透性,并得以维持液泡对细胞质渗透压的缓冲作用和提高抗逆性。植物AQPs的发现及其表达与调控研究无疑为人们从分子水平深入探讨和阐明植物水分代谢及其调控机制提供了很好的契机。

甘蓝型油菜(Brassica napus)属于十字花科芸薹属双子叶植物,是世界上主要的油料作物。迄今对于植物中水孔蛋白AQPs的研究大都集中在拟南芥、水稻、烟草、玉米等模式植物上,但有关甘蓝型油菜水孔蛋白AQPs基因尤其是TIPs亚类基因的克隆和研究甚少。此外,对该基因在甘蓝型油菜种子萌发过程中水分调控的分子机制还不清楚。种子萌发的质量直接决定幼苗的形态建成及后期的产量。因此,TIP基因的研究对于理解种子的萌发过程有重要意义。

1材料和方法

1.1试验材料与试剂

试验材料为当年新收获的甘蓝型油菜种子。TRIzol总RNA抽提试剂盒、MMLV第一链cDNA反转录试剂盒购自宝生物公司,DNA凝胶回收试剂盒、PCR扩增试剂盒购自北京天根生化科技有限公司,菌株为E.coliDH5α(新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室保存),质粒为pMD18-T Vector(Invitrogen),其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2甘蓝型油菜TIP4;1基因的克隆

1.2.1试验材料培养与总RNA的提取甘蓝型油菜种子置于23 ℃恒温箱中培养。收集吸水萌发后48h的种子,快速冷冻到液氮中,用于总RNA的提取。采用TRIzol法提取RNA,用紫外分光光度法测定RAN的OD值,检测其纯度。

1.2.2引物设计及RT-PCR扩增根据TIPs基因进化保守的特点,利用ClustalX软件对从NCBI数据库中搜索到的植物TIPs基因序列进行同源性比较,在保守区域找出保守区段。利用Primer5.0设计1对引物用于RT-PCR分析,上游引物F:5′-AGTCCAATACTGGTCATCCG-3′;下游引物R:5′-GATTTTGAGGGAAGCGGT-3′,引物由华大基因合成。取2μg甘蓝型油菜总RAN,根据MMLV第一链cDAN反转录试剂盒(TaKaRa)合成第一链cDNA。以第一链cDNA为模板,用合成的特异性引物进行RT-PCR扩增分析。PCR扩增体系:cDNA2μL,F、R(10μmol/L)各1μL,MgCl2(25mmol/L)1.5μL,Taq酶0.5μL,10×PCRBuffer2.5μL,dNTPMixture(2.5mmol/L)2μL,用灭菌超纯水定量补足至25μL。PCR反应程序:94 ℃预变性3min;94 ℃ 30s,64 ℃ 45s,72 ℃ 60s,共35个循环;最后72 ℃再延伸10min。获得的扩增产物用1.0 % 琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR扩增产物按照凝胶回收试剂盒(AxyGEN)说明进行纯化回收。

1.2.3重组质粒的构建取2μL回收产物连接到pMD18-T载体,重组质粒构建按照说明书进行。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,置于37 ℃ 培养箱过夜培养,蓝白斑筛选重组质粒。

1.2.4测序分析挑取单克隆菌落,进行PCR鉴定,并将阳性单克隆送上海英骏生物技术公司测序。测序结果使用Blast算法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行分析。

1.3TIP4;1基因的qRT-PCR分析

1.3.1特异性引物的设计由于TIPs基因家族高度保守性的特点,因此进行qRT-PCR分析时设计特异性的引物显得非常关键。使用Primer5软件设计基因特异性引物,原则是设计引物时尽量避开这些保守区。为此,首先使用ClustalX软件对NCBI上搜索到的植物TIPs基因进行核酸序列的同源比对,并找到这些序列的保守区,在设计特异性引物时尽量避开这些保守区。另外,对于设计的每对引物,至少都要保证有一条引物的3′ 末端是高度特异的。设计出1对特异性引物,上游引物:5′-CTCGTGCTTGCTGTATCTT-3′;下游引物:5′-CGGGAGTGACTTATTCGG-3′。为了保证每对引物的特异性,需将每对引物扩增的PCR产物送公司测序。

1.3.2TIP4;1基因在不同组织的表达分析为了分析不同器官中TIPs基因的表达情况,收集了种植于大田的甘蓝型油菜植株的根、茎、叶、花和21DAP种子的材料,用于总RNA的提取。

qRT-PCR分析方法如下:使用qRT-PCR特异性引物,以不同组织的cDNA第一链为模板,在StepOneReal-timePCRsystem(ABI)上进行qPCR扩增。本试验以甘蓝型油菜的β-actin(序列号No.AF111812)作为内参。qRT-PCR的扩增程序如下(两步法):95 ℃预变性10min;95 ℃ 15s,60 ℃ 60s,运行40个循环;接下来步骤是60～95 ℃的融解曲线。通过双标准曲线法分析甘蓝型油菜TIPs基因的相对表达量,用“平均值±标准差”来表示基因的相对表达量。每个试验进行3次生物学重复。

1.3.3种子萌发过程TIP4;1基因的qRT-PCR分析在直径为9cm的培养皿中铺2层滤纸,用4mL灭菌去离子水充分浸润滤纸,挑选完整的甘蓝型油菜种子50粒均匀排列在培养皿中(设置3个重复),于23 ℃恒温箱中培养。分别收集不同吸水时期(0,6,12,24,48,72,96,120h)的种子材料,快速冷冻到液氮中,用于总RNA的提取。qRT-PCR分析方法参见1.3.2。

1.3.4逆境胁迫下TIP4;1基因的qRT-PCR分析为了研究种子萌发过程中非生物胁迫对TIP基因表达的影响,设置了干旱、低温和盐胁迫3种处理。在PEG干旱胁迫处理中,使种子在20%PEG6000溶液中萌发。分别于PEG处理后的6,12,24,48,72h收集整个种子材料,快速冷冻于液氮中用于总RNA提取。在低温胁迫处理中,将种子置于12 ℃的低温下萌发。低温胁迫取材时间与PEG胁迫处理时间相同,之后将材料快速冷冻于液氮中,用于总RNA的提取。在盐胁迫处理中,将种子置于150mmol/LNaCl溶液中萌发。分别于NaCl胁迫处理后的6,12,24,48h收集整个种子并冷藏于液氮中,用于总RNA的提取。将种子置于纯水中萌发相应的时间(6,12,24,48,72h)作为对照。对于每种处理,均分3次收集材料作为生物学重复。qRT-PCR分析方法参见1.3.2。

2结果与分析

2.1总RNA质量检测

将甘蓝型油菜种子的总RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳分析(图1),结果显示28S、18S和5S条带整齐清晰,且28S基本为18S亮度的2倍,表明所提总RNA完整性较好,没有降解。紫外分光光度检测OD260/280为1.8～2.0。检测结果表明,总RNA的纯度、完整性都比较高,适用于下一步的RT-PCR分析。

2.2甘蓝型油菜TIP4;1基因片段的PCR扩增

以反转录的第一链cDAN为模板,经PCR扩增得到了600bp左右片段(图2)。该片段与预期目的片段的大小相一致。对此扩增产物进行琼脂糖凝胶回收,将回收的产物连接到pMD18-T,并转化大肠杆菌DH5α细胞中进行菌落培养,挑取白斑进行菌落PCR扩增。得到的片段与上述以cDAN为模板得到的扩增产物长度相同,证明PCR扩增的片段已克隆到pMD18-T载体上。

图1　总RNA的提取

M.DNA分子量(DL2000);1.TIP4;1基因;2.阴性对照。

2.3甘蓝型油菜TIP4;1基因的测序及分析

测序结果表明,所获得基因长度为599bp(图3),编码91个氨基酸残基。Blast比较结果显示:该片段的核苷酸序列与其他植物TIP4;1基因的核苷酸序列的同源性均为74%～99%,其中同源性最高的是甘蓝型油菜,为99%(XM_013837778),与拟南芥的同源性为89%(NM_128141),所以将其命名为TIP4;1。为了获得更准确的信息,用BlastX继续同源搜索,因为该程序将核酸序列翻译成蛋白进行搜库,所以获得的信息更准确。BlastX同源搜索结果表明,所克隆的基因具有AQPs超基因家族特有的保守结构域(图4),因此,推测其为AQPs超基因家族的TIPs亚家族成员。

图3　甘蓝型油菜TIP4;1基因序列

图4　甘蓝型油菜TIP4;1蛋白保守结构域

2.4甘蓝型油菜TIP4;1基因表达的qRT-PCR分析

2.4.1甘蓝型油菜TIP4;1基因在植株不同器官中的表达为了研究TIP4;1基因的表达模式,采用qRT-PCR方法分析了该基因在甘蓝型油菜生殖生长期植株不同器官的表达情况(图5)。分别以根、茎、叶和花器官的cDNA第一链为模板进行qRT-PCR扩增。结果表明,TIP4;1基因在根、茎、叶和花器官都有表达,且在花器官中的表达量最高。

栽种于大田间7月龄植株的上述器官用于总RNA的提取。甘蓝型油菜β-actin作为内参基因。相对表达量采用TIP4;1的表达量与β-actin的表达量之比(AQP/ACTIN)来表示。纵轴表示基因的相对表达量“平均值±标准差”。每个试验进行3次生物学重复。图6同。

TotalRNAwasextractedfromvarioustissuesof7-monthold

plantsgrowninfield.B.napus β-actinwasusedasaninternalcontrol.

ThetranscriptlevelsofTIP4;1genecomparedtoACTIN(AQP/ACTIN)

wereplottedastherelativeexpressionlevel.Theverticalcolumnindicates

therelativetranscriptlevel.Thevaluesaremeans±SDofthree

biologicalreplicates.ThesameasFig.6.

图5TIP4;1基因在根、茎、叶、

花和受精21d的种子中的相对表达

Fig.5TherelativeexpressionlevelsofTIP4;1inroots,

stems,leaves,flowersand21DPAseedsbyqRT-PCR

2.4.2甘蓝型油菜TIP4;1基因在种子萌发过程中的表达为了进一步研究TIP4;1基因的表达模式,采用qRT-PCR分析其在甘蓝型油菜种子萌发过程及幼苗阶段的表达(图6)。分别以吸水0,6,12,24,48,72,96,120h的种子为材料提取总RNA,之后以反转录的cDNA第一链为模板进行qRT-PCR分析。通过种子萌发试验,发现干种子吸水12h,萌发率达到56%;吸水24h,所有的种子已经完成了萌发。定量分析结果表明,TIP4;1基因在干种子中不表达,但吸水6h后检测到该基因的表达,且在吸水后12h达到最大水平,之后在幼苗阶段(24～120h)维持相对高的转录本水平。

图6　TIP4;1基因在种子萌发过程与幼苗阶段的表达情况

2.4.3干旱、低温和盐胁迫对TIP4;1基因表达的影响为了进一步研究逆境胁迫对TIP4;1基因表达的影响,分别用20%PEG6000和12 ℃低温处理种子6,12,24,48,72h;用150mmol/LNaCl处理种子6,12,24,48h,之后按上述各处理时间分别提取总RNA。种子在正常情况下(21 ℃)萌发作为胁迫处理的对照。

结果显示(表1),TIP4;1基因的转录水平在PEG处理12h之内快速下降到对照的十分之一。在PEG处理24h后,TIP4;1基因的转录水平出现明显上调,是对照的2倍,但之后快速下降到对照的二分之一。低温胁迫处理后,TIP4;1基因的表达出现上调趋势,表达量最高可达对照的1.6倍。在150mmol/LNaCl的胁迫处理下,TIP4;1基因的表达快速上调,可达对照的1.4倍。胁迫处理24h后,TIP4;1基因的表达再次上调,是对照的3倍。

3结论与讨论

植物AQPs主要位于质膜和液泡膜上,分别称之为质膜内在蛋白PIPs和液泡膜内在蛋白TIPs。根据C端和N端的特征,将分布于液泡膜上的TIPs分为TIP1～TIP5 5个亚类。植物中第一个水孔蛋白γ-TIP是由Maurel等[20]从拟南芥中分离出来,该基因在爪蟾卵母细胞中的异源表达证明它具有水分运输特征,属于植物水孔蛋白中的TIPs。如今,许多模式植物整套水孔蛋白基因已经被成功克隆和鉴定,而对于最重要的油料作物之一甘蓝型油菜来说,由于缺乏详细的基因组数据信息,其大部分水孔蛋白AQPs的序列信息至今仍然未知。基于以上分析,从甘蓝型油菜种子中克隆1个TIP4;1基因,Blast比较分析表明该基因属于AQPs基因家族的TIPs亚家族成员。

植物水孔蛋白AQPs有组织或器官表达的特异性[21]。近年来,有研究表明拟南芥AQPs基因主要在根和花中表达,而在叶中无特异性表达[22]。2014年Ge等[23]的研究表明,BnPIP2;5、BnPIP2;7、BnPIP2;2和BnPIP2基因的转录本更丰富地在花中积累。本研究中,TIP4;1基因在根、茎、叶和花器官都有表达,且在花器官中的表达量最高,但其在花器官中的作用有待于进一步研究。

表1　甘蓝型油菜TIP4;1基因在干旱、低温和盐胁迫处理后的相对表达

注:处理时间如下:20 % PEG 6000处理和12 ℃低温处理种子时间均是6,12,24,48,72 h;150 mmol/L NaCl处理种子时间是6,12,24,48 h。TIP4;1基因在正常情况下吸水相对应时间的表达量作为对照。相对表达量为TIP4;1基因在胁迫处理下的表达与对照(正常情况)下表达的比值,“平均值±标准差”。每个试验进行3次生物学重复。

Note:Timegradienttreatments:seedsweredealtwith20%PEGor12 ℃coldfor6,12,24,48,72hrespectively;150mmol/LNaClfor6,12,24,48h.ExpressionlevelsofTIP4;1inseedsgerminatedundernon-stressedconditionatcorrespondingtimepointswereusedasacontrol.Therelativevaluesaretreated/controlratio(fold).Valuesaremeans±SDof3replicates.

种子萌发过程植物组织的含水量发生了极大变化,TIPs在种子萌发过程起着重要作用。拟南芥的TIP蛋白AtTIP1;2和AtTIP2;1在种子萌发阶段大量表达,Li等[24]证实了其对液泡渗透调节发挥着重要作用。Maurel[25]发现γ-TIP在种子萌发及幼苗期表达,证实其参与了种子萌发过程细胞的渗透调节和幼苗初期细胞的伸长。本研究发现,在干种子中未检测到TIP4;1基因的表达,而在种子萌发过程和早期幼苗阶段其表达出现上调。尤其在胚根出现的前几个小时(12h内),TIP4;1基因的表达增强,在吸水12h后达到最大表达量,这与胚根出现的时间恰巧一致。TIP4;1基因在吸水的种子中高表达可能与种子萌发初期阶段水分的跨膜转运及促进水分向不断膨胀的组织供给有关。此外,种子吸水24h后TIP4;1基因表达上调,这意味着除了参与种子的萌发过程,该基因可能同时也参与了幼苗初期阶段的发育过程。TIP4;1基因在不同器官和种子萌发过程中的表达模式说明其表达是受发育调控的。

研究表明,水孔蛋白AQPs在植物的水分平衡中起着重要作用[22,26-27],环境刺激也在不同水平上调控TIPs的表达[28]。植物AQPs基因在拟南芥等植物中对逆境(低温、干旱、盐胁迫)表现出上调或者下调[26,29-31]。受到干旱胁迫,拟南芥AQPs基因的表达上调[22],本研究还表明,在干旱胁迫24h后，TIP4;1基因的表达是对照的2倍。植物在干旱胁迫下需要保持细胞内一定的水分来维持正常的生理功能,这就需要在一些细胞和组织中提高水孔蛋白AQPs的表达[32]。水孔蛋白的上调表达使细胞膜对水分子的通透性加强,可以增加细胞对水分的获取。在低温胁迫下,拟南芥的水孔蛋白AQPs的表达也受到一定的影响[21]。Ge等[23]发现,冷胁迫处理6h后甘蓝型油菜的BnTIP2基因表达量迅速增加到对照的46倍,本研究结果也得到类似结论。TIP4;1基因在冷胁迫下的表达持续上调,在处理72h后表达量达到对照的1.6倍。研究表明,植物对盐胁迫最敏感的响应是根的导水性受到抑制[33]。10mmol/LNaCl处理下,野生型拟南芥根的导水性快速下降;而水孔蛋白PIP2;5基因过量表达的拟南芥,其根的导水性不受影响[34]。Sutka等[33]认为,细胞导水性的抑制作用是通过水孔蛋白的表达和活性来实现的[34]。在转录水平上,盐胁迫也影响大多数AQPs基因的表达。本研究中,盐胁迫初期(6h内),甘蓝型油菜TIP4;1基因的表达上调。随后经过短暂的表达量下降之后,在吸水24h后该基因的表达再次上调并达到最大(对照的3倍)。综上所述,在非生物因素逆境胁迫下,TIP4;1基因的这种上调或者下调表达,可能在胁迫处理的初期阶段为减少水分的散失起到一定作用,同时加速处理后期的水分吸收过程,以此来保持甘蓝型油菜在逆境条件下的水分平衡[26]。

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CloningandExpressionAnalysisofTIP4;1GenefromBrassica napus

GE Fengwei,JIANG Yi,ZHAO Huixin

(Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Regulatory Biology,College of Life Science,Xinjiang Normal University,Urumqi830054,China)

Abstract：Aquaporins are channel proteins,which located in biological membranes including plasma membrane and tonoplast.It can highly facilitate water transportation across biological membranes.To investigate molecular mechanism of water regulation during seed germination,a tonoplast intrinsic proteins(TIPs)gene fragment TIP4;1 was isolated from Brassica napus seed by RT-PCR.The expression of TIP4;1 gene during seed germination and stresses treatment was analyzed by quantitative Real-time PCR(qRT-PCR).The transcription levels of TIP4;1 was analyzed during germination,and these results showed TIP4;1 expression levels was scarcely detected in dry seed,but was up-regulated during germination as well as early young seedlings.In addition,expression of TIP4;1 in response to abiotic stress was investigated,and results showed that TIP4;1 gene expression was upregulated under drought,cold and salt stress,suggesting that TIP4;1 may be involved in Brassica napus seed germination and stress response process.Aquaporin regulation mechanism would be further revealed in future,which had realistic significance for solving drought and salt stress problems.

Key words:Brassica napus;AQPs;TIPs;Seed germination;qRT-PCR

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.007

中图分类号：Q78

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)02-0032-06

作者简介：葛风伟(1976-),女,江苏新沂人,讲师,博士,主要从事植物逆境分子生物学研究。通讯作者：赵惠新(1975-),女,新疆奇台人,副教授,博士,硕士生导师,主要从事植物逆境分子生物学研究。

基金项目：新疆维吾尔自治区重点实验室“新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室”项目(XJDX1414-2015-07);新疆师范大学博士科研启动基金项目(XJNUBS1541)；新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2013211A024)

收稿日期：2016-02-10