转座子介导MYB在果树花青素合成中的调控作用*

江春阳，杜美娥，梁兆林，丛佩华，张利义

（1 中国农业科学院果树研究所，农业农村部园艺作物种质资源利用重点实验室，辽宁兴城125100）（2 鄂尔多斯生态环境职业学院）

随着社会经济的发展和人们生活水平的不断提高，消费者要求水果不仅要好吃，还要好看，而果实色泽是其颜值的重要表现，直接影响消费者选择，因此，果实着色问题一直以来都是国内外研究热点。果实着色主要归因于花青素[1]，关于花青素相关的果实着色的分子机制已取得了重要进展[2-4]，本文重点就转座子调控重要果树果实着色的相关分子机制进展进行综述，以期为研究果树花青素代谢调控网络和改善果实品质育种提供新的理论指导。

1 花青素的生理功能

花青素属于水溶性黄酮类色素，通常都以糖苷形式存在液泡中，不同水果成熟时花青苷含量和种类不一样，诸如影响苹果和梨果皮的色苷主要为矢车菊素-3-O-半乳糖苷[4-6]，血橙和红肉桃主要为矢车菊素-3-葡萄糖苷[7-8]，葡萄主要为二甲花翠素-3-葡萄糖苷与二甲花翠素-3-乙酰葡萄糖苷[9]，蓝莓主要为锦花葵素半乳糖苷[10]，草莓主要为天竺葵素3-葡萄糖苷[11]。花青素不仅赋予了众多果实绚丽诱人的色彩、识别度以及成熟度[2]，而且在果树生长发育过程中有着重要的生理功能，包括吸引昆虫授粉，抵御紫外线、低温、干旱及创伤等逆境胁迫[1-2]。此外，花青素具有较强的抗氧化功效，对人体有保健功能[11]。

2 MYB转录因子为调控果树花青素生物合成的核心

植物花青素合成途径是源自苯丙烷代谢的类黄酮合成途径的一个分支，涉及多个结构基因、调控基因以及与其互作的环境因子[2-4]；其中，在果树上通过复杂的调控网络参与花青素的调控基因包括多种转录因子，如MYB、bHLH、WD40、BBX、WRKY、ERF、b-ZIP等[12]；而MYB转录因子的表达具有强烈的组织特异性，是花青素合成调控最核心的转录因子[1]。众所周知，参与花青素代谢途径上的任何一个基因突变都可能导致颜色表型变异；然而，从目前在多种果树上全基因组或分离群体着色关联分析可知，定位结果通常是MYB转录因子基因[11,13-17]。

MYB家族分4 个亚家族，包括1R-1MYB、R2R3-MYB、3R-MYB 和4R-MYB，而R2R3-MYB又是花青素合成调控最重要的转录因子[3-4]。目前，基于完成测序的包括苹果、梨、葡萄以及柑橘等重要果树的基因组及其转录组信息，众多R2R3-MYB转录激活因子和抑制因子被分离[3-4]；利用高质量的基因组分析发现，通常是结构上高度同源的MYB基因簇以串联方式毗邻排布在基因组上，诸如苹果第9 号染色体上的MdMYB10和MdMYB90[18-19]与第17 号染色体上的MdMYB110a和MdMYB110b[19]、葡萄第2 号染色体上的VvMYBA1和VvMYBA2[20]以及柑橘第6 号染色体上的Ruby1和Ruby2[21]等。这些MYB基因簇通常与花青苷合成的能力息息相关，演化过程中2 个基因均受到不同程度的选择；通常情况下，其中的1 个为主基因，而当发生芽变等事件后，2 个基因协同发挥作用[18]；有时这些MYB基因簇发生突变后，在不同种中演化出亚功能化调控机制[21]，使彩色表型更加多样化。

3 转座子介导MYB 模式调控果树花青素

转座子或称转座元件（TEs），是基因组中可移动的具有重复序列的遗传元件，被喻为生命进化的种子。转座子特征是其序列两端含有相同或逆向互补序列，常占植物基因组很大份额，许多果树的转座子在整个基因组序列占比超过50%，如苹果、樱桃等果树（表1）。

表1 几种重要果树的基因组大小及TE 所占百分比

转座元件可以分成2 类，其中I 型转座子又被称为逆转录转座子，是一类通过“复制—粘贴”机制来实现其在基因组中“跳跃”的转座元件，其长末端重复逆转录转座子LTR-RTs 是果树中最为丰富的一类转座元件，划分为2 个大家族：Ty1/copialike 和Ty3/gypsy-like，LTR 通常具有5′-TG……CA-3′序列结构，靶点重复序列TSDs 4～6 bp[22-23]。II 型转座子也叫DNA 转座子，主要是通过“剪切—粘贴”的机制进行“跳跃”。2 类转座子区别在于逆转录转座子会通过RNA 逆转录自我复制，再逆转录成DNA 来完成转座。

转座子是果树优异性状的形成以及在应对逆境胁迫中不断适应的遗传基础[33]。转座子插入对邻近基因的影响主要表现为插入突变、结构重排以及新调控元件和表观修饰引入等[22-23]，这些影响可导致表型变异。其中，果实呈现绚丽多彩的表型，往往是具有多样化调控色彩的转座子之行为。基于当前已完成的果树基因组，发现转座子介导MYB基因调控花青素合成在果树上较具普遍性，以下列举一些经典的案例。

（1）苹果。通过比较基因组，在果实着色的核心调控转录因子MdMYB1的启动子上发现了一个redTE 逆转座子插入，redTE 扮演了增强子角色，促进了MdMYB1基因在低温和强光条件下特异表达，使果实着色；该发现诠释了红元帅和红富士等品种成熟时为什么易着色，而金冠及王林等品种却不易着色的疑问；不易着色的品种是由于缺少这一起增强功能的转座子，MdMYB1表达有限，不能有效合成花青素的结果[24]。进一步通过电泳迁移率实验证明响应低温MdCBF2转录因子能够结合到redTE 上，为我们理解低温促进果实着色提供了新的洞察。有趣的是，redTE 自我重组形成了只保留一个LTR 的“solo-redTE”，solo-redTE 塑造了一种果皮颜色为橘红色的新表型[34]，如嘎拉苹果（图版2）。

最近10 多年红肉苹果选育是一个重要的方向，在红肉苹果MdMYB10启动子上游存在一个含6 个23 bp 的R6 重复序列（广义上可视为转座子），这个序列具有自激活及组成型表达特性，赋予了包括叶、果、花、枝干等整个植株为红色的特性[35]。此外，还有一种II 型红肉苹果，叶片和植株是绿色的，而果肉是粉红色的。根据逆转录转座子的功能特点及其在植物基因和基因组进化中的作用，推测这种表型是由一个转座子插入调控与MdMYB10高度同源的MdMYB110转录因子的结果[4,19]。

（2）葡萄。Kobayashi 等[36]2004 年在Science上发表论文表明，白色葡萄果实是由于VvMYBA1的启动子区插入了Gret1 逆转座子，导致该基因表达受阻，无法调控下游结构基因的表达，花青素无法合成，使果皮呈白色或绿色。Gret1 再次发生重组形成solo-LTR 使得VvMYBA1恢复了部分功能，使葡萄呈红色表型[37]（图版2）。

（3）柑橘。一个Copia LTR 逆转座子Tcs1 插入MYB转录因子Ruby基因上游，为其提供了一个新的启动子，使Ruby在低温条件下诱导表达，使果肉呈现出显著的红色；在杂交过程中，Tcs1 发生了重组形成一个solo-LTR 使得后代Moro 的果肉颜色更深；更加有趣的是，中国血橙Jingxian 和意大利Tarocco 在它们Ruby基因上游分别发生了不同的转座子插入事件，但有着相类似的表型效应，也说明这2 个品种有着不同起源史[38]（图版2）。

（4）草莓。研究发现，结白色果实的二倍体野生草莓是由于FaMYB10转录因子中存在一个gypsy LTR 逆转座子的插入，截断了FaMYB10编码，进而导致花青素苷合成受阻，因而发育为白色果实。而一个红肉草莓突变体 FaEnSpm-2 是由于MYB10-2的启动子区插入1 个CACAT-like DNA 转座子，增强了MYB10的表达，促进了MYB10-2在草莓果肉中的表达和花色素苷的合成，导致了红肉草莓的表型[11]（图版2）。

（5）梨。已鉴定出PrMYB10（EU153575）和prMYB114（MF489219）是影响红皮梨的2 个转录因子[15,39]。其中，Yao 等[15,40]以八月红和砀山酥梨等杂交群体图谱定位并功能验证prMYB114是八月红梨果实着色的关键基因，但没有阐明prMYB114在群体中红皮和非红皮梨差异表达的原因。我们基于BartlettDH 基因组，在prMYB114转录因子ATG 上游1 299 bp 处发现插入了1 个LTR-RTs，该转座子全长5 295 bp，LTR 为492 bp，TSDs 为TATAT。此外，在PrMYB10的起始密码子ATG 上游1 654 bp发现插入1 个LTR-RTs，该转座子全长3 938 bp，LTR 为526 bp，TSDs 为CATCT；在红皮梨品种当中，八月红和早红考密斯是2 类不同着色类型，果色发育模式有所不同；其中，八月红只有果实成熟时果皮才变红，而早红考密斯幼果期和果实发育期都是红色。根据这些表型，我们推测和苹果一样是这些转座子调控了红皮梨的多样化着色表型。Wang等[39]基于红巴梨及其绿色芽变系，发现绿色芽变是由于PrMYB10启动子区域发生甲基化导致的结果。已有研究表明，转座子插入常常诱导周围区域产生甲基化[41-43]，进而导致不同表型的出现。此外，梨上是否还有其他转座子或重组solo-LTR 调控果实着色，值得进一步挖掘。总之，尽管以上这些发现仍需实验验证，但也为阐明红色梨着色分子调控机制提供了新的线索。

以上这些案例，显示有重复序列特性的转座子插入MYB基因，扮演了增强子[24]、沉默子[37]以及启动子[38]等多种功能角色，极大地拓展了我们以往对转座子插入仅仅导致突变的简单理解。因为当携带丰富调控元件的转座子整合到基因组中并被重新用作宿主基因的调节者时，便开启了全新的演化选择；而转座子之所以频繁选择核心的MYB转录因子基因作为靶标并非随机，是因为在应对逆境时以这种调控方式可能更加灵活有效，进而TE-MYB控制花青素合成模式在演化过程中被大多数果树所选择。

4 问题与展望

芽变育种是果树重要育种途径之一，转座子诱导表观修饰或转座是果树发生芽变的一个重要原因[44]；果树上存在丰富的芽变，特别是颜色变化，易于视觉识别，是发现和揭示转座子功能较好的材料。目前，转座子介导基因调控功能的重要性在果树上仍然未得到全面探讨。结合逆境条件下RNA-seq分析，我们发现逆转座子如redTE 的LTR 区转录生成lncRNA（Long non-coding RNA），因为redTE 起增强子作用，常写作eRNA（Enhancer RNA）。在苹果着色方面研究表明，lncRNA 桥接了MdWRKY1和MdERF109转录因子，形成了MdWRKY1-lncRNA-MdERF109转录级联模块调控光诱导苹果花青素生物合成[12]。那么诸如来源redTE 逆转座子的非编码作用机制又是什么呢？值得探讨。

植物通过RdDM（RNA-directed DNA methylation）机制保证转座子持续保持沉默，若转座子发生转录，其会被降解生成siRNA；而siRNA 又反过来携带DNA 甲基化酶将发生表达的转座子通过DNA 甲基化修饰使其沉默[22]。最新发现表观遗传标记修饰（mRNA 修饰是m5C 和m6A，DNA 为5mC 和6mA）在植物基因组上也普遍存在，且与基因表达、发育和胁迫响应有关[45]。最近在哺乳动物中发现了m6A调控染色质修饰水平与维持转座子沉默状态的新机制[46]，那么果树上与着色相关的逆转座子是否有类似的m6A 调控途径和相似的功能？从RNA 甲基化的角度来认识转座子的作用和调控将丰富果树转座生物学，是个有趣而富有挑战的科学方向。

从苹果、葡萄以及柑橘中可以看到，solo-LTR是由完整的LTR-RTs 通过同源重组而生成的，这类短的携带调控位点的solo-LTR 转座子可能更容易被宿主所固定；因为当LTR-RTs 插入宿主基因组时，在带给宿主新的序列资源信息的同时，也给其基因组创造了不稳定性的因素。而宿主先接受完整的逆转座子插入，然后通过重组生成solo-LTR，这种趋利避害的进化策略完美地实现物种多样性。此外，果树上这3 个典型案例也间接说明solo-LTR 作为一种顺式元件参与了基因的表达与调控，而且具有发育时期和组织器官特异性，今后需利用CRISPR/Cas9 技术直接验证solo-LTR 调控果实着色的确切生物学功能。

总之，可以预见随着测序与组装基因组的成本大幅度的下降，更多个性化的果树基因组序列将产生；通过比较基因组的方法，更多转座子调控MYB基因的模式将在更多果树上被发掘。从实践而言，基于转座子很容易开发出实用的分子标记[11,24]，为辅助育种家精准有效地培育具有理想果实颜色的新品种提供技术支撑。