基于日光诱导叶绿素荧光的柑橘黄龙病原位诊断

陈硕博，沈煜韬，谢鹏尧，陆旭琦，何 勇，岑海燕

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州 310058；农业农村部光谱检测重点实验室，杭州 310058； 浙江大学现代光学仪器国家重点实验室，杭州 310027）

0 引 言

柑橘黄龙病（Huanglongbing, HLB）严重影响柑橘的产量和品质，由于难以预防和控制，传播速度快，且目前尚无根治的方法，被称为“柑橘癌症”。因其巨大的危害性，2020年9月中国农业农村部将其列入《一类农作物病虫害名录》。因此，对柑橘黄龙病的及时准确监测有利于病害的防控，对柑橘产业稳定健康发展起着极其重要的作用。目前诊断HLB的方法主要包括田间观察法和实验室生化分析法两类。由于田间观察法简单易行，在基层生产活动中的使用较为普遍，其判别依据主要是感染黄龙病的植株显现出来的典型症状，如叶片颜色和果实转色程度等。但该方法对农艺人员的知识和经验要求较高，主观性强，有其他病害如黄斑病、缺素症等与黄龙病有相似的症状，极易对HLB的诊断造成误判。实验室有多种方法检测黄龙病，但这些方法过程较为复杂，对实验人员的专业技能要求高、检测成本高且检测周期长，不利于推广应用。

近年来随着光谱技术与遥感技术的发展，HLB的无损检测逐渐成为了可能。Pérez等利用一种便携式拉曼光谱仪结合主成分分析和线性判别分析算法识别健康和HLB柑橘植株，其正确识别率可达到89.2%。Sankaran等利用傅里叶近红外光谱仪对被干燥和粉碎的柑橘叶片进行检测，对HLB的识别率可达到95%，但对未显症HLB柑橘叶片的诊断正确率仅为48.2%。刘燕德等在利用高光谱成像技术在380～1 080 nm光谱范围内对HLB进行病情等级判别，对所采集的柑橘叶片高光谱图像按染病程度和缺素分成5类，采用偏最小二乘判别分析法（Partial Least Squares Discrimination Analysis, PLS-DA）的模型误判率仅为5.6%。兰玉彬等获取了柑橘果园的无人机低空高光谱影像，发现核函数为二次项的支持向量机（Support Vector Machine, SVM）判别模型对一阶导数预处理的健康和HLB植株的全波段光谱分类效果最好，准确率达到了94.7%。Deng等利用无人机搭载高光谱成像仪采集柑橘园的遥感影像，采用遗传算法提取特征波段进一步构建多种植被指数，再结合冠层光谱特征参数构建了多特征融合的HLB检测方法，该方法在训练集和验证集的分类精度分别达到了99.33%和99.72%。

以上研究大多基于染病叶片与健康叶片的光谱或图像特征差异采用分类识别算法对柑橘黄龙病进行诊断，对未显症HLB的研究较少且诊断精度较低，对叶片遭受黄龙病菌侵染后的光合生理差异亦缺乏研究。植物在受到生物或非生物胁迫后，其光合作用强度会发生明显变化，而叶绿素荧光与植物的光合作用密切相关。研究表明，植物吸收的太阳辐射能量用于3个方面：光合作用、热耗散、荧光发射。这三者在植物生理上是密切关联的，存在着近似此消彼长的关系，因此可以通过荧光更为直接地探测与植物光合作用相关的信息。Sankaran等利用手持式荧光传感器在室内环境下基于袋装决策树（Bagged Decision Tree, BDT）分类器对健康和显症黄龙病柑橘叶片的总体分类准确率达到了97%。Cen等利用叶绿素荧光成像技术在实验室环境下实现了健康、黄龙病和缺素柑橘叶片的高精度识别。翁海勇等同样利用叶绿素荧光成像技术提取健康和黄龙病柑橘叶片的荧光参数结合碳水化合物代谢分析实现了柑橘黄龙病的检测。但以上研究都需要主动的激发光源且需对叶片破坏性采样，难以满足大田环境下对柑橘黄龙病快速无损诊断的要求。而日光诱导叶绿素荧光（Sun-induced Chlorophyll Fluorescence, SIF）技术适合在自然环境下对植物胁迫下光合生理的变化进行无损检测，得到了日益广泛的重视。竞霞等利用随机森林协同SIF和反射率光谱实现了对小麦条锈病的监测。白宗璠等利用改进离散粒子群算法（Modified Discrete Binary Particle Swarm Optimization, MDBPSO）优化的全波段光谱数据协同冠层SIF结合随机森林和后向传播神经网络算法构建了小麦条锈病的遥感探测模型，对小麦条锈病病情指数的反演精度达到了90%以上。而将日光诱导叶绿素荧光技术用于柑橘黄龙病诊断的研究尚未见报道。因此本研究通过分析健康、未显症黄龙病、显症黄龙病以及与黄龙病症状类似的黄斑病柑橘叶片的光合参数与光合色素含量差异，尝试揭示黄龙病菌侵染柑橘叶片的光合响应机理，利用光谱和日光诱导叶绿素荧光技术分析4种类型叶片的反射率光谱和SIF光谱差异，并进一步构建柑橘黄龙病的诊断模型，以期实现柑橘黄龙病的原位快速诊断。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试柑橘品种为涌泉蜜桔，果园位于浙江省台州市临海市沿江镇上百岩村（121°16′48″ E，28°43′12″ N，海拔37 m），试验前根据柑橘黄龙病研究专家的建议标记健康（Healthy）、未显症黄龙病（asymptomatic HLB, aHLB）、显症黄龙病（symptomatic HLB, sHLB）及症状与黄龙病相似的黄斑病（Macular）柑橘叶片（图1）。团队前期研究已对比了缺素症和黄龙病的差异，本研究进一步拓展了区分黄龙病与其他相似症状柑橘病害（如黄斑病）的可能性。田间试验结束后，剪下标记叶片所在枝梢，并用去离子水浸润的脱脂棉包裹切口处迅速装入标记好的密封袋，封口后转移至保鲜盒保存。取样时间分别为2021年2月22日、3月22日和4月29日，采集样品数量分别为60、54和48片。将样品带至实验室后，在叶脉两侧分别打孔以测叶片色素含量，中心叶脉剪碎后按照国家规定的标准黄龙病检测方法-实时荧光定量PCR（quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, qPCR）法对叶片进行标定。最后确定健康、未显症黄龙病、显症黄龙病以及黄斑病叶片分别为45、33、45、39片，共计样本162片。

图1 不同柑橘叶片样本的RGB图像 Fig.1 RGB images of different citrus leaf samples

1.2 数据采集

1）光合参数。使用Li-6800便携式光合系统测量柑橘叶片的光合参数，主要包括净光合速率（mol/(m·s)），胞间二氧化碳浓度（mol/mol），气孔导度（mol/(m²·s)）和蒸腾速率（mol/(m·s)），测量前设置叶室CO浓度为400mol/mol，相对湿度为50%，叶片温度为25℃，光强为1 200mol/(m·s)。再测量柑橘叶片的光合-CO响应曲线（the photosynthetic COresponse curve, A-Ci）。A-Ci曲线CO浓度梯度设置为400、300、200、100、50、0、400、400、600、800、1 000、1 200mol/mol，测定完成后，基于Farquhar光合作用模型计算得到叶片最大羧化速率和最大电子传递速率。测量的健康、未显症黄龙病、显症黄龙病和黄斑病叶片样本的数量分别为15、11、15和13片。

2）SIF光谱。利用ASD FieldSpec 4（analytical spectral device，ASD，美国ASD公司）便携式地物光谱仪结合FluoWat叶片夹测量叶片的SIF光谱。由于叶片夹上下2个位置都可以插入光纤，因此可以同时测得叶片正面和背面的SIF光谱。叶片夹入FluoWat叶片夹后，将入射的太阳光束人工对准相对于叶片表面45°方向的开孔，测量并记录叶片的反射和透射数据集。然后使用高性能低通滤波片（＜650 nm）对650 nm以上的光进行截断，分别得到上行和下行的SIF光谱。FluoWat叶片夹的工作原理如图2所示。测量点保持在叶片叶宽最大位置的中央叶脉左侧。由于试验期间太阳光光入射强度可能受太阳角度和云量的影响而不同，通过对测量的SIF光谱进行标准化处理，计算得到SIF产量指数。具体计算公式参考文献[26]。

图2 FluoWat工作原理图 Fig.2 The working diagram of FluoWat

3）反射率光谱。将剪下的枝梢带入实验室内后，迅速按照SIF光谱测量标记的顺序对叶片的反射率光谱进行逐一测定。使用仪器为ASD FieldSpec 4 地物光谱仪结合内置光源的叶片夹。测量前使用叶片夹自带的标准板进行暗电流和白板标定，将灰度值转化为反射率值。每个叶片样本保存5条光谱曲线，取其算数平均值作为该样本最终的反射率值。ASD高光谱仪测定的波段范围为 350～2 500 nm，测量结果输出间隔1 nm的光谱反射率数据。反射率光谱测定完成后，迅速进行光合色素含量的测定。

4）光合色素含量。采用分光光度法测定柑橘叶片的叶绿素、叶绿素和类胡萝卜素含量。在叶片叶脉两侧分别打孔得到小圆叶，装入5 mL离心管，加入研磨珠至研磨机研磨后再对每个样品加入95%乙醇并再次研磨。将样品在暗室环境下静置2～3 h后离心。取上清液于96孔微孔板，使用美国BioTek公司生产的Epoch 2酶标仪配合96孔微孔板测定样品溶液在665、649和470 nm波长下的吸光度，并以95%乙醇为参照，参考文献分别计算叶绿素、叶绿素和类胡萝卜素含量。测量的健康、未显症黄龙病、显症黄龙病和黄斑病叶片样本的数量分别为45、33、45和39片。

1.3 数据处理

分别基于反射率光谱和SIF光谱建立柑橘HLB的诊断模型。构建反射率光谱诊断模型时，首先利用竞争性自适应加权算法（Competitive Adaptive Reweighted Sampling, CARS）算法筛选特征波段，再将特征波段的反射率作为输入结合K最邻近法（K-nearest Neighbor, KNN）对4种类型的柑橘叶片进行分类识别。构建SIF光谱诊断模型时，首先参考已有文献确定SIF光谱的峰值位置，再基于峰值位置波长的SIF产量指数结合KNN算法构建4类叶片的诊断模型。通过比较两类模型的最终诊断正确率，确定柑橘HLB的最佳诊断模型。

1）特征波段筛选算法。CARS算法可以有效降低各波长变量之间的高度共线性问题，进而提高预测模型的速度和精度。在实际波长变量优选过程中，通过偏最小二乘（Partial Least Squares，PLS）模型回归系数绝对值较大的波长变量，剔除模型回归系数绝对值较小的波长变量，可以得到多个优选变量子集，再利用交叉验证的方法建模，次蒙特卡罗采样后选择个子集，获得个模型的交叉验证均方根误差（Root Mean Square Error of Cross-validation，RMSECV），RMSECV最小的优选变量子集即为最优变量子集，包含的变量即为筛选得到的特征波段集合。本次试验将蒙特卡罗采样次数设置为50，在MATLAB R2021a（The Mathworks Inc.，USA）软件环境中运行。

2）分类算法。KNN通过计算维空间中一个样本点与其他样本点的距离来判断该样本与其他样本点的差异来选择类别，训练简单高效，数学原理易理解，应用广泛。采用5折交叉验证来防止模型过拟合，经多次测试，邻点个数设置为10时，分类精度较高且运行速度较快，距离度量采用Euclidean距离法，距离权重设置为等距离。

3）模型评价指标。本研究采用混淆矩阵评价判别模型的识别效果。混淆矩阵把预测类别与实际类别的所有结果进行组合，形成了真正（True Positive, TP）、假正（False Positive, FP）、真负（True Negative, TN）和假负（False Negative, FN）四种情形。进而可以计算出真正率（True Positive Rate，TPR）=TP/(TP+FN)，假负率（False Negative Rate，FNR）=FN/(FP+TN)，以及总体正确率（Overall Accuracy，OA）=TP/(TP+FP)。

4）SIF产量指数。计算公式如式（1）～（5），本文参考已有文献使用687和741 nm波长处的发射峰计算SIF产量指数。具体描述如表1所示。

表1 本文用到的日光诱导叶绿素荧光产量指数 Table 1 Sun-induced Chlorophyll Fluorescence (SIF) yield indices used in this study

式中为波长，nm；为太阳辐照度，mW/(m·nm·sr)；PAR（Photosynthetically Active Radiation）为光合有效辐射，mW/(m·sr)；为反射率，无量纲；为透射率，无量纲；fAPAR（Fraction of Absorbed Photosynthetically Active Radiation）为植物光合有效辐射吸收比例，无量纲；APAR（Absorbed Photosynthetically Active Radiation）为植物吸收的光合有效辐射，mW/(m·sr)；为上行SIF，mW/(m·nm·sr)；为下行SIF，mW/(m·nm·sr)；FY为上行SIF产量，nm；FY为下行SIF产量，nm。

2 结果与分析

2.1 柑橘黄龙病对柑橘叶片光合参数与色素含量的影响

计算不同类型柑橘叶片的光合参数的总体平均值与标准差，如图3所示。健康柑橘叶片的净光合速率明显大于黄斑病和黄龙病叶片（图3a），说明柑橘叶片被病原菌侵染后光合作用强度明显减弱，而柑橘黄龙病侵染后的叶片又明显小于黄斑病叶片的净光合速率，可能是因为黄龙病属于细菌性病害，对叶片组织内部光合机构的破坏要大于真菌型病害黄斑病的缘故。黄龙病显症与未显症叶片的净光合速率无明显差异，说明健康柑橘叶片的光合机构在受到黄龙病菌侵染后开始遭受破坏，在柑橘黄龙病未表现出明显特征的潜伏期已经表现出来。健康叶片的胞间二氧化碳浓度明显低于其他三类染病叶片（图3a），由于二氧化碳是光合作用的主要原料，所以健康叶片相较于染病叶片的光合作用较强，因此消耗了更多的二氧化碳，使得细胞间二氧化碳浓度较低。由于控制环境二氧化碳浓度为400mol/mol，3种染病叶片的光合作用强度较弱，几乎对二氧化碳没有消耗，其胞间二氧化碳浓度维持在400mol/mol左右，而健康叶片的胞间二氧化碳浓度则明显低于400mol/mol，维持在300mol/mol左右。蒸腾速率的快慢反映了植物的水分代谢能力，可以一定程度上反映植物的健康状况。当植物收到生物或非生物胁迫时，蒸腾速率均会表现出与正常植物的明显差异。从图3b中可以看出，健康叶片的蒸腾速率明显高于其他3类染病叶片，说明受到病害胁迫的柑橘叶片的水分代谢出现了异常。而受黄龙病菌侵染的柑橘黄龙病叶片的蒸腾速率又明显低于受柑橘球腔菌侵染的黄斑病叶片，这从一定程度上揭示了黄龙病对柑橘的危害大于黄斑病的原因。气孔导度表示叶片气孔的张开程度，是影响植物光合作用的主要因素。从图3b中可以看出，健康柑橘叶片的气孔导度明显高于其他3类染病叶片，这是造成健康叶片的净光合速率和蒸腾速率明显高于其他3类染病叶片的主要原因。

图3 不同柑橘叶片样本的光合参数 Fig.3 Photosynthetic parameters of different citrus leaf samples

通过设置不同的二氧化碳浓度得到光合-二氧化碳响应曲线，基于Farquhar模型计算得到不同染病类型柑橘叶片的最大羧化速率和最大电子传递速率（图4a）。最大羧化速率反映了的表观羧化活性，其大小取决于的数量和活化程度，是植物光合能力强弱的特性参数。最大电子速率用来估算植物分配到碳同化的光合电子流和分配到光呼吸的光合电子流。从图4a中可以看出，健康叶片的最大羧化速率和最大电子传递速率均明显大于其他3种染病叶片，而黄龙病叶片的最大羧化速率和最大电子传递速率最低，说明活化的酶的数量在柑橘叶片遭受黄龙病菌侵染后明显减少，其直接造成了叶片光合作用中碳同化速率的降低，进而影响柑橘的产量和品质。

光合色素在光合作用中起到参与吸收、传递光能或引起原初光化学反应的作用，主要包括叶绿素、叶绿素和类胡萝卜素等。不同类型柑橘叶片的光合色素含量如图4b所示。4种类型叶片的3种色素含量分布一致，均表现为健康叶片的含量最高，显症黄龙病叶片的含量最低。显症黄龙病的叶绿素含量显著小于健康和未显症叶片，尽管其类胡萝卜素含量亦小于健康和未显症叶片，但健康或者未显症黄龙病叶片的叶绿素与类胡萝卜素含量比值大于显症黄龙病叶片，这可能是造成黄龙病叶片出现黄化的主要原因。

图4 不同柑橘叶片样本的光合能力和色素含量 Fig.4 Photosynthetic capacity and pigment content of different citrus leaf samples

2.2 柑橘叶片的反射率特征与黄龙病诊断结果

4种不同类型的柑橘叶片的反射率光谱如图5所示。无论是健康叶片还是染病叶片均表现出典型的植被光谱特征。整体来看，在可见光波段（500～680 nm）和近红外波段（750～1250 nm），显症黄龙病和黄斑病叶片的反射率高于健康和未显症黄龙病叶片。而健康叶片与黄龙病未显症叶片的光谱反射率十分接近，这为利用光谱区分潜伏期黄龙病叶片和健康叶片带来一定的困难。同样地，显症黄龙病叶片由于和黄斑病叶片都出现一定的黄化症状，在反射率光谱的表现亦差异不大。

图5 不同柑橘叶片样本的反射率光谱特征 Fig.5 Reflectance spectra of different citrus leaf samples

图6表示根据CARS算法筛选的特征波段结果图。随着运行次数的增加，RMSECV呈现先减小后增加的趋势，在运行次数为20时，RMSECV达到最小值，为0.494（图6a）。从图6b可以看出，随着运行次数的增加，被筛选出来的波段数量呈减少趋势，前10次运行的波段数量迅速减少，30次以后逐渐平稳。当RMSECV最小，运行次数为20时，对应的波段数量为144个。因此将筛选出来的144个波段的作为特征波段，输入其反射率结合KNN算法对4类叶片进行分类。

图6 CARS算法筛选特征波段 Fig.6 Screening optimal wavebands by Competitive Adaptive Reweighted Sampling (CARS) algorithm

基于特征波段反射率的4种类型柑橘叶片的分类结果的混淆矩阵如图7所示。4类叶片的分类真正率均在60%以上，未显症黄龙病和显症黄龙病的真正率分别72.7%和75.6%，健康叶片的分类真正率最高，达到了82.2%。黄斑病叶片的分类真正率仅为64.1%，有23.1%错分的是把其分类为显症黄龙病，而显症黄龙病叶片的分类真正率也仅为75.6%，20.0%被识别为黄斑病，这说明显症黄龙病叶片与黄斑病叶片较为接近的反射率光谱为柑橘黄龙病的诊断带来的一定的难度。未显症黄龙病叶片的分类真正率为72.7%，而有21.2%的叶片被误分为健康叶片，同时健康叶片的分类精度虽然达到了82.2%，但是仍有13.3%被误分为未显症黄龙病叶片，同样地，十分接近的反射率光谱，使两类叶片被互相误判的可能性较大。

图7 基于特征波段反射率的KNN分类结果 Fig.7 K-nearest Neighbor (KNN) classification results based on reflectance of optimal wavebands

2.3 柑橘叶片的SIF光谱特征与黄龙病诊断结果

不同类型柑橘叶片的上行SIF产量和下行SIF产量如图8所示。从图8a可以看出，不同病害类型的柑橘叶片的上行SIF产量均表现出双峰的特征，这是由光系统Ⅱ和光系统Ⅰ共同贡献，峰值位置位于红光区域的690 nm和远红光区域的740 nm波长附近，且在690 nm波长附近，显症黄龙病的SIF产量明显大于其他3类叶片，而在740 nm附近未显症黄龙病叶片的SIF产量大于其他3类叶片。4种染病类型的柑橘叶片的下行SIF产量则表现出单峰的特征（图8b），这是由于当透射光从叶片表面穿过叶肉细胞到达叶片背面时，叶绿素对红光的重吸收效应造成的。而远红光区域的峰值位置亦出现在位740 nm波长附近，但在红光区域内，显症黄龙病的SIF产量明显大于其他3类叶片，这可能与自身叶绿素含量减少有关系。峰值位置的SIF产量表现出一定差异，4种类型叶片可以实现较好的区分识别。

图8 不同柑橘叶片样本的上行和下行SIF产量光谱 Fig.8 Upward and downward sun-induced Chlorophyll (SIF) yield spectra of different citrus leaf samples

图9显示了基于不同SIF产量指数的KNN算法对4种不同类型柑橘叶片的分类效果。比较两组上行SIF产量指数Up687和Up741的诊断效果（图9a、9b），健康和显症黄龙病叶片的分类真正率均达到了80.0%，基于Up741的模型较基于Up687的模型将未显症黄龙病和黄斑病的分类真正率从69.7%和61.5%分别提升到了75.8%和71.8%。分析两组下行SIF产量指数Dw687和Dw741的诊断效果（图9c、9d）可知，未显症黄龙病和黄斑病叶片的分类真正率均为78.8%，基于Dw687的模型对健康叶片和显症黄龙病叶片的分类真正率分别为82.2%和84.4%，基于Dw741的模型对健康和显症黄龙病叶片的分类精度均达到了85%以上。综合4种SIF产量指数来看，基于Dw741的KNN模型对显症黄龙病叶片的诊断精度最高，达到了88.9%，对其他3类叶片的识别精度较其他3种模型也较高或者相当，但对于未显症黄龙病和黄斑病叶片的识别精度仅为78.8%和73.3%，仍有一定的提升空间。为此，通过两个波段SIF产量进行比值处理，构建比值SIF产量指数，尝试进一步提升模型的诊断精度（图9e、9f）。基于Dw687/741的模型对未显症黄龙病和黄斑病的诊断精度均提升到80%左右，对健康叶片的诊断精度提升到了将近90%，对显症黄龙病的诊断精度无变化，为81.8%。反观基于两组上行SIF产量指数构建的比值SIF产量指数Up687/741，参与构建的KNN模型对相较于其他两组模型，对4种叶片的识别精度均有不同程度的提高，均达到了80%以上，其中对健康叶片和显症黄龙病叶片的识别精度分别为88.9%和91.1%，对未显症黄龙病叶片和黄斑病叶片的识别精度均超过80%，分别为84.8%和82.1%。综上所述，基于Up687/741的KNN模型对柑橘黄龙病的诊断精度最高。

图9 基于不同SIF产量指数的KNN分类结果 Fig.9 K-nearest Neighbor (KNN) classification results based on different Sun-induced Chlorophyll Fluorescence (SIF) yield indices

2.4 特征波段反射率模型与SIF产量指数模型的诊断精度对比

柑橘受黄龙病菌侵染后，内部生理生化指标发生一定程度的变化，这些指标的变化导致光谱的响应。由于未显症时期叶片组织内部生化组分含量的变化十分微弱，或使反射率光谱对其进行准确识别存在一定困难。而黄斑病与黄龙病症状相似度较高，使反射率光谱模型对其进行识别时常出现误判（图9）。如果在实际应用中对黄斑病植株误判为黄龙病植株进行挖除，将会对果农造成不可挽回的损失。因此本研究设计的4种类型柑橘叶片都需要有较高的诊断精度。由2.1节可知，柑橘的光合作用在未显症时期已经遭到破坏，而SIF技术正是光合作用的探针，在田间对黄龙病进行原位检测值得探索。对比分析基于特征波段反射率和SIF产量指数的KNN模型的总体分类精度可知（表2），SIF产量指数模型的分类精度除Up687模型精度与特征波段反射率模型相当外，其余均优于特征波段反射率模型。基于单峰位置SIF指数的总体识别正确率均在80%左右，基于双峰位置的比值SIF指数的总体识别正确率则达到了85%以上，其中基于Up687/741的KNN模型的正确率最高，达到了87.0%，且对于每类叶片的分类准确率均是所有模型里最高的。结合图8与图4b分析可知，由于显症黄龙病叶片的叶绿素含量显著低于健康叶片和黄斑病叶片，致使上行SIF和下行SIF在红光区域的重吸收效应减弱，因此显症黄斑病的上行SIF和下行SIF在687 nm的峰值位置处均大于其他3类叶片。由于叶绿素对红光区域的SIF的重吸收，使得红光区域SIF与远红光区域SIF的比值能够反映叶片受黄龙病菌侵染而造成的胁迫状态，这可能是比值SIF指数模型诊断精度较高的原因。这与前人的研究结果是一致的。

表 2 基于特征波段反射率和SIF产量指数的KNN模型的总体精度对比 Table 2 Overall accuracies of K-nearest Neighbor (KNN) models based on reflectance of optimal wavebands and Sun-induced Chlorophyll Fluorescence (SIF) yield indices

3 讨 论

柑橘黄龙病主要由韧皮部杆菌属类细菌Liberibacter 引起，属于革兰氏阴性细菌，影响中国的主要为亚洲种（Liberibacter asiaticus，Las）病菌。由于黄龙病菌潜伏期较长，侵染柑橘后并不立即显症，但其传染性与危害性在新宿主已经存在。因此在黄龙病菌侵染柑橘初期（未显症黄龙病时期），控制蛋白合成的基因受病菌影响或上调表达或下调表达，下调表达的基因可能控制着酶的合成，从而使酶数量较少，活性减弱，直接造成减小（图4a），叶片光合作用被极大削弱（图3）。而上调表达的基因可能使筛管阻塞蛋白含量增加进行阻塞防御，亦阻塞了糖类等营养分子的运输，导致根系无法及时吸收利用有机营养，导致根系吸收矿质元素能力下降，从而造成柑橘植株地上部分缺乏部分矿质元素（如N、Fe、Mg、Zn等），而这些元素与叶绿素合成有关，任一元素含量的减少都将导致黄化症状，此时已进入黄龙病的显症时期。图4b显示的未显症黄龙病柑橘叶片的叶绿素含量略高于黄龙病叶片的原因可能是因为在柑橘宿主与黄龙病病原菌互作的过程中，病原操纵宿主一些其他生物学过程引发了植物的防御反应。

尽管研究提出的模型对柑橘黄龙病的原位快速诊断取得了较好的效果，但诊断精度仍有较大的提升空间，对SIF光谱进行进一步的预处理，不同SIF指数的构建，多种分类算法的进一步尝试都有可能不同程度提高对黄龙病的诊断精度。对不同生育阶段、不同品种、不同气候类型下的柑橘组合研究更有利于提高模型的普适性和应用价值。

4 结 论

1）黄龙病菌的侵染使柑橘叶片光合色素含量发生显著变化，未显症时期含量升高，显症时期降低；黄龙病菌的侵染使柑橘叶片光合作用明显减弱，在未显症时期已经表现出来；

2）基于CARS算法提取的特征波段反射率构建的KNN分类模型对健康柑橘叶片的分类正确率为82.2%，对未显症黄龙病和显症黄龙病的分类正确率分别为72.7%和75.6%，21.2%的未显症黄龙病被诊断为健康，对黄斑病的分类正确率为64.1%，23.1%被误诊为显症黄龙病；

3）基于687和741 nm SIF产量峰值位置构建的上行比值SIF产量指数Up687/741结合KNN模型对显症柑橘黄龙病的诊断精度达到了91.1%，对未显症黄龙病达到了84.8%，均优于特征波段反射率模型，说明其对于潜伏期黄龙病的诊断具有一定的优越性，为实现柑橘黄龙病的田间原位、快速、早期诊断提供了参考。