河西走廊产区酒球菌酯酶活性对葡萄酒酯类香气物质的影响

祝 霞，赵丹丹，李俊娥，韩舜愈，杨学山

河西走廊产区酒球菌酯酶活性对葡萄酒酯类香气物质的影响

祝 霞1,2，赵丹丹1，李俊娥1，韩舜愈1,2，杨学山1,2※

（1. 甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州 730070； 2. 甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，兰州 730070）

试验以2株本土GF-2、ZX-1和商业菌株VP41为供试菌株，在模拟酒中动态监测苹果酸-乳酸发酵过程中菌株的C2、C4、C6酯酶活性，分析比较不同初始pH值、乙醇浓度、SO2添加量和发酵温度对菌株产酶规律的影响；通过微酿试验探讨供试菌株对霞多丽干白葡萄酒香气品质的影响。结果表明，在不同pH值条件下，本土菌株的酯酶活性明显高于商业菌株VP41，其中ZX-1的最大酯酶活性比VP41的高出约63.42%；乙醇浓度8%时，所有供试菌株均具有最大酯酶活性，且本土菌株具有更强的产酶能力；在不同SO2添加量影响下，2株本土的酯酶累积活性均显著高于VP41（<0.05）；18、22 ℃发酵温度下，GF-2的酯酶活性显著高于菌株VP41（<0.05）。供试菌株的总酯酶活性依次为ZX-1、GF-2、VP41；最佳产酶条件均为乙醇浓度12%、pH值3.6、SO2添加量30 mg/L、发酵温度22 ℃，其中以ZX-1的酯酶活性累计量最高（620.97 mU/mL）。与商业菌株VP41相比，经本土GF-2、ZX-1菌株发酵的酒样具有更浓郁的果香和良好的余香持久性。综合分析，本土与商业菌株均可以成功完成苹果酸-乳酸发酵，尤其是ZX-1菌株具有较强的产酯酶能力，可有效提升霞多丽干白葡萄酒中的果香和花香类化合物含量，明显增强酒体的地域风格和典型性。

酶；活性；葡萄酒；酒酒球菌；苹果酸-乳酸发酵；酯类化合物

0 引 言

酿酒葡萄在发酵微生物的作用下发生一系列复杂生物转化反应，形成种类丰富、特征各异的挥发性香气化合物，是赋予葡萄酒风格和典型性的关键因素[1]。由触发的苹果酸-乳酸发酵（Malolactic Fermentation，MLF）具有降低酸度[2]、增加生物稳定性[3]、改善酒体色泽[4]、修饰葡萄酒风味等作用，是酿造优质干红和部分干白葡萄酒的必要生产工艺[5]。受种植和栽培条件影响，河西走廊产区葡萄酒普遍存在香气强度低，余香持久性差的质量缺陷。优良的微生物菌株不但能顺利启动并完成发酵，而且还能合成和释放促进香气化合物生物转化的糖苷酶、酯酶等风味酶，提升葡萄酒的香气品质[6-7]。已有研究表明酯类化合物具有较低的阈值和浓郁的水果香味，其浓度的变化对葡萄酒香气的浓郁度和持久性具有重要影响[8]。葡萄酒发酵过程中酯酶的潜在底物特异性决定了酯类化合物的种类和含量，对葡萄酒特征香气的形成具有重要贡献[9]。与酿酒酵母（）相比，合成的酯酶在高糖、高酒精度及低pH值的葡萄酒生境中可保持更高的催化活性[10]。然而的生长和代谢受到葡萄酒发酵条件（温度、pH值、SO2浓度和乙醇浓度）的直接影响，且的抗胁迫能力因菌株而异。Sico等[11]的研究表明温度和乙醇浓度对菌株酯酶活性的影响不同，供试菌株在30～40 ℃之间的酯酶活性最大，的生长随着乙醇浓度的升高呈线性下降。此外，葡萄酒中富含多种酯酶作用的底物，这些底物的种类和数量也决定着酯酶活性的强弱。Sumby等[9]对C2～C10酯酶活性研究发现，其对不同碳链长度的底物反应具有特异性。酯酶的潜在底物特异性决定了葡萄酒中酯类化合物的构成，且其含量与碳链长度成反比[12]；同时脂溶性酯类物质的跨膜转运会随着碳链长度的增加而大幅下降，其中己酸乙酯可以100%释放到细胞外，而癸酸乙酯只有8%～17%被转移[13]。由于只有被高效释放到细胞外的酯类才可被消费者感知，因此，在MLF过程中主要通过C2～C6酯酶影响酯类香气物质的合成。此外，菌株间代谢能力的差异会影响合成酯酶的活性及底物特异性，进而影响葡萄酒的香气特征[14]。目前，国内相关研究主要集中在对不同商业在MLF中的降酸作用以及对葡萄酒香气品质的影响，但对于本土菌株的发酵特性及其在干白葡萄酒中的应用，尤其是菌株对酯类香气化合物的修饰机制还鲜有报道。本试验通过在模拟酒中动态监测MLF中2株本土和1株商业菌株对不同碳链长度底物（C2～C6）的酯酶活性，分析供试菌株在不同酿造因子影响下的产酶规律特征，探索酯类化合物与菌株酯酶活性的响应机制，以期为生产代表河西走廊产区风土的典型葡萄酒提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本土酒酒球菌菌株：GF-2、ZX-1、QL-11、MG-1由甘肃省葡萄与葡萄酒重点实验室分离鉴定并保存。商业酒酒球菌：VP41，购自上海杰兔责任有限公司。商业酿酒酵母：ES488，购自意大利Enartis公司。霞多丽酿酒葡萄：2019年产自甘肃莫高酒业有限公司葡萄种植基地，含糖量约为21.3 °Brix，总酸6.87 g/L（以酒石酸计），pH值3.36。

1.2 培养基与试剂

ATB培养基配制参考Sumby等[4]的方法配制：葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，盐酸半胱氨酸0.5 g/L，番茄汁质量分数25%。液体培养基使用1 mol/L NaOH调pH值至4.8，固体培养基加20 g/L的琼脂，121 ℃灭菌20 min。

参考Sico等[11]方法进行模拟酒培养基的配制：葡萄糖1 g/L、果糖1 g/L、L-苹果酸2 g/L、海藻糖1 g/L、酒石酸1 g/L、柠檬酸1 g/L、乙酸钠0.14 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、水解酪蛋白2.5 g/L、KH2PO40.3 g/L、KCl 0.22 g/L、L-型半胱氨酸盐酸0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.065 g/L、MnSO4·4H2O 0.015 g/L、CaCl20.065 g/L、甘油3 mL/L。

香气标准品：乙酸戊酯、乙酸庚酯、3-羟基丁酸乙酯、己酸甲酯、苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、乙酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯等香气标准品和内标物2-辛醇均购自美国Sigma公司。

其他试剂：4-硝基苯基乙酸酯（-nitrophenyl acetate，-NPA）、4-硝基苯基己酸酯（-nitrophenyl butyrate，-NPB）、4-硝基苯基丁酸酯（-Nitrophenyl hexanoate，-NPH），购自上海源叶有限责任公司；氢氧化钠、柠檬酸、磷酸二氢钾、碳酸钠，均为分析纯试剂，购自甘肃中瑞化工有限公司。

1.3 仪器与设备

SPX-150-Ⅱ生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司），PHS-3CpH计（上海雷磁责任有限公司），TU-1810可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），SW-CJ-2FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），H2050R高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），TRACE 1310-ISQ 气相色谱质谱仪（美国Thermo Scientific公司），ISQ 型单四级杆质谱仪（美国Thermo Scientific 公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 高产酯酶本土酒酒球菌菌株筛选

挑取斜面保存的菌种接种于ATB培养基，28 ℃培养至OD600约为1.1（菌落数约为107CFU/mL）时，转接于模拟酒体系，28 ℃发酵14 d，每隔48 h取样。为便于直观比较各菌株不同酯酶活性，参考李婷等[13]方法，采用酶活性累积量（mU/mL），即同一菌株、同一种酶的7次测定结果逐次相加，表征比较4株本土及1株商业菌株酯酶活性的差异。各样重复3次。

为提高样品酶活性测定效率、缩短反应时间，参照Matthews等[12]方法并进行优化。优化后酶活性测定体系为：分别将80L 25 mmol/L的-NPA、-NPB和-NPH，与200L菌悬液、1 820L pH值为5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液混合均匀，50 ℃反应30 min，再加入200L Na2CO3溶液（0.5 mol/L）终止反应，400 nm波长测定处吸光值。根据标准曲线（=2.264 9–0.006 2，2=0.999 1）计算最终酶活性。酶活性单位的定义（U）：50 ℃条件下，每mL菌体细胞每min释放1mol对硝基苯酚所需的酶量（mol/(min·mL)）。

1.4.2 不同发酵因子对菌株酯酶活性的影响

将菌株经ATB培养基活化、扩培后，以1×107CFU/mL，依次接种于同一因子的不同处理水平组模拟酒中，其中初始pH值为3.0、3.2、3.4、3.6、3.8（HCl或NaOH调整），乙醇体积分数为6%、8%、10%、12%、14%（无水乙醇调节），SO2添加量为15、30、45、60、75 mg/L（用Na2S2O5调节），发酵温度为18、20、22、25、28 ℃。每隔48 h取样，分别测定发酵液中C2、C4、C6酯酶活性，以各处理水平条件下C2、C4、C6酯酶的总和为依据，筛选较佳产酶条件。试验重复3次。

1.4.3 正交试验设计

根据单因素试验结果，并结合葡萄酒MLF过程中pH值、乙醇浓度、SO2添加量、发酵温度等的实际参数水平，采用L9(34)正交试验（表1），分析供试菌株的总酯酶活性（C2、C4、C6酯酶之和）的变化规律。

表1 L9(34)正交试验因素水平

1.4.4 微酿试验

1）菌株活化

ES488酿酒酵母菌株参考刘琦[14]方法，按推荐用量（0.2 g/L）加入等体积的葡萄汁于28 ℃活化25 min后接种，酒酒球菌菌株活化同1.4.1。

2）酵母菌菌株活化

参照干白葡萄酒生产工艺[15]，在除梗、破碎的霞多丽葡萄中加入果胶酶（20 mg/L）和60 mg/L SO2后，对其进行压榨、皮渣分离，装入5 L发酵瓶中4 ℃澄清，按0.2 g/L接种酿酒酵母ES488，在试验优化的最优产酶条件下进行酒精发酵（Alcoholic Fermentation，AF）至残糖质量浓度4.0 g/L时，进行倒罐处理去酒泥，将菌株ZX-1、GF-2按1×107CFU/mL进行接种，以商业菌株VP41作为参考。自接入菌株开始，每隔48 h取样，测定-苹果酸质量浓度＜0.2 g/L时结束MLF发酵。取样测定理化指标和挥发性香气化合物。

3）-苹果酸和干白葡萄酒理化指标测定

-苹果酸含量检测参考试剂盒说明书进行。参照《葡萄酒分析检验》及GB/T 15038-2006[16]中的方法进行残糖、酒精度、pH值、总酸、挥发酸、总SO2等指标测定。

4）挥发性香气化合物测定

参照刘琦[14]香气物质萃取方法及气相色谱-质谱（Gas Chromatography-Mass Spectrometry）GC-MS条件，于15 mL的顶空瓶中加入2.5 g氯化钠、8 mL酒样、20L 2-辛醇（浓度81.06 mg/L），加磁力搅拌转子后封口，放入恒温加热磁力搅拌器中，40 ℃水浴平衡30 min后，顶空萃取30 min。

GC-MS条件：色谱柱DB-WAX 60 m×2.5 mm× 0.25m，不分流进样。载气（He）流速1 mL/min，进样口温度240 ℃，解析时间5 min；柱温升温程序：50 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min；质谱为电子轰击离子源（Electron Impact，EI），电子能量70 eV，传输线温度180 ℃，离子源温度200 ℃，扫描范围50～350 m/z。

定性与定量分析：采用与标准香气成分保留指数（Retention Index，RI）对比的方法结合NIST-11、Wiley及香精香料标准谱库检索比对结果进行挥发性香气化合物的定性分析。对于已有标准品的香气化合物通过内标标准曲线法进行定量，其他香气化合物含量利用内标法进行相对定量分析，内标物为2-辛醇。

1.4.5 感官评价

参照Englezos等[17]的方法。9名经过葡萄酒品鉴培训的人员（5女，4男）对随机编号的各酒样进行3轮盲品。根据评价标准从外观、香气和口感3个方面，使用10分结构化数值尺度来量化（表2）。0～10表示感觉强烈程度逐渐增大。

表2 葡萄酒感官评价标准

1.4.6 试验数据处理

对试验所得数据采用Microsoft Office Excel 2010，Origin 2018进行基本处理和作图，IBM SPSS Statistics 19.0 软件进行多重比较（Duncan法，＜0.05）及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 高产酯酶本土酒酒球菌菌株筛选

由表3可知，对4株供试本土的3种酯酶活性比较发现，菌株GF-2、ZX-1的C2、C4、C6酯酶活性均显著高于菌株QL-11、MG-1的酶活性（＜0.05）。与商业菌株VP41相比，菌株GF-2、ZX-1的酯酶活性明显较高（＜0.05），QL-11、MG-1的酯酶活性则低于菌株VP41。因此，选择菌株GF-2、ZX-1为后续供试菌株。

表3 5株O.oeni（4株本土菌株+1株商业菌株）酯酶活性测定

注：字母A～E表示在<0.05水平下组间具有显著性差异，下同。

Notes: Alphabet A to E indicate significant differences between groups at the<0.05 level, the same below.

2.2 不同发酵条件对本土酒酒球菌酯酶活性的影响

由图1a可知，pH值对供试菌株的3种酯酶活性影响显著。本土菌株（GF-2、ZX-1）均在pH 值3.6时具有最大酯酶累积活性，而商业菌株VP41产生最大酯酶活性的pH值为3.8；在不同pH值条件下，本土菌株的酯酶活性明显高于VP41，其中ZX-1的最大酯酶活性（1 099.97 mU/mL）比VP41的（673.06 mU/mL）高出约63.42%。pH值较低时（3.0），菌株GF-2比ZX-1具有更好的产酯酶能力；但随pH值升高，ZX-1的酯酶活性上升更快。乙醇浓度与菌株酯酶累积活性呈负相关变化（图1b）。供试菌株均在乙醇浓度8%时均产生了最大酯酶活性，分别为1 076.17 mU/mL（ZX-1）、1 001.96 mU/mL（GF-2）、647.58 mU/mL（VP41），且相互间差异显著（＜0.05）。在不同乙醇浓度梯度下，本土的酯酶活性均显著高于商业菌株VP41。

如图1c所示，随着SO2添加量的增加，供试菌株的酯酶活性均呈现先上升后下降的趋势，在SO2添加量为30 mg/L时，所有菌株均表现出最大酶活性。当SO2添加量在15～75 mg/L范围内时，本土的酯酶累积活性均显著高于VP41的酶活性（<0.05）。在SO2添加量为75 mg/L条件下，菌株ZX-1、GF-2的酯酶累积活性分别是商业菌株VP41的1、1.3倍。不适宜的发酵温度会导致杂菌的生长或发酵延迟，从而破坏葡萄酒的感官质量[18]。的最适生长温度是25～28 ℃，而葡萄酒的MLF温度一般为18～22 ℃，因此，选择在18～28 ℃不同温度下，对菌株酯酶活性变化情况进行测定分析。由图1d可知，随着发酵温度的升高，菌株VP41的酯酶累积活性逐渐升高，且在28 ℃时产生最大酶活性（830.86 mU/mL），而本土在18 ℃时有最大酯酶活性，分别为661.20 mU/mL（ZX-1）、794.88 mU/mL（GF-2）。其中在18、22 ℃发酵温度下，GF-2的酯酶活性显著高于菌株VP41（<0.05）。

2.2 复合发酵条件下菌株酯酶活性

在葡萄酒中的生长代谢，不仅受到葡萄酒复杂基质的影响，还与发酵参数间的协同作用有关[19]。因此，分析复合发酵条件下各菌株的酯酶活性，可反应葡萄酒酿造过程中的实际发酵行为。

由表4可知，不同复合发酵条件下各菌株的酯酶活性累积量不同，而在相同发酵参数下菌株间的酶活性也存在差异，供试菌株总酯酶活性依次为ZX-1>GF-2>VP41。从极差可知，不同发酵因素对菌株ZX-1酯酶活性累积量影响的主次顺序为：SO2添加量、pH值、乙醇浓度、发酵温度；影响菌株GF-2产酶活性的主次因素为：SO2添加量、乙醇浓度、pH值、发酵温度；菌株VP41影响因素的主次顺序为：SO2添加量、发酵温度、pH值、乙醇浓度。所有供试菌株的最优产酶条件均为：乙醇浓度12%、pH值3.6、SO2添加量30 mg/L、发酵温度22 ℃。

表4 酯酶活性累积量测定的正交试验结果

由表5可知，SO2添加量对所有供试菌株的酯酶活性有极显著影响（<0.01）。pH值、乙醇浓度对菌株ZX-1、GF-2的酯酶活性有显著影响（<0.05）；发酵温度、pH值对菌株VP41的酯酶活性有显著影响（<0.05）。

表5 酯酶活性正交试验方差分析

注：“**”表示影响极显著（<0.01），“*”表示影响显著（<0.05）。

Notes: The sign “**” means the impact is extremely significant (<0.01), and “*” means the impact is significant (<0.05).

2.3 微酿试验结果

根据正交试验结果，在最优产酯酶条件下对霞多丽干白葡萄酒进行MLF，分析酯类物质的变化特征，比较验证各菌株对葡萄酒香气品质的影响作用。

2.3.1 葡萄酒理化指标

由表6可知，各酒样中-苹果酸质量浓度均<0.2 g/L，表明MLF成功完成，且主要理化指标均符合国标（GB/T15037-2006）要求。与对照未接种MLF组（CK）相比，MLF发酵后，霞多丽干白葡萄酒pH值升高0.11～0.16，总酸质量浓度降低2.48～2.62 g/L。虽然酒样中挥发酸含量有所升高，但最大值为0.42 g/L（<1.2 g/L），符合国标要求。此外，本土菌株在第12 d就可完成MLF，而商业菌株则需14 d，因此本土菌株可更快地适应葡萄酒生境，具有更高的发酵效率。

表6 苹果酸-乳酸发酵前后干白葡萄酒样理化指标

2.3.2 葡萄酒样中酯类化合物分析

1）酯类化合物GC-MS检测结果

气味活性值（Odor Activity Value，OAV）是评价单一香气化合物对整体香气的贡献程度的指标。研究发现，OAV值>0.1的香气成分通过叠加作用，也对葡萄酒香气特征具有积极贡献。表7为不同处理条件下，各酒样中主要酯类物质（OAV>0.1）的总含量依次为ZX-1>GF-2>VP41>CK。菌株VP41的酯类化合物含量显著低于本土菌株（<0.05），与酶活性累积量测定结果一致。尤其是ZX-1处理组的乙酸异戊酯、乙酸己酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯等具有潜在花香和果香味的物质含量显著增加（<0.05）。总体而言，虽然商业与本土菌株发酵后酒样中的主要酯类物质种类差别不大，但其含量却存在显著差异（<0.05）。总体而言，本土菌株更有利于酯类香气的合成释放。

表7 各处理酒样中主要酯类物质的变化

2）主成分分析

对检测到的17种主要酯类化合物进行主成分分析，得到PC1和PC2的方差贡献率分别为79.592%、15.376%，累积方差贡献率为94.968%。各酯类化合物在PC1和PC2上的因子载荷图见图2。由图2可知，PC1正半轴上除了得分较高的乙酸己酯（苹果、樱桃）、乙酸异戊酯（香蕉，果香）、己酸乙酯（香蕉，青苹果）、辛酸乙酯（水果香，白兰地）等，乙酸苯乙酯（花香）、癸酸乙酯（果香，脂肪味）、乙酸乙酯（菠萝，清漆，香脂）等得分也较高，即PC1正半轴除了酯类化合物的特有水果香外还带有花香、脂香。同理，PC1负半轴包括乙酸异丁酯（甜香，果香）、丁酸乙酯（香蕉，草莓）、棕榈酸乙酯（苹果，菠萝）等果香，同时，丁二酸二乙酯（青草，葡萄，水果香）、辛酸戊酯（青草香，脂肪香，水果香）等具有特殊的青草香气特征。

图2得到PC1和PC2的累积方差为94.968%。GF-2、ZX-1分布在PC1正半轴，CK、VP41两个处理组处于PC1负半轴，这与具有果香味的化合物（乙酸己酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯）的含量有关。分布于PC1正半轴的GF-2、ZX-1处理组的上述香气化合物含量明显高于处于负半轴的CK和VP41。表明接种进行MLF对酒样酯类挥发性香气化合物的影响显著。且3株供试菌株在PCA图中呈分散型分布，特别是商业与本土菌株发酵酒样间的酯类物质构成特征存在明显差异，而本土菌株ZX-1与GF-2间的差异较小。

3）葡萄酒样感官分析

对发酵酒样中的感官特征进行分析（图3）后表明经过MLF后的霞多丽干白葡萄酒果香、花香味更突出。ZX-1组最典型，其次为GF-2、VP41组，与未接种MLF组（CK）差异较大，这主要是由于各菌株所具有的酯酶活性不同，进而导致了酯类香气物质的水解平衡差异，最终形成风格各异的香气品质。与CK相比，MLF后3个处理组酒样在外观（色泽、澄清度）方面均无明显变化；本土菌株GF-2、ZX-1发酵酒样的典型性、余味长短无明显差异，但均高于商业菌株VP41和CK处理组。综合分析，利用本土进行MLF后的葡萄酒花果香突出，酒体协调性、典型性较强。

3 讨 论

Betteridge等[24]研究发现，对葡萄酒生境具有良好的耐胁迫能力，是进行MLF的主导菌，可产生一系列具有潜在底物特异性的酯酶。的酯酶活性受多种因素的影响，如温度[20]、pH值[2]、乙醇等[17]。本研究发现pH值对所有供试菌株的酯酶活性影响均较显著，低pH值（3.0～3.2）明显抑制菌株酶活性。低浓度乙醇可提高膜的渗透性，使细胞内酯酶和底物之间更易接触，进而释放出更多产物。试验表明当乙醇浓度为8%时，供试菌株有最大酯酶活性，然而随着乙醇浓度的增加，膜结构被破坏，致使菌株的酯酶活性降低[4]。但这与Rodríguez等[25]认为不同乙醇浓度可影响菌株的生长参数，却不影响酯酶活性的研究结果存在差异，这可能是因为试验菌株间的特性差异及选取乙醇浓度范围不同导致的。SO2分子可穿过细胞膜，扩散进入细胞，影响生长和其产酶能力[26]，因此随着SO2浓度的增加，供试菌株的酯酶累积活性也有所降低，但对SO2的敏感性取决于菌株和培养条件[27]。通常情况下，酿酒过程中面临着多个酿造因子的协同作用，与单一因素作用相比，复合条件下菌株的酯酶活性显著降低[28]。因此，酿造因子之间的交互作用及其对菌株合成分泌酯酶的内在作用机制，有待进一步研究。

酯类化合物对葡萄酒香气品质的形成具有重要作用，赋予酒体浓郁的果香和花香气味[29-31]。González-Centeno等[22]分别将霞多丽葡萄酒置于橡木桶和不锈钢桶中进行MLF，结果显示，在橡木桶中进行MLF的葡萄酒坚果味更浓郁，而在不锈钢桶中进行MLF的霞多丽葡萄酒柑橘味和花香味更突出。Gambetta等[23]报道指出，霞多丽葡萄酒进行MLF后，在直链脂肪酸乙酯中，辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯等物质的含量高于阈值，使葡萄酒呈现了梨、苹果、菠萝或花香等香气特征。曲昆生等[32]对比了MLF发酵前后“威代尔”冰白葡萄酒的香气化合物差异，与只进行酒精发酵的酒样相比，经过MLF处理的酒样中苹果酸含量有所下降，脂肪酸乙酯类物质含量提高了34.71%，葡萄酒的果香味强度增加，这与本试验结果一致。影响葡萄酒中酯类化合物种类和数量因素很多（葡萄品种、酵母菌和乳酸菌的选择），其净积累量决定于酵母菌和乳酸菌的酯酶催化合成与水解能力之间的平衡[33]。我们的工作进一步证实，葡萄酒中表达的酯酶活性水平具有菌株依赖性。因此，可以通过酶基因结构、转录调控和动力学等方面的研究，深入探讨葡萄酒MLF条件下酯类物质产生差异的原因。

4 结 论

1）供试菌株在不同酿造因子下呈现出不同的酯酶活性，其中SO2添加量对菌株产酶能力影响极显著（<0.01），pH值影响显著（<0.05），乙醇浓度与发酵温度分别对本土和商业菌株影响显著（<0.05）。复合发酵试验结果表明：供试菌株总酯酶活性依次为ZX-1、GF-2、VP41，影响ZX-1酯酶活性累积量的主次因素顺序为：SO2添加量、pH值、乙醇浓度、发酵温度；最优的产酶条件为：乙醇浓度12%、pH值3.6、SO2添加量30 mg/L、发酵温度22 ℃，此条件下ZX-1的酯酶活性可达620.97 mU/mL，表现出较强的葡萄酒生境适应能力。

2）霞多丽干白葡萄酒微酿试验结果表明，供试菌株具有较好的-苹果酸降解能力，能够顺利完成苹果酸-乳酸发酵，且各酒样的理化指标均符合国标要求。气质联用及主成分分析显示，苹果酸-乳酸发酵对酒样的酯类香气物质影响显著，且经不同菌株发酵酒样间的酯类化合物种类及含量也不相同，特别是本土与商业菌株间的差异显著（<0.05）。因此，使用具有较高酯酶活性的本土菌株进行苹果酸-乳酸发酵，更有利于河西走廊产区高品质葡萄酒的酿造生产。

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Effects of esterase activity of alcoholicus in Hexi Corridor production areas on ester aroma compounds in wine

Zhu Xia1,2, Zhao Dandan1, Li Jun’e1, Han Shunyu1,2, Yang Xueshan1,2※

(1.,,730070,; 2.,730070,)

The aim of this study was to evaluate the effects of fermentation conditions on the cumulative esterase activity of(.) autochthonous strains in the Hexi Corridor region, particularly in the aromaticesters of Chardonnay dry white wine during the Malolactic Fermentation (MLF). Twoautochthonous strains, such as GF-2 and ZX-1, were preserved by the Gansu Key Lab Viticulture and Enology, and one commercial strain VP41 was used to test strains. The esterase activities of various carbon chain length substrates (C2, C4, C6) were detected in the simulated wine during MLF process. The fermentation conditions were selected to analyze the esterase characteristics produced by thestrains, including the initial pH value, ethanol concentration, SO2addition, and fermentation temperature. A microvinification experiment was performed to explore the modification effect of the tested strains on the aroma quality of Chardonnay dry white wine. The esterase activities ofautochthonous strains were significantly higher than those of commercial strain VP41 under different pH values, where the maximum esterase activity of ZX-1 was about 63.42% higher than that of VP41. When the concentration of ethanol was 8%, all the tested strains produced the maximum esterase activity, indicating theautochthonous strain had strong esterase producing ability. Under the different SO2additions, the cumulative esterase activities of twoautochthonous strains were significantly higher than that of VP41 (<0.05), while, the esterase activity of GF-2 was significantly higher than those of strain VP41 at 18 and 22 ℃ (<0.05). Results of compound fermentation showed that the total esterase activity originated from ZX-1 was the highest, followed by GF-2 and VP41. There were different effects of the major and secondary factors on the esterase activity of each strain. An optimum condition was obtained for the esterase production of all tested strains: the ethanol concentration of 12%, pH value of 3.6, SO2addition of 30 mg/L, and the fermentation temperature of 22 ℃. The highest esterase activity of ZX-1 was 620.97 mU/mL, indicating that a strong adaptability to wine habitat. In the microvinification of chardonnay dry white wine, esters were identified in the wine samples after MLF. There were richer variety aroma and better fragrance persistence in the wines that fermented by autochthonous strains GF-2 and ZX-1, compared with the commercial strain VP41. Bothautochthonous and commercial strains can successfully complete MLF, especially ZX-1 has strong esterase production capability, depending mainly on the fermentation conditions. Therefore, the ZX-1 can be used to effectively improve the content of fruit and floral aroma compounds in the Chardonnay dry white wine, thereby to enhance the regional microbial terroir characteristics of wines. Theautochthonous strain ZX-1 was more suitable to be used as the MLF starter of dry white wine in the Hexi Corridor of Gansu Province.

ezymes; activity; wine;; malolactic fermentation; ester compound

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Zhu Xia, Zhao Dandan, Li Jun’e, et al. Effects of esterase activity of alcoholicus in Hexi Corridor production areas on ester aroma compounds in wine[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(1): 315-322. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.037 http://www.tcsae.org

2020-08-17

2020-12-15

国家自然科学基金地区基金项目（31760454，32060581）；甘肃省重点研发计划项目（17YF1NA060）；甘肃省葡萄酒产业发展基金项目（20180820-07，20180820-08）

祝霞，副教授，主要从事葡萄与葡萄酒风味品质调控研究。Email：zhux@gsau.edu.cn

杨学山，副教授，主要从事葡萄酒酿造微生物及风味品质调控研究。Email：yangxs@gsau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.037

TS261

A

1002-6819(2021)-01-0315-08