基于绿色荧光蛋白的冷鲜猪肉中大肠杆菌预测模型的构建

刘变芳，胡辉帆，张义奎，蔡 锦，杜双奎，李俊丽，曹梦茜，吕 欣

基于绿色荧光蛋白的冷鲜猪肉中大肠杆菌预测模型的构建

刘变芳，胡辉帆，张义奎，蔡 锦，杜双奎，李俊丽，曹梦茜，吕 欣※

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，杨凌 712100）

为了预测和监控冷鲜猪肉储存过程中腐败细菌大肠杆菌的变化规律，评估产品货架期，建立微生物生长预测模型。该研究将绿色荧光蛋白质粒pGFP转入大肠杆菌DH5α，构建GFP的标记大肠杆菌。基于绿色荧光蛋白报告基因和氨苄青霉素抗性，采用稀释平板法定量追踪检测0～24 ℃条件下冷鲜猪肉中DH5α生长变化。采用Gompertz模型、平方根模型和响应面方程进行数据拟合，构建数学预测模型。结果表明Gompertz模型拟合效果良好，0～20 ℃条件下决定系数2为0.96～0.99。温度与最大比生长速率平方根、延迟期倒数平方根模型2分别为0.862、0.948。响应面模型揭示时间、温度对大肠杆菌的生长影响显著(<0.05)，二者交互作用明显，响应面模型2为0.815。模型能够有效拟合冷鲜猪肉中与温度、时间相关的大肠杆菌的生长变化规律，研究结果为产品储存过程中细菌变化预测提供理论依据。

温度；模型；冷鲜猪肉；大肠杆菌DH5α；追踪检测；Gompertz预测模型

0 引 言

近年来，冷鲜猪肉已逐步成为各大城市肉品消费的主流，而随着生活水平的不断提高，人们对其质量与安全问题越来越关注[1]。冷鲜猪肉营养丰富，含水率高，极易受微生物污染，特别是在生产、加工、销售过程如果冷链系统不完善，温度条件控制不当，微生物就会迅速增殖，加速肉的腐败变质，最终对公共健康构成潜在的威胁[2-3]。大肠杆菌来源于人和动物的肠道，广泛存在水、土壤、空气等生活环境中，是冷鲜猪肉中的一类主要腐败菌，也是食品必须检测的细菌指标。新鲜和冷冻的猪肉、牛肉以及相关的肉制品中，普遍存在肠杆菌科微生物。一些肠道致病菌如沙门氏菌、志贺氏菌、产毒素大肠杆菌等和普通大肠杆菌来源和在环境中生长条件基本一致，食品中的大肠杆菌污染指标也是这些肠道致病菌污染情况的一个间接指示[4-5]。因此，追踪检测并预测冷鲜猪肉生产、贮存和流通过程中的大肠杆菌的污染及生长变化规律，对预测鲜肉保质期，提高肉品质量和保障安全具有非常重要的实践意义[6]。

预测微生物学是运用微生物学、工程数学以及统计学对食品微生物进行数学建模，从而对微生物在食品加工、贮藏、流通等条件下的延迟、生长、残存和死亡进行定量分析[7-8]。预测食品中微生物的动态变化不仅可以对食品安全作出快速评估和预测，而且可用于食品货架期预测[9]。Gompertz模型是用来描述生物种群生长发育规律的数学模型，该模型最先是由英国数学家Benjamin Gompertz于1825年提出作为动物种群生长模型，用于描述种群的消亡规律[10-12]。模型在应用特点上适合那些S型曲线、病情发展先快后慢的病害曲线拟合。已被广泛用于食品微生物生长预测领域的Gompertz模型能够较好地用于描述单细胞微生物的典型生长曲线，分别用延迟期、最大比生长速率、最大菌落数来描述细菌生长的延迟期、指数期和稳定期的特征[13]。绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）基因是可以在细胞内稳定表达，不需要反应底物及其他辅助因子，无种属组织特异性，且产物GFP对细胞无毒性，检测简单，结果真实可靠的新型报告基因。近年来GFP报告基因广泛应用于肠道细菌的快速标记检测研究中[14-16]。食品安全国家标准GB 4789.2-2016[17]规定食品的细菌总数检测采用稀释平板法，大肠菌群检测采用MPN值测定方法，这些方法要求对产品随机抽样检测，检测程序中微生物需要经历多次培养，方法不仅费时费力，而且较难及时反映总体消费的安全性。预测微生物学的优势则在于利用现有的数据去预测未来发展趋势，对实际生产和流通过程进行微生物预测和监控，保证产品的安全性。本研究将绿色荧光蛋白质粒（Plasmid of Green Fluorescent Protein, pGFP）标记的大肠杆菌（DH5α）定量转接到冷鲜猪肉介质中，追踪检测不同温度条件下大肠杆菌的生长变化规律，构建数学预测模型，为快速监控和预测冷鲜猪肉产品中微生物的污染情况提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

大肠杆菌DH5a，绿色荧光蛋白质粒pGFP（含有氨苄青霉素Amp抗性基因），均由本实验室保存。LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂粉15 g，1 000 mL蒸馏水。配置后调整pH值至7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。试验所用4 ℃鲜猪肉购自超市，选取前腿肉，用绞肉机绞碎。主要试剂：乙醇，氯化钠，葡萄糖，硫酸等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；氨苄青霉素，胰蛋白胨，酵母粉，琼脂粉等均为分析纯，购自上海生工生物工程有限公司。

倒置荧光显微镜CFM-500、手提式紫外分析仪WFH-203、日立紫外-可见光分光光度计3900H（上海长方光学仪器有限公司）；冷冻离心机TDL-36C（上海精密仪器有限公司）；精装绞肉机SZ-32（广州旭众食品机械有限公司）；高压蒸汽灭菌锅MLS-3020CH（上海申安医疗器械厂）；洁净工作台SW-CJ-ZFD（苏州安泰空气技术有限公司）；智能生化培养箱HWS（宁波江南仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 构建GFP标记大肠杆菌DH5α

制备DH5α感受态细胞，从37 ℃过夜培养LB平板上挑取单菌落，转接到100 mL LB培养液中，37 ℃震荡培养至吸光度OD600值为0.45。培养物移至聚丙烯离心管中，冰上放置10 min，4 ℃，4 200×离心10 min收集细胞。10 mL，0.1 mol/L 的预冰冷的CaCl2重悬细胞沉淀，冰浴。重复1次低温离心，2 mL 0.1 mol/L 预冷CaCl2悬浮，分装，−80 ℃冰箱保存备用。

pGFP质粒转化DH5α菌株。取新鲜DH5α感受态细胞200L，置于1.5L离心管中，加入pGFP质粒2L，轻轻旋转混匀，冰上放置30 min。42 ℃水浴锅热激90 s，加入LB培养液800L，37 ℃摇床培养45 min后，涂布接种到在含80g/mL 氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃过夜培养。第二天，筛选抗氨苄青霉素的转化子并用倒置荧光显微镜检测GFP表达，将稳定表达GFP的单菌落划线转接抗性平板纯化扩增后，用含体积分数16%甘油的LB培养液重悬，于−80 ℃冷冻保藏，备用[18-19]。

1.2.2 GFP标记大肠杆菌DH5α生长曲线测定

将−80 ℃冷冻保藏稳定表达GFP的大肠杆菌DH5α划线接种氨苄青霉素抗性平板活化，37 ℃过夜培养。第2天挑取单菌落转接到含5 mL LB培养液试管中，摇床培养至OD600值为0.45，按体积分数1%接种比例转接至100 mL新鲜LB培养液中，37 ℃摇床培养，分别在0、1.5、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、22.0和24.0 h取2 mL菌液测定OD600值，并以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制细菌生长曲线[20]。大肠杆菌DH5α用LB培养基活化培养，作为对照菌株测定其生长曲线。

1.2.3 冷鲜猪肉样品处理及GFP标记大肠杆菌DH5α的测定

参考中国现行分割鲜、冻猪瘦肉卫生标准GB/T 9959.2-2008[21]中规定的微生物指标，菌落总数≤1×106CFU/g，大肠菌群≤1×104MPN/100 g，沙门氏菌不得检出。本试验对购自超市的冷鲜猪肉细菌总数和大肠菌群进行检测，选择符合卫生标准的冷鲜猪肉作为本试验研究材料。取500 g冷鲜猪肉用绞肉机绞碎，用无菌注射器定量接种GFP标记大肠杆菌DH5α菌液，混匀。测定菌液的OD600值，按照菌液OD600值等于1时细胞浓度约为108个/mL，根据实测菌液的OD600值按比例计算500 g猪肉样品中需要接种的菌液量，控制接种初始浓度为102个/100 g。比如测定菌液OD600值为0.2，则其细胞浓度为2×107个/mL，稀释1 000倍后细胞浓度为2×104个/mL，按比例计算500 g猪肉样品中应添加25L1 000倍稀释的菌液，则猪肉样品中细胞浓度为102个/100 g。对照组冷鲜猪肉样品绞碎但不接种细菌。样品放入锡箔纸杯并用保鲜膜封盖，放置托盘上分别放入0、4、8 ℃冰箱，12、16、20和24 ℃的生化恒温培养箱培养，定时取样检测大肠杆菌DH5α菌数。

冷鲜猪肉中大肠杆菌DH5α的测定，采用氨苄青霉素抗性LB平板稀释倾注法结合手提式紫外分析仪检测。0 ℃每24 h取样测定，4、8和12 ℃每12 h取样测定，16、20和24 ℃每8 h取样进行测定。称取样品25 g放入含225 mL无菌生理盐水三角瓶中，震荡混匀，进行10倍系列稀释。取稀释样品1 mL接种到无菌平皿，然后平皿中倾注含80g/mL 氨苄青霉素、50 ℃得营养琼脂，混匀冷却凝固后37 ℃培养48 h，进行菌落计数，并在手提式紫外分析仪下检测带绿色荧光菌落。选择3个连续的稀释度样品，每个稀释度做3个平行，无菌水做为阴性对照。

1.2.4 Gompertz初级模型的建立

Gompertz初级模型描述不同温度下大肠杆菌培养时间与细菌数量的关系，模型的决定系数2描述了试验拟合参数的相关性，2越接近1表明拟合度越高，参数之间的相关性越强[22]。采用1stOpt1.5软件进行数据模拟，过程优化算法选择麦夸特法（Levenberg-Marquardt)加通用全局优化法，结合模型均方根误差（Root Mean Squared Error，RMSE)、残差平方和（Residual Sum of Squares，RSS)判定模型适用性。

Gompertz方程式是双指数函数表达式为：

式中lg为细菌在时间时菌数的对数，lg（CFU/100 g）；是随时间无限减小时渐进菌数对数，（即初始菌落总数对数lg0）；是随时间增加菌数增量的对数，lg(max/0)；是时间为时相对最大比生长速率，h-1；为达到相对最大比生长速率所需时间，h。公式中、和为模型参数，由Gompertz方程拟合得出，为初始菌数对数值由试验检测得出。根据不同温度条件下的大肠杆菌检测数据，由Gompertz方程拟合得出、和参数，进而由公式推算大肠杆菌相关生长规律数据参数，包括延迟期（Lag Phase Duration，LPD）、最大比生长速率（max）和最大细胞浓度（Maximum Population Density，MPD）。其中最大比生长速率max=·/，=2.718 2；延迟期LPD=−(1/)；最大细胞浓度MPD=+。

1.2.5 平方根二级模型的建立

二级模型研究温度对于一级模型参数的影响，采用平方根模型拟合温度与最大比生长速率（max）平方根，以及温度与延迟期（LPD）倒数的平方根之间的关系[23]。利用初级模型计算最大比生长速率（max）和延迟期（LPD），平方根模型表达式如下：

式中是培养温度，℃；min是微生物没有代谢活动时的温度，℃，即在此温度下最大比生长速率为0；lag和k分别为2个方程的系数。

1.2.6 响应面模型的建立

试验数据采用Statistica 8.0软件拟合分析，对大肠杆菌在不同温度、时间下的生长规律建立双因素响应面二级模型。

1.2.7 预测模型的验证

不同温度试验条件下检测的大肠杆菌实际菌数值与模型预测值进行比较，使用数学检验参数偏差值（Bias factor，B）和准确值（Accuracy factor，A）判定模型的可接受性和准确性[24]。偏差值B是用来检查预测值上下波动的幅度，准确值A是用来衡量预测值和实测值之间的差异。当计算得到的B和A数值为1.0，表示预测值没有误差，数值1.1和0.9分别表示预测值的上下误差各为10%。B和A的计算公式如下：

式中lgpre是大肠杆菌生长数学模型预测得到的菌数对数lg(CFU/100 g)；lgobs是实际测得的大肠杆菌菌数对数lg(CFU/100 g)；是试验次数。

Gompertz初级模型的验证试验分别在0、4、8、12、16、20和24 ℃培养条件下，不同时间点共10次取样对大肠杆菌数进行检测和预测。响应面方程的验证试验在4、10、18 ℃培养条件下，分别在培养6、12、24 h共3次取样对细菌数进行检测和预测。依据公式（4）和（5）分别计算偏差值B和准确值A，评价模型的可靠性。

1.2.8 数据处理

试验数据分别采用软件1stOpt 1.5和Statistica 8.0进行分析，建立Gompertz模型、平方根模型和响应面方程。

2 结果与分析

2.1 DH5α大肠杆菌GFP标记检测及其生长曲线测定

通过化学转化法构建表达绿色荧光蛋白GFP的大肠杆菌DH5α。划线转接传代转化子3次于含氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃过夜培养，第二天用手提式紫外分析仪检测平板上的荧光绿色菌落，同时挑取单菌落涂于载玻片上，用倒置荧光显微镜检测稳定表达GFP的大肠杆菌DH5α，结果如图1所示。

结果揭示传代过程中构建的大肠杆菌可以稳定表达绿色荧光蛋白，同时具备氨苄青霉素抗性。在含80g/mL 氨苄青霉素的LB平板上手提式紫外分析仪检测到表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌菌落，同时在倒置荧光显微镜下观测到表达GFP的大肠杆菌DH5α，说明GFP作为报告基因和氨苄青霉素抗性作为筛选标记可以实现对大肠杆菌DH5α的追踪检测。

图2生长曲线测定结果表明GFP标记大肠杆菌DH5α培养过程呈现典型细菌的S型生长曲线，与对照菌株DH5α的生长趋势基本一致。0～2 h为迟缓期，2～10 h为对数生长期，10～16 h为稳定期，16 h以后进入衰亡期，符合一般细菌动力学生长规律。

2.2 冷鲜猪肉中大肠杆菌生长Gompertz预测模型的建立

GFP标记菌株DH5α定量接种冷鲜肉后，不同温度条件下定时取样，基于GFP标记和Amp抗性用稀释平板计数法进行追踪检测计数。试验数据采用1stOpt1.5软件拟合得到Gompertz一级模型曲线和参数值（见图3和表1）。

由图3可见在冷鲜猪肉中0℃条件下大肠杆菌生长非常缓慢，静置48h（2 d）后大肠杆菌数缓慢上升，0 ℃保持192 h（8 d左右）大肠杆菌菌落总数最大值为6.56 lg(CFU/100 g)。4和8℃条件下大肠杆菌生长缓慢，静置24h后大肠杆菌菌落总数明显上升，72h进入细菌生长稳定期，大肠杆菌菌落总数最大值分别为6.32和7.09 lg(CFU/100 g)。12、16、20和24℃条件下随着温度升高，细菌生长速度显著加快，延迟期明显缩短，并和温度呈正相关，接种后细菌很快进入对数期，最大值分别为7.47、6.97、7.53和10.04 lg(CFU/100 g)。

表1 冷鲜猪肉中大肠杆菌Gompertz初级模型参数

注：：菌落总数初始值，lg（CFU·100 g-1）；：随时间变化菌数增加量的对数值，lg (max·0-1)；：相对最大比生长速率，h-1；：达到相对最大比生长速率所需时间，h；max：最大比生长速率，h-1；MPD：最大细胞浓度，lg（CFU·100 g-1）；LPD：延迟期，h；2：模型决定系数；RMSE：均方根误差，lg（CFU·100 g-1）；RSS：残差平方和。

Note:: Initial total number of bacterial colony, lg (CFU·100g-1);: The logarithm value of the increase in the number of bacteria over time, lg (max·0-1);: Relative maximum specific growth rate, h-1;: The time required to reach the maximum relative specific growth rate, h;max: The maximum specific growth rate, h-1; MPD: Maximum population density lg (CFU·100 g-1); LPD: Lag phase duration, h;2: Determination coefficient of model; RMSE: Root mean square error，lg（CFU·100 g-1）; RSS: Residual sum of squares.

由表1可知，定量接种后冷鲜猪肉样品中的初始大肠杆菌菌落总数为2.40～3.25 lg(CFU/100 g)。随着温度的升高，相对最大比生长速率和最大比生长速率max增大，延迟期LPD减小，表明温度是影响大肠杆菌在猪肉中增殖的关键因素之一。0～8℃时猪肉中大肠杆菌生长非常缓慢，延迟期LPD大于40h。16～24℃时大肠杆菌生长延迟期LPD为7~8h。冷鲜猪肉中大肠杆菌Gompertz预测模型24℃决定系数2为0.79，0～20 ℃时2为0.96～0.99，拟合效果良好。

2.3 冷鲜猪肉中大肠杆菌平方根二级模型

基于一级预测模型参数拟合温度与最大比生长速率（max）平方根，以及温度与延迟期（LPD）倒数的平方根之间关系的平方根二级预测模型，如图4所示。

二级预测模型大肠杆菌生长温度和最大比生长速率的平方根模型、生长温度与迟滞期倒数的平方根模型拟合效果良好，其决定系数2分别为0.862和0.948。

2.4 冷鲜肉猪中大肠杆菌生长与温度、时间的响应面模型

温度和时间是影响冷鲜猪肉中大肠杆菌变化的2个主要因素，采用Statistica 8.0软件进行双因素响应面模型拟合，结果如图5所示。

响应曲面模型揭示温度和时间2个因素对大肠杆菌的生长均有明显影响，随温度升高和时间延长，冷鲜猪肉中大肠杆菌菌数增多。模型揭示温度和时间二者交互作用明显（<0.05)。在0～24℃范围内随着温度升高响应曲面升高，且随时间趋于平缓趋势加快，表明大肠杆菌进入生长稳定期时间缩短。响应面模型决定系数2为0.815，调整决定系数2adj为0.801。

大肠杆菌响应面模型的拟合方程为：

lg=1.740 6+0.073 1+0.054 9+0.003 62+

0.000 2−0.000 22(6)

式中代表温度，℃；代表时间，h。

2.5 模型有效性的验证

偏差值B表示模型的结构偏差，即低估预测或高估预测的程度。偏差值常结合准确值A来对模型进行数学检验。A值等于1表示预测值与观测值之间完全吻合。模型验证试验偏差值与准确值统计结果见表2。

表2 模型的偏差值与准确值

注：Gompertz模型试验次数为10；响应曲面模型试验次数为3。

Note: The Gompertz model was tested 10 times ; The response surface model was tested 3 times.

由表2可知，Gompertz预测模型有效性验证中，0.999<B<1.012，模型偏差小拟合度良好，A值均在1附近波动不大，揭示模型具有一定准确性。响应面模型验证中1.002<B<1.021，A值均接近1波动不大，模型拟合效果良好。

3 讨 论

微生物生长预测模型中Gompertz 模型能够较好地模拟微生物生长情况，被广泛用于食品中微生物的生长模拟研究。董庆利等[25]研究揭示在0～35 ℃条件下Gompertz模型对猪肉中气单胞菌的生长曲线拟合很好，模型决定系数2均大于0.99，本研究建立的Gompertz模型能够很好预测大肠杆菌在冷鲜猪肉中的生长变化，模型决定系数2为0.96～0.99，偏差值和准确值均接近1，模型拟合度良好。本研究揭示猪肉冷藏温度低于8 ℃时，大肠杆菌生长非常缓慢，大肠杆菌的生长受到温度因素的明显抑制，这个结果与Tang等[26]对冷却猪肉货架期预测研究中腐败微生物生长的研究结论基本一致，均表明低温条件下猪肉中一些腐败微生物和致病微生物的生长收到明显抑制，随着温度的升高细菌延迟期缩短，生长速率加快。

食品微生物预测模型研究大多是在细菌培养基中试验建立，这样不仅操作简单还能在短时间内获得大量数据，然而食品基质成分复杂多样对微生物生长影响大，细菌在培养基中的增殖并不能代表食品基质中的真实状态，建立的微生物预测模型准确性也受到局限。食品及其原料自然状态下会存在多种微生物混居一起，针对某种纯培养细菌预测模型的建立则首先需要对食品基质进行灭菌处理，然而高温等方式灭菌后的食品基质会被改变，不能代表其真实状态[27-28]。本研究对冷鲜猪肉仅进行了简单机械搅碎，未进行灭菌处理，通过GFP和抗生素抗性双重选择既实现了对食品基质自然状态下大肠杆菌的选择性培养和追踪检测，也提高了预测模型的实用和准确性。GFP作为报告基因应用广泛，有研究报道成功构建了增强型绿色荧光蛋白在DH5α大肠杆菌中的表达，减少了筛选鉴定的工作量，提高了工作效率[18]。本研究中也成功构建了能够稳定表达GFP的大肠杆菌DH5α，用于对食品中大肠杆菌生长繁殖情况追踪检测方法的改进具有十分重要的意义。基于这种方法改进，本研究建立的Gompertz模型、平方根模型和响应面模型均能较好预测一定温度下大肠杆菌在冷鲜猪肉中变化规律，为产品贮存条件、卫生安全关键控制点和货架期研究提供有效方法和理论支持。

4 结 论

本研究基于对绿色荧光蛋白标记大肠杆菌的定量追踪检测，构建了冷鲜猪肉中大肠杆菌生长预测模型，得出以下主要结论：

1）通过化学转化法将绿色荧光蛋白质粒转入大肠杆菌DH5α，成功构建了稳定表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）的标记菌株。定量接种后基于GFP报告基因和氨苄青霉素抗性双选择标记可以实现冷鲜猪肉中大肠杆菌的追踪检测。

2）以绞碎的冷鲜猪肉为基质，采用Gompertz 模型拟合其中大肠杆菌生长情况，结果揭示0～20 ℃条件下Gompertz 模型预测结果能够较准确反映大肠杆菌的实际生长情况，模型决定系数2为0.96～0.99。模型偏差值和准确值均接近1，拟合度良好。冷鲜猪肉作为细菌培养基质未经过高温除菌处理，更能真实反映实际生产产品中微生物变化规律。

冷鲜肉中大肠杆菌生长温度和最大比生长速率的平方根模型、生长温度与迟滞期倒数的平方根模型拟合效果良好，其决定系数2分别为0.862和0.948。温度和时间双因素响应面模型揭示2个因素对大肠杆菌的生长均有明显影响，2者交互作用明显（<0.05)，模型决定系数2为0.815。响应面模型能够有效拟合冷鲜猪肉中大肠杆菌生长变化规律，为生产实践中冷鲜猪肉产品储存条件及货架期预测提供理论依据。

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Construction of the prediction model forin chilled pork using green fluorescent protein

Liu Bianfang, Hu Huifan, Zhang Yikui, Cai Jin, Du Shuangkui, Li Junli, Cao Mengqian, Lyu Xin※

(,,712100,)

Predicting dynamic changes of microorganisms can contribute to the rapid assessment of food safety for the shelf life in food prediction.originated from human or animal intestines are the main spoilage bacteria in fresh and chilled meat products. It is highly demanding to predict and monitor the changes ofin the chilled pork to ensure the safety and quality of food products. In this study, the green fluorescent protein plasmid (pGFP) with ampicillin resistance was transferred intoDH5ɑ by chemical transformation, thereby to construct a GFP labeledDH5ɑ strain. After quantitative inoculation of labeled strain in the chilled pork that was simply mechanically mashed, the dilution plate was used to detect the growth ofat different temperatures, using the GFP reporter gene and ampicillin resistance. The Gompertz model, the square root model, and the response surface equation were used to fit the number of bacteria, further to construct a mathematical prediction model. The results showed that the Gompertz model had a good fitting effect onin fresh pork, where the determination coefficient2were 0.96-0.99 at 0-20℃, and 0.79 at 24℃, respectively. The Gompertz model indicated that the growth ofwas very slow in the cold fresh pork at 0-8℃, and the lag phase duration (LPD) was over 40 h. It inferred that the growth rate ofwas significantly inhibited by the temperature, when the storage temperature of fresh pork was lower than 8℃. The two square root models had good fitting effects, which described the relationship between temperature and the square root of the maximum specific growth rate, and the relationship between temperature and the square root of reciprocal of LPD, where the determination coefficient2were 0.862 and 0.948, respectively. The response surface model demonstrated that there were significant effects of time and temperature on the growth ofin fresh pork, where the interaction between the two factors was significant (<0.05), with the2of 0.815. In the verification test, the prediction model revealed that the bias factor (B) and accuracy factor (A) were close to 1, indicating high accuracy and adaptability of the model. These models could effectively fit the growth rule ofin the chilled pork, providing a sound theoretical basis to predict bacterial change during product storage.

temperature; models;chilledpork;; tracking and detection; Gompertz prediction model

刘变芳，胡辉帆，张义奎，等. 基于绿色荧光蛋白的冷鲜猪肉中大肠杆菌预测模型的构建[J]. 农业工程学报，2021，37(1)：299-305.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.035 http://www.tcsae.org

Liu Bianfang, Hu Huifan, Zhang Yikui, et al. Construction of the prediction model forin chilled pork using green fluorescent protein[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(1): 299-305. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.035 http://www.tcsae.org

2020-09-10

2020-12-15

国家自然基金面上项目（项目编号31972043）

刘变芳，博士，副教授。研究方向为食品安全、食品微生物。Email：bfliu9509@163.com

吕欣，博士，教授，博士生导师，研究方向为食品生物技术。Email：xinlu@nwsuaf.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.035

TS201.3

A

1002-6819(2021)-01-0299-07