基于骨蛋白拉曼光谱特异性的肉骨粉种属鉴别方法

韩娅红，蹇 林，杜瑞铭，苏衍辅，朱 明，韩鲁佳，刘 贤※

（1. 农业部长江中下游农业装备重点实验室，华中农业大学工学院，武汉 430070；2. 中国农业大学工学院，北京 100083）

0 引 言

肉骨粉（Meat and Bone Meal，MBM）是动物骨头和残余碎肉组织加工而成的混合粉末，因其具有高蛋白含量，高生物学价值等特点[1]，曾被作为一种重要的蛋白饲料原料广泛用于养殖业。然而，一些通过肉骨粉在食物链中传播的疯牛病给养殖业带来巨大的安全风险[2-3]。于是，世界各国纷纷制定相关法规[4]。目前，禁用措施最严厉的是欧盟，自 2001 年以来相继颁布了一系列法令法规（2001/999/EC，2002/1774/EC，2003/1234/EC，2013/56/EC），禁止在反刍动物，家禽和猪饲料中添加任何来源的肉骨粉并永久禁止畜禽动物的同类相食。同时，根据国务院令第609 号和农牧发（2000）21 号文，中国目前同样禁止在反刍动物饲料中添加任何来源的肉骨粉，禁止畜禽动物的同类相食，但允许猪和家禽饲用非同类肉骨粉。同时根据农牧发（2019）5 号文，受非洲猪瘟疫情的影响，猪肉骨粉的饲用安全也将在未来很长一段时间内被严密监控。尽管朊病毒的主要传播途径（反刍动物食用反刍动物肉骨粉）已清楚明了，欧盟依然禁止反刍动物肉骨粉，鸡肉骨粉和猪肉骨粉用于饲喂非反刍动物，正是反映了目前仍缺乏可靠的肉骨粉种属鉴别方法[5-6]。深入分析发现，要保障肉骨粉的饲料化安全使用，确保无论是欧盟最严禁令还是中国现行法令法规的有效实施，核心问题均为实现不同种属肉骨粉（牛羊/猪/鸡）的准确鉴别。

目前肉骨粉检测的标准方法是显微镜法和聚合酶链式反应法（Polymerase Chain Reaction，PCR）。但是两种方法各有其局限性，PCR 法存在无法区分乳制品（允许添加）和肉骨粉导致的假阳性率高和检测效率低等难以突破的局限性，而显微镜法无法进一步区分不同种属肉骨粉，同时存在完全依靠专家经验和检测效率低等局限性。为了克服标准方法的局限性，许多研究学者采用光谱技术表征肉骨粉组成成分的特异性来开发肉骨粉种属鉴别分析方法[5,7-12]。欧盟第五框架计划“STRATFEED”项目（G6RD-2000-CT-00414）经系统研究提出了以有机物官能团分析为基础的近红外技术和显微近红外技术，两种方法均可有效地鉴别配合饲料和鱼粉中的肉骨粉[5,7]，但近红外方法难以鉴别不同种属肉骨粉，而显微近红外技术可以实现猪肉骨粉，鸡肉骨粉和反刍动物肉骨粉鉴别[8]，但模型精度不高。相比于近红外光谱显示出的含氢基团振动的倍频与合频的复杂信息，红外光谱反映的是分子基频振动信息，在定性鉴别上更具优势[13]。Gao 等[9]采用红外光谱对不同种属肉骨粉脂肪酸组成结构特异性进行快速表征，建立不同种属肉骨粉（猪，鸡，牛和羊源）的快速鉴别方法与模型，正确判别率高于95%。但是肉骨粉的储存环境和时间会引起油脂氧化酸败，易导致假阳性结果。进一步从化学组成分析，肉骨粉的主要成分为蛋白，脂肪和灰分。相比于脂肪，蛋白是肉骨粉的主要成分，美国饲料管理员协会（Association of American Feed Control Officials，AAFCO）规定优质肉骨粉蛋白质量分数需达 50%以上。因此，本研究拟提出从肉骨粉蛋白入手，结合光谱技术研究不同种属肉骨粉的鉴别分析问题。

相关研究表明，红外光谱可以表征不同物种蛋白组成与结构的差异性，从而实现羽毛、大麦、小麦和燕麦的鉴别[14]，以及猪胶原蛋白、鱼胶原蛋白和牛胶原蛋白的鉴别[15]。拉曼光谱和红外光谱是一种互补技术，均可以对分子组成与结构进行“指纹性”识别，在定性鉴别上具有优势。但目前并没有基于蛋白拉曼光谱特性的肉骨粉种属鉴别分析研究的相关报道。由于蛋白提取步骤复杂，本研究采用提取骨颗粒的方法富集骨蛋白，采集其拉曼光谱数据，结合偏最小二乘判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA），建立基于骨蛋白的拉曼光谱特性的肉骨粉种属鉴别分析模型，并深入分析模型鉴别机理。

1 材料与方法

1.1 不同种属肉骨粉样品制备及其前处理

本研究共有87 个肉骨粉样品（肉骨粉是以畜禽屠宰后的骨头和残余碎肉组织等部分经灭菌、干燥、挤压、脱脂、风干和粉碎处理后制成的动物蛋白产品），其中鸡肉骨粉22 个，牛肉骨粉20 个，羊肉骨粉22 个以及猪肉骨粉23 个。部分样品收集于中国农科院，部分样品为实验室根据欧盟的标准方法制备[16]。首先，新鲜动物骨和残余碎肉组织清洗干净，切成小块，装到烧杯中（最多 2/3），经高温灭菌蒸煮（133 ℃，20 min）。蒸煮结束后，回收漂浮的油脂并将剩余固体转移至托盘，放入烘箱干燥（105 ℃，24 h）。然后，利用三氯甲烷/甲醇法脱脂（2∶1，体积比；试剂为分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司），每 50.0 g原料分3 次用900.0 mL 三氯甲烷/甲醇溶液（质量浓度55.6 g/L）脱除脂肪。脱脂样品自然风干后用 ZM200型旋风磨（德国Retsch 公司）粉碎至0.5 mm，密封保存于-20 ℃。

1.2 样品前处理

根据Mandrile 等[17]方法采用骨颗粒的提取方法富集肉骨粉骨蛋白。具体步骤为：称取3.0 g 肉骨粉样品于分液漏斗中，加入50 mL 四氯乙烯（质量浓度 60 g/L），连续振荡混合至少30 s，再量取不少于50 mL 四氯乙烯，沿分液漏斗内壁倒入彻底洗净着壁样品，静置5 min，打开活塞，分离沉淀物于滤纸过滤后风干，4 ℃密封保存。

1.3 拉曼光谱采集

取50.0 mg 肉骨粉骨颗粒均匀研磨，压片测量其拉曼光谱。扫描范围400～3 600 cm-1，激光强度400 mW，分辨率4 cm-1，样品扫描128 次。为了使光谱具有代表性，每个压片取6 个点，求取平均光谱。所有样品重复3 次，求取平均光谱。

1.4 数据处理与分析

采用基线校正、标准正态变量变换和二阶导数作为前处理方法，采用Kennard-Stone 算法将肉骨粉样品分为校正集（75%）和验证集（25%），每个模型均会进行留一交互验证和独立外部验证。判别分析模型评价指标为灵敏度（Sensitivity），特异度（Specificity）和误判率（Classification error）[18-19]，分别用公式表示。

式中TP 为真阳性样本个数，表示类别为1 的样本被判定为类别1 的个数；FP 为假阳性，代表非类别1 的样本被判别为类别1 的个数；TN 为真阴性，表示非类别1（类别0）的样本被判定为类别0 的个数；FN 为假阴性，代表类别1 的样本被判别为类别0 的个数。

2 结果与分析

2.1 不同种属肉骨粉骨蛋白相关拉曼光谱特性分析

图 1 为不同种属肉骨粉骨颗粒拉曼光谱图，其中3 600～1 200 cm-1和900～800 cm-1均和骨蛋白的分子振动相关[20-28]。不同种属肉骨粉骨颗粒的拉曼光谱位移和强度具有一定差异性。由表 1 和图 1 可知，在 3 600～1 200 cm-1波段，特征谱带主要集中于3 200～2 800 cm-1和 1 800～1 200 cm-1波段。3 200～2 800 cm-1波段反映了骨蛋白的官能团振动。其中，在2 930 cm-1附近特征谱带强度最高，反映了C-H（CH2）的不对称伸缩振动[20-21]，而在3 060 cm-1附近特征峰是其肩峰，与酰胺B 带的O-H振动相关[21]。前一个特征峰在猪、鸡、牛、羊 4 种肉骨粉拉曼光谱上的位置分别为 2 935、2 933、2 937 和2 937 cm-1，后一个特征峰在4 种肉骨粉拉曼光谱上的位置分别为3 060、3 059、3 060 和3 061 cm-1，这两个特征峰在肉骨粉的拉曼光谱中，在拉曼位移上是不同的，这与不同肉骨粉中骨蛋白的官能团振动频率有关[20-21]。而在1 800～1 200 cm-1波段的特征谱带均与酰胺带有关。其中，在1 659 cm-1附近有强谱带，反映了酰胺I 带的C=O和C-N 振动[22-24]；而在1 554 cm-1附近特征谱带与酰胺II带N-H 弯曲振动和C-N 拉伸振动相关[21]，反映在猪、鸡、牛、羊4 种肉骨粉拉曼光谱上的位置分别为1 555、1 555、1 557 和1 561 cm-1。在1 455 cm-1附近有强谱带，反映了CH2振动[23-26]，对应的猪、鸡、牛、羊4 种肉骨粉拉曼光谱上的位置分别为1 450、1 449、1 451 和1 451 cm-1；而在1 305 cm-1附近特征谱带反映了酰胺III 带的C-N 振动[21,24,26]。在900～800 cm-1波段和氨基酸的官能团振动相关，其中在878 cm-1处特征谱带与羟脯氨酸相关，而在853 cm-1处特征谱带和脯氨酸相关[23,25-27]。总体而言，拉曼光谱反映了猪、鸡、牛和羊四类肉骨粉骨蛋白的 C-H（CH2）的不对称伸缩振动、酰胺I 带的C=O 和C-N 振动、CH2振动以及酰胺III 带的C-N 官能团振动。由于不同种属肉骨粉骨蛋白组成与含量各不相同，因此其官能团在 拉曼光谱上的响应各不相同。

图1 不同种属肉骨粉骨颗粒的拉曼光谱图Fig.1 Raman spectra of bone particle from different MBM samples

表1 不同种属肉骨粉骨颗粒的拉曼特征谱带及其归属Table 1 Raman characteristic bands of bone proteins from different MBM samples and their assignment

2.2 基于骨蛋白拉曼光谱特性的肉骨粉种属鉴别分析

本研究采用 PLS-DA 算法分析不同种属肉骨粉骨颗粒拉曼全谱。如图 2 所示，采用第二、三和四潜变量建立鸡和哺乳动物（猪，牛和羊）肉骨粉 PLS-DA 图，其中第二、三和四潜变量得分分别为 33.10%，0.17%和0.11%；采用第一、三和第七潜变量建立猪和反刍动物（牛和羊）肉骨粉的 PLS-DA 图，其中第一、三和第七潜变量得分分别为49.38%，0.20%和0.01%。因此，鸡和哺乳动物（猪、牛和羊）肉骨粉，猪和反刍动物（牛和羊）肉骨粉可明显区分，这一结论和Mandrile 的结论相似[17]。

因此，本研究采用多步模型策略：首先，建立禽类/哺乳动物肉骨粉的PLS-DA 模型。随着潜变量个数增加，交互验证标准偏差逐渐减小，误判率逐渐降低，但潜变量个数过多会出现过拟合现象。综合分析，本研究采用前7 个潜变量建立基于骨颗粒拉曼全谱的禽类/哺乳动物肉骨粉的PLS-DA 判别模型。由表2 判别1 可知，禽类（鸡）肉骨粉和哺乳动物（猪、牛和羊）肉骨粉样品的灵敏度和特异度均为100%。结果说明，禽类（鸡）肉骨粉和哺乳动物（猪、牛和羊）肉骨粉无错判样品。这表明禽类/哺乳动物肉骨粉PLS-DA 模型效果较好，可很好区分禽类（鸡）肉骨粉和哺乳动物（猪、牛和羊）肉骨粉。为进一步区分非反刍（猪）肉骨粉和反刍动物（牛和羊）肉骨粉，采用前13 个潜变量建立基于骨颗粒拉曼全谱的非反刍/反刍动物肉骨粉的PLS-DA 判别分析模型。如表2 所示，判别2 为非反刍/反刍动物肉骨粉的PLS-DA 模型分析结果。所有肉骨粉的灵敏度和特异度均为100%，这表明非反刍/反刍动物肉骨粉PLS-DA 模型效果较好，可很好区分非反刍（猪）肉骨粉和反刍动物（牛和羊）肉骨粉。

为进一步区分反刍动物（牛和羊）肉骨粉，采用前13 个潜变量建立基于骨颗粒拉曼全谱的牛/羊肉骨粉的PLS-DA 判别分析模型。如表2 所示，判别3 为牛/羊肉骨粉的 PLS-DA 模型分析结果。交互验证结果表明牛肉骨粉和羊肉骨粉误判率分别为6.25%和3.13%，外部验证结果表明无误判样品。这说明牛/羊肉骨粉PLS-DA 判别分析模型效果较好，可较好区分牛肉骨粉和羊肉骨粉。

2.3 基于骨蛋白拉曼特征波段的肉骨粉种属鉴别分析

为挖掘骨蛋白在肉骨粉种属鉴别分析模型中的贡献，本研究建立基于骨蛋白拉曼特征波段（3 200～2 800 cm-1，1 800～1 200 cm-1和 900～800 cm-1）的不同种属肉骨粉的 PLS-DA 判别分析模型。首先，采用前 6个潜变量建立禽类/哺乳动物肉骨粉的PLS-DA 判别分析模型。如表3所示，判别1为禽类/哺乳动物肉骨粉PLS-DA模型的分析结果。交互验证和外部验证结果均表明所有肉骨粉的灵敏度和特异度均为100%，无误判样品，和基于全谱的建模结果一致。这说明基于骨蛋白拉曼特征波段的禽类/哺乳动物肉骨粉的PLS-DA 判别分析模型可以很好地区分禽类（鸡）肉骨粉和哺乳动物（猪，牛和羊）肉骨粉，从而说明骨蛋白对区分禽类（鸡）肉骨粉和哺乳动物（猪，牛和羊）肉骨粉具有重要贡献。

图2 基于骨颗粒拉曼全谱的不同种属肉骨粉PLS-DA 分析图Fig.2 PLS-DA score plots of MBM from different species based on Raman spectral analysis of bone particle

表2 基于骨颗粒拉曼全谱的不同种属肉骨粉PLS-DA 分析结果Table 2 Results of PLS-DA discrimination based on Raman spectral analysis of bone particle from different MBM samples

表3 基于骨蛋白拉曼特征波段的不同种属肉骨粉PLS-DA 分析结果Table 3 Results of PLS-DA discrimination based on Raman characteristic regions of bone protein from different MBM samples

为进一步分析骨蛋白拉曼特征波段在禽类/哺乳动物肉骨粉 PLS-DA 模型中的贡献，采用变量投影重要性得分对骨蛋白拉曼特征波段进行评价，见图3a 所示。

变量投影重要性得分是用来评价每个波数对PLS-DA 模型的重要性，当得分大于1，被认为是重要的[29-30]。由图3a 可知，有476 个波数对禽类/哺乳动物肉骨粉的 PLS-DA 模型具有重要贡献。一般而言，与蛋白官能团特征谱带相邻的波数也会受到此蛋白官能团振动的影响。经分析发现，反映酰胺I 带的C=O 和C-N 振动的相关波数（1 659 cm-1）变量投影重要性得分最高，其次是反映C-H（CH2）伸缩振动的相关波数（2 930 cm-1和2 852 cm-1）。依次是反映酰胺III 带的C-N 振动的相关波数（1 246 cm-1）和反映蛋白 CH2振动的相关波数（1 455 cm-1）。这说明，基于拉曼光谱特性的禽类/哺乳动物肉骨粉 PLS-DA 模型的鉴别机理主要是基于在1 659，2 930，2 852，1 246 和 1 455 cm-1附近的与骨蛋白相关特征谱带的差异性。为了进一步验证变量投影重要性指标的稳定性，本研究还采用随机的方法平行计算后，发现验证变量投影重要性得分图基本一致，说明本结果可靠。

图3 基于骨蛋白拉曼特征波段的肉骨粉PLS-DA 模型变量投影重要性得分Fig.3 Plot of variable importance in projection scores of PLS-DA model of MBM based on Raman characteristic regions of bone protein

为了研究骨蛋白拉曼特征波段对非反刍/反刍动物肉骨粉判别分析模型的贡献，本研究采用前10 个潜变量，建立基于骨蛋白拉曼特征波段的非反刍/反刍动物肉骨粉的PLS-DA 鉴别模型。如表3 所示，判别2 为非反刍/反刍动物肉骨粉的 PLS-DA 判别模型的分析结果。交互验证和外部验证结果表明，所有肉骨粉样品的灵敏度和特异度均为100%，无误判样品，和基于全谱的建模结果一致。为进一步研究骨蛋白在非反刍/反刍动物肉骨粉PLS-DA 模型中的贡献，采用了变量投影重要性得分对骨蛋白拉曼特征波段进行评价。由图3b 可知，有269 个波数对非反刍/反刍动物肉骨粉的PLS-DA 模型具有重要贡献。经分析发现，反映C-H（CH2）不对称伸缩振动的相关波数（2 852 cm-1）的变量投影重要性得分最高，其次是反映酰胺 I 带的 C=O 和 C-N 振动的相关波数（1 659 cm-1），最后是反映酰胺III 带的C-N 振动的相关波数（1 246 cm-1）。这说明，基于拉曼光谱特性的非反刍/反刍动物肉骨粉PLS-DA 模型的鉴别机理主要是基于在2 852，1 659 和1 246 cm-1附近与骨蛋白相关特征谱带的差异性。

为了研究骨蛋白拉曼特征波段对牛/羊肉骨粉判别分析模型的贡献，本研究采用前11 个潜变量，建立基于骨蛋白拉曼特征波段的牛/羊肉骨粉的PLS-DA 判别分析模型。如表3 所示，判别3 为牛/羊肉骨粉的PLS-DA 判别模型的分析结果。交互验证结果表明，所有肉骨粉样品的灵敏度和特异度均为93.8%，而外部验证结果表明所有肉骨粉样品的灵敏度和特异度均为100%。基于骨蛋白拉曼特征波段的建模结果，比基于全谱的建模结果略好。为进一步分析骨蛋白拉曼光谱特性在牛/羊肉骨粉PLS-DA 模型中的贡献，采用了变量投影重要性得分对骨蛋白拉曼特征波段进行评价。由图3c 可知，有397 个波数对牛/羊肉骨粉的PLS-DA 模型具有重要贡献。经分析发现，反映羟脯氨酸和脯氨酸相关波数（878 和853 cm-1）的变量投影重要性得分最高，其次是反映C-H（CH2）不对称伸缩振动的相关波数（2 930 和2 852 cm-1），依次是反映酰胺III 带的C-N 振动的相关波数（1 246 cm-1），反映蛋白CH2振动的相关波数（1 455 cm-1）以及反映酰胺I 带的C=O 和C-N 振动的相关波数（1 659 cm-1）。这说明，基于拉曼光谱特性的牛/羊肉骨粉PLS-DA 模型的鉴别机理主要是基于在878，853，2 930，2 852，1 246，1 455 和1 659 cm-1附近与骨蛋白相关特征谱带的差异性。

3 结 论

基于骨蛋白拉曼光谱特性，结合 PLS-DA 算法，采用多步模型策略，首先建立禽类（鸡）和哺乳动物（猪，牛和羊）肉骨粉的 PLS-DA 判别分析模型，其次建立非反刍（猪）和反刍动物（牛和羊）肉骨粉的 PLS-DA 判别分析模型，其灵敏度和特异度均为100%，无误判样品。最后建立反刍动物中的牛和羊肉骨粉的 PLS-DA 判别分析模型，牛和羊肉骨粉的鉴别灵敏度和特异度均为93.8%，误判率为6.25%。机理分析发现，骨蛋白对区分不同种属肉骨粉具有重要贡献，对禽类（鸡）和哺乳动物（猪，牛和羊）肉骨粉的 PLS-DA 模型具有贡献的波数共有476个，其中1 659，2 930，2 852，1 246和1 455 cm-1附近与骨蛋白相关的特征谱带对区分禽类（鸡）和哺乳动物（猪、牛和羊）肉骨粉具有重要作用；对非反刍（猪）和反刍动物（牛和羊）肉骨粉的 PLS-DA 模型具有贡献的波数共有269 个，其中2 852，1 659 和1 246 cm-1附近与骨蛋白相关的特征谱带对区分非反刍（猪）和反刍动物（牛和羊）肉骨粉具有重要作用；对牛/羊肉骨粉的PLS-DA 模型具有贡献的波数共有397 个，其中878，853，2 930，2 852，1 246，1 455 和 1 659 cm-1附近与骨蛋白相关的特征谱带对区分牛和羊肉骨粉具有重要作用。