基于液滴微流控的壳寡糖植物免疫诱导剂荧光检测

苍小鑫，赵小明，钟润涛，王文霞，尹 恒，朱靖博，丁 燕



基于液滴微流控的壳寡糖植物免疫诱导剂荧光检测

苍小鑫1,2，赵小明2，钟润涛3，王文霞2，尹 恒2，朱靖博1，丁 燕1※

（1. 大连工业大学食品学院，大连 116034；2. 中国科学院大连化学物理研究所，大连 116023；3. 大连海事大学环境科学与工程学院，大连 116026）

为了建立基于液滴微流控芯片平台的植物免疫诱导剂的荧光信号检测技术，该文设计制作了具有液滴生成结构的芯片，制备包裹烟草（BY-2）细胞的液滴，并对包裹了细胞的液滴数目进行统计分析。将包裹细胞的液滴孵育一氧化氮探针后使用质量浓度为50g/mL壳寡糖处理，在荧光显微镜下观测其产生的荧光，利用荧光酶标仪对比采用96孔板和液滴承载的细胞的荧光变化趋势。结果显示，水相流速为100L/h，油相流速为300L/h时，微流控芯片产生的液滴尺寸适合包裹细胞，其中液滴包裹单细胞的比例达22.9%。经壳寡糖处理后的细胞在生成的液滴中产生了明显的荧光，且用96孔板和液滴承载的细胞的荧光变化趋势一致。研究结果为开发基于液滴微流控技术的植物免疫诱导剂的高通量筛选平台提供参考。

微流控；包裹；荧光；植物免疫诱导剂；烟草细胞；壳寡糖

0 引 言

植物免疫诱导剂是通过激发植物自身的防卫反应，进而达到控制植物病害效果的新型生物农药。国际上已经应用于农业生产商品化的植物免疫诱导剂有烯并异噻唑、过敏蛋白、壳寡糖等[1]。植物免疫诱导剂不仅能够激发农作物的免疫抗病性，还可以诱导其抗寒、抗旱，增加产量并改善品质[2]。将植物免疫诱导剂与化学农药混用，可以显著降低化学农药的施用量，并提高作物降解农药残留的能力，对解决食品安全问题有重要作用。尽管现阶段已成功研发了一些植物免疫调节剂，但农业生产过程中病害种类繁多，现有的植物免疫诱导剂产品种类不能满足农业生产的复杂情况，生产上需要研发新的植物免疫诱导剂。但是，植物免疫诱导剂是通过激发植物自身的免疫反应发挥功能，其本身对病原菌没有直接的杀菌作用，传统的杀菌剂筛选方法不适合植物免疫诱导剂产品，因此亟需新的技术应用于植物免疫诱导剂的筛选。

对于植物免疫诱导剂活性筛选，国际上报道的很少，Cheong等[3]用大豆子叶法测定葡寡糖诱导剂的活性，该法被其他研究者应用测定其他诱导剂的活性，被认为是比较经典的测定寡糖诱导剂活性的方法。但该方法比较烦琐，费时间，测定结果的误差比较大。随着植物免疫机理研究的发展，对植物免疫诱导剂筛选技术研究逐渐开展。Franco等[4]以菜豆离体叶片组织胼胝质积累为指标，用多孔细胞培养皿法筛选不同分子量壳聚糖诱导活性，该法周期长，检测繁琐，不能高通量。Schreiber等[5]将拟南芥种在96孔板上，以植物病原丁香假单胞菌（）引起拟南芥白化症状为指标，筛选了200个可以激发拟南芥植物免疫活性的化合物，筛选到三种有活性的磺胺类物质，该法直观、简单，但周期长需要15～20 d，难于规模化。随着分子生物学发展，McCann等[6]以6种病原细菌为材料，利用生物信息学方法，分析病原菌基因组保守性特征分子，推测病原菌存在的诱导剂，再接种鉴定，筛选到56个肽链植物免疫诱抗剂。该法需要了解病原菌基因组，主要是针对蛋白类诱导剂，存在很大局限性，难于作为筛选平台。Noutoshi等[7]根据病原菌诱导剂诱导植物细胞程序性死亡和伊文思蓝染色死细胞原理，以拟南芥悬浮细胞为材料，用96孔板法筛选具有植物免疫诱导剂活性化合物5个，该法接近高通量，但该法只检测一个指标，不适合没有诱导细胞死亡的诱导剂，容易造成漏筛。能否开发出操作相对简单，成本相对低廉的高通量筛选系统成为植物免疫筛选领域的重要问题。基于微量、高通量、大规模、平行性等特点，近年来迅速发展起来的微流控芯片（microfluidics）被认为是解决此问题的有力武器。

微流控技术是一种利用微流体力学，把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、培养、反应、分离、检测等操作单元高度集成[8]，用以实现各种生物或化学试验的技术，具有高通量、高灵敏度、低试剂量消耗、无交叉污染、反应速度快的优点[9]。其中的液滴微流控技术以离散的微小液滴为流动主体，每一个形态稳定的液滴均可视为独立的微反应器，减少了交叉污染，且便于操控，因此是单细胞分析[10-13]，分子生物学[14]，药物分选[15-16]，材料合成[17-22]、化学反应[23-26]等领域的理想选择。利用液滴微流控技术的上述优势，将植物细胞包裹到含有荧光探针和待考察的植物激发子的液滴中，检测并比较不同种类待考察的植物激发子诱导植物细胞产生NO和Ca2+等植物抗性相关信号分子的能力[27-30]，是一种新的实现植物免疫诱导剂高通量筛选的技术手段。

为研究利用液滴微流控芯片进行植物免疫诱导剂高通量筛选的可行性，本文考察了使用微流控芯片生成包裹烟草细胞所需要的流体力学参数，并对加载一氧化氮荧光探针和壳寡糖的烟草细胞液滴进行荧光检测，为进一步研发基于液滴微流控的植物免疫诱导剂高通量筛选的技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

KW-4A型匀胶机：美国Chemat公司；EH20A plus热板：美国Lab Tech公司；URE-2000/35型紫外深度光刻机：中国科学院光电技术研究所；PDC-32G-2等离子体清洗器：美国Harrick公司；IX73荧光倒置显微镜：日本Olympus公司；Image-Pro Plus图片处理软件：美国Media Cybernetics公司；TJ-2A注射泵：保定兰格恒流泵有限公司；Gemini EM荧光酶标仪：美国分子仪器公司；752N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；CR21N离心机：日本日立公司。

液滴形成油：美国Biorad公司；Sylgard184聚二甲基硅氧烷（PDMS, polydimethylsiloxane）：美国Dow Corning公司；SU-8 3035光刻胶：美国Micro Chem公司；乳酸乙酯：天津市光复精细化工研究所；异丙醇：天津博迪化工有限公司；浓H2SO4、H2O2：天津市科密欧化学试剂有限公司；苋菜红：上海Aladdin公司；三氯（1H,1H,2H,2H-全氟辛基）硅烷：美国sigma公司；FC-40油：美国Santa Cruz公司；KOH、KCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4：均为国产分析级纯；离析酶R-10、纤维素酶R-10：日本Yakult 公司； NO荧光探针（DAF-FM DA）：上海碧云天生物技术有限公司；壳寡糖由大连中科格莱克生物科技有限公司制备，脱乙酰度>95%，聚合度2～10；BY-2烟草细胞：中科院大连化物所天然产物与糖工程研究组提供。

1.2 聚二甲基硅氧烷（PDMS）液滴微流控芯片制备

芯片模板采用标准软刻蚀工艺加工[31]。SU-8玻璃模板的制作：在H2SO4-H2O2中清洗过的70 mm×70 mm玻璃基片以第一转速为500 r/min，10 s；第二转速为960 r/min，30 s的速率旋涂SU-8 3035光刻胶，经过加热前烘后，利用曝光成像将掩膜上的图案设计刻录到光刻胶上，再将刻录有图案的光刻胶玻璃基片放在95 ℃的热板上加热烘烤，冷却到25 ℃后，在乳酸乙酯中显影，用异丙醇淋洗干净，转移至热板180 ℃坚膜，冷却至25 ℃；PDMS芯片浇注成型：将PDMS预聚液与固化剂按体积比10:1混合均匀，倒入SU-8模板，利用真空泵抽走小气泡，80 ℃固化成型后揭下，切割、打孔，与涂有PDMS的载玻片在等离子腔内照射，取出，迅速封接，随后在80 ℃烘箱加固封接。

1.3 苋菜红液滴的制备及液滴大小的测量

试验采用流动共聚焦[32]的PDMS芯片形成油包水的液滴（芯片结构如图1所示），油相为液滴形成油，水相为饱和的苋菜红水溶液。使用注射泵调节流体的速率（油相流速分别为200、300、400L/h；水相流速为100L/h）。将水相流速固定为100L/h，油相流速为200L/h时，将生成的液滴收集并在显微镜下观察，利用图像处理软件随机拍摄10个视野，每个视野10个液滴，并测量这100个液滴的直径，取平均值，得到该流速下液滴的大小，并计算误差范围。按照同样的方法，获得油相为300、400L/h时液滴的尺寸。

1.4 制备BY-2烟草细胞悬液

取处于对数生长期的悬浮培养的BY-2细胞100mL，用封口膜封住瓶口，置于25 ℃左右的黑暗条件下酶解去除细胞壁，酶为纤维素酶（10 000 u/g）和离析酶（3 000 u/g），酶解时间约3～5 h。一般在3～4 h后，用倒置显微镜进行观察，待足量的原生质体游离下来以后即可继续进行下面的操作。用枪将含有原生质体的酶液通过300目的镍丝网，过滤到15 mL的离心管中，除去未被酶液消化的细胞。滤液用离心机离心，500 r/min，约3 min，使完整的原生质体沉淀用吸管除去酶液，添加洗涤液（0.6 mol/L甘露醇，3.5 mmol/L CaCl2，0.7 mmol/L KH2PO4，pH值为5.6），小心将原生质体悬浮，待悬浮液充分混匀后，再一次进行离心。使用0.33 mol/L蔗糖溶液（烟草细胞的等渗浓度）悬浮细胞。

1.5 制备包裹BY-2细胞的液滴

利用与BY-2烟草细胞等渗浓度的蔗糖溶液配置成不同光密度（OD, optical density）值的细胞悬浮液。油相为伯乐油，流速为300L/h；水相为细胞悬浮溶液，流速为100L/h。利用液滴生成芯片生成液滴。

1.6 单细胞包裹率的统计及分析

单细胞包裹率是指包裹单个细胞的液滴数目占液滴总数目的比例。在显微镜下观察微液滴包裹细胞的情况。随机选取视野，使每个视野中包含至少10个液滴，对这10个液滴的包裹情况进行统计分析。

1.7 一氧化氮荧光探针（DAF-FM DA）的孵育及壳寡糖的诱导

取对数生长期的BY-2悬浮细胞2 mL加入10 mL离心管中，然后加入1L 5mmol/L DAF-FM DA，25 ℃，120 r/min黑暗孵育1 h，将细胞沉淀，用200L移液枪吸除上清液，用新鲜细胞培养液清洗去除多余的探针三次，再加入8 mL新鲜的培养基，黑暗室温120 r/min孵育30 min，然后将细胞混匀，加入6孔板中，每孔2 mL细胞悬液，用荧光显微镜观测NO的产生情况（激发波长488 nm；发射波长510 nm），以50g/mL质量浓度壳寡糖处理孵育探针的细胞30 min后，用荧光显微镜观察NO荧光产生情况。

1.8 制备包裹壳寡糖刺激后的细胞液滴

结合操作1.5和1.7，将一氧化氮探针孵育并受到壳寡糖预处理后的细胞微液滴在荧光显微镜下观察，对观察到的荧光强弱的差别给予评价。

1.9 液滴中与96孔板中细胞的荧光强度对比

结合1.7中所述的方法，孵育一氧化氮荧光探针（DAF-FM DA）的烟草细胞和液滴中的细胞置于黑色96孔板中，利用荧光酶标仪对其1 h内的荧光强度变化进行测定并对比。

2 结果与分析

2.1 液滴生成芯片设计

本研究应用带有通道汇流结构区域的微流控芯片以制备微液滴。通过显微镜观察发现，悬浮培养的烟草细胞其直径为60～240m，考虑到悬浮培养的烟草细胞易于成团生长，较大的微流控通道宽度不易造成通道阻塞，因此将芯片的通道宽度设定为350m；液滴生成区域的通道宽度设定为250m；通道加工深度为120m（如图1所示）。油相注入到芯片后，细胞悬液被油相在十字型汇流缩口处被油相的剪切力夹断，形成连续的液滴。

2.2 液滴生成芯片中油相流速的调节

对于通道宽度和高度已确定的芯片，可以通过调节油相和水相的流速来控制液滴的大小。以溶有苋菜红染料的水相进行液滴生成模拟试验，将苋菜红水溶液流量固定为100L/h，调节油相流速，如表1所示，分别为400、300、200L/h，以考察不同流动相比例对生成液滴直径尺寸的影响。液滴生成效果如图2所示。通过图2b和表1中的数据结合分析可以得出，当水相为100L/h，油相为300L/h时，生成的液滴大小及频率最为稳定，最适合BY-2烟草细胞的包裹。

表1 液滴大小与油相流量的关系

a. 苋菜红液滴的生成过程

a. Formation of amaranth droplets

2.3 液滴中单细胞包裹率的统计及分析

利用酶解法去除悬浮培养的烟草细胞（100 mL）的细胞壁，然后用300目镍丝网过滤，将得到的滤液在25 ℃，1 000r/min，5min条件下离心，细胞沉淀后用200L移液枪去除上清液，得到一定量沉淀的细胞后，用等渗浓度的蔗糖溶液进行稀释，通过调控加入蔗糖溶液体积的方法将细胞配置成不同浓度的细胞悬液，并用紫外分光光度计测定其OD值。参考苋菜红溶液试验结果，将一定OD值的细胞悬液以100L/h，油相为300L/h的流速在微流控芯片中进行包裹。将生成的液滴在显微镜下观测拍照，如图3a、3b所示。并对每个视野内的10个液滴的包裹进行计数，结果显示，包裹了单细胞的液滴符合泊松分布，当细胞的OD值为1.375时，单细胞的包裹率为5.7%，空细胞为90.0%，两个或两个以上的包裹率为4.3%。当OD值为1.478时，将单个细胞包裹在直径为300m，体积为84.78 nL的微液滴中（液滴可视为球体），单细胞的包裹率可达22.9%，空细胞的包裹率为70.0%，两个或两个以上细胞的包裹率为7.1%，结果如图3c所示。

2.4 壳寡糖诱导烟草细胞中一氧化氮的产生及荧光检测

将一氧化氮荧光探针（DAF-FM DA）孵育到BY-2烟草细胞中，并用50g/mL的壳寡糖水溶液进行诱导。前期的试验已证明50g/mL的壳寡糖诱导烟草植株抗病效果较好[29]，可以显著激发植物细胞产生一氧化氮等信号分子。因此，本研究对50g/mL的壳寡糖处理烟草细胞时一氧化氮的产生情况进行研究，考察细胞经壳寡糖处理后产生荧光的情况。结果如图4所示，壳寡糖预处理后的烟草细胞经过一氧化氮探针的检测，在显微镜下可以观察到显著的荧光。

c. 液滴中BY-2细胞的泊松分布图

c. Poisson distribution of BY-2 cells in droplets

注：图b红色箭头指向的是液滴中包裹到的烟草细胞

Note: Fig. b Red arrow point to BY-2 cell encapsulated in a droplet

图3 空液滴和包裹细胞液滴的对比图

Fig.3 Contrast figure of empty droplets and encapsulated cells in droplets

2.5 液滴中细胞荧光的检测

将BY-2细胞悬液经过一氧化氮探针孵育并使用50g/mL壳寡糖诱导后，包裹于微液滴中，在荧光显微镜下进行观测，如图5所示。未经一氧化氮探针孵育和壳寡糖预处理的细胞没有发射出荧光；经过一氧化氮探针孵育而未经壳寡糖预处理的细胞在激发光源的激发下，也没有显示出显著的荧光；在经一氧化氮探针孵育并接受壳寡糖预处理后的细胞，在激发光源的作用下，发射出明显的荧光。结果显示，微液滴包裹的细胞经探针孵育并受到激发子的诱导作用后，其产生的一氧化氮与探针结合，在激发光源的作用下可以发射出明显的荧光。

2.6 微液滴与96孔板中BY-2细胞受壳寡糖诱导后的荧光对比

将经过50g/mL壳寡糖刺激后的BY-2细胞分别包裹在液滴中和置于黑色96孔板中，利用荧光酶标仪检测各自荧光强度的变化趋势。由图6中可见，1 h内两者的荧光强度变化趋势基本相符，由此可见在96孔板及液滴中BY-2细胞被壳寡糖诱导后产生的反应趋势基本一致。此结果说明利用微液滴包裹细胞进行植物免疫诱导剂荧光筛选，与传统的筛选方法相比具有相似表现效果。

3 讨 论

Wang等[33]报道酵母细胞在液滴中包裹情况遵循泊松分布，即，其中代表的是每个液滴中细胞的平均个数，代表的是理想状况下每个液滴中的细胞个数，因此当=1，=1时，即理想状况下每个液滴中只包裹一个细胞的概率可以达到36.7%。而试验中会因为实际包裹的物质不同而有所差别。植物细胞不同于微生物、微藻和动物细胞，它在悬浮培养状态下，细胞是成团粘结在一起生长的，因此需要对细胞进行一系列的处理使其较为分散，得到一定浓度的悬浮液，才能利用通道芯片进行包裹。利用液滴微流控芯片对植物细胞的包裹以前并未见过报道，因此本文是第一次尝试植物细胞的包裹并对其包裹概率进行探究，得到22.9%的植物细胞包裹率，此包裹率能够满足本试验的需求，但同时也表明提高烟草细胞包裹率的方法是后续研究的重要内容。

Zhao等[29]利用常规方法验证了50g/mL的壳寡糖可以刺激烟草细胞产生免疫防御反应，从而证明了壳寡糖是一种有效的植物免疫诱导剂，可以预防烟草花叶病。本文利用液滴作为载体，利用液滴微流控芯片平台验证壳寡糖刺激烟草细胞发生应激反应，能够使装载一氧化氮荧光探针（DAF-FM DA）的BY-2细胞产生荧光。试验中将液滴包裹的细胞和96孔板中细胞经壳寡糖刺激后的荧光变化趋势进行对比，证明96孔板和液滴微流控芯片在检测具有一定的一致性。该试验的侧重点在于证明液滴微流控芯片平台的可行性。对包裹不同细胞个数的液滴实现分离筛选以及对单细胞液滴荧光信号异质性分布还需进一步研究。

每一个液滴都是一个微小的环境，液滴内的细胞可以和激发子快速均匀的混合，且能够依次均匀的分布在孔板内，而在96孔板的一个孔内，以悬浮液存在的细胞会随着时间延长而发生聚集的现象，使其在孔板内分布不均匀，因此当荧光酶标仪的光束均匀透过孔板时，由于液滴分布均匀，检测光束均匀照射孔中的细胞，而以细胞悬液形式存在的孔，因为细胞聚集成团，使检测光束不能均匀完整的照射到所有细胞，因此液滴包裹的细胞的荧光会强于孔板内只含有细胞的荧光强度，灵敏度更高。虽然存在检测灵敏度的不同，但两者的效应机制相同，所以荧光变化的趋势一致。由此可见，液滴微流控芯片可以用来做壳寡糖植物免疫诱导剂荧光检测试验，且相比96孔板具有更高的灵敏度，是一个更有优势的实验分析载体。

本试验的目的是为了证明基于液滴微流控技术对植物免疫诱导剂高通量筛选具有可行性，在后续试验中将制备集成液滴生成、孵育、筛选等多种功能模块一体的芯片，同时结合NO、Ca2+等荧光探针，依靠荧光信号的反馈，最终实现高通量的液滴分选，为基于液滴微流控芯片技术的糖链植物免疫诱导剂高通量筛选平台的研制提供参考。

4 结 论

1）基于液滴微流控技术，将单个细胞包裹在直径为300m，体积为84.78 nL的微液滴中（液滴可视为球体），包裹率可达22.9%，并符合泊松分布。

2）将一氧化氮荧光探针孵育到BY-2烟草细胞中，并用50g/mL质量浓度的壳寡糖水溶液进行诱导。结果显示在激发光源的作用下，液滴中的细胞发射出明显的荧光。将液滴受壳寡糖诱导的细胞和96孔板中受相同处理的细胞荧光对比，发现微液滴中的BY-2细胞其荧光变化趋势与96孔板中的细胞荧光变化趋势相同，说明微液滴包裹植物细胞在荧光检测的角度与传统的孔板检测结果具有一致性，且具有较高灵敏度。

本研究将植物细胞与液滴微流控芯片技术相结合，为单个植物细胞的分析研究提供了新的平台，为基于液滴微流控芯片技术的糖链植物免疫诱导剂高通量筛选平台的研制提供了参考。

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Fluorescence detection of chitosan oligosaccharides plant immune elicitors based on droplets-microfluidics

Cang Xiaoxin1,2, Zhao Xiaoming2, Zhong Runtao3, Wang Wenxia2, Yin Heng2, Zhu Jingbo1, Ding Yan1※

(1.,,116034,;2.,,116023,;3.,,116026,)

The plant immune elicitors can induce a line of defense responses in plants and are identifed as new type of biological pesticides. At present stage, new plant immune elicitor is screening with potted plants or field experiments, which is time-consuming and high-cost. The droplet microfluidic technology, which is originated from analytical chemistry and owns micro-channel network structure, has properties of high throughput, high sensitivity, low consumption of reagent, no cross contamination and rapid reaction. These advantages provide a novel platform for screening plant immune elicitors. Chitosan oligosaccharides (COS) are obtained by degradation of chitosan. It was reported that COS could activate plant innate immunity, such as: stimulate H2O2(hydrogen peroxide)production, induce defense response by NO (nitric oxide) pathway, make a synthesis of phytoalexin, impact the jasmonic acid / ethylene (JA/ET) signaling marker, trigger defense-related gene expression, cause changes in protein phosphorylation, activate mitogen-activated protein kinases (MAPKs), and possess antimicrobial activity against bacteria and fungi in plant. Because of the advantages and the high solubility, nontoxicity, and biocompatibility, COS are considered as an effective plant immune elicitor by researchers. To preliminarily applying droplet microfluidic technology in plant immune elicitor screening, integrated microfluidic chip with droplets formation structure was designed and fabricated. COS were chosen as positive reagent, and BY-2 tobacco cells played as model plant cell. The flow rate of mobile phase was measured and established for BY-2 tobacco cells droplets formation, and the single cell encapsulating efficiency was calculated. Then COS and NO probe were dumped into the droplets with BY-2 tobacco cells, and the fluorescence intensity of NO probe from droplets was detected to evaluate the feasibility of screening the plant immune elicitor COS. To make the comparative analysis, the fluorescence intensity was compared with the same reaction system in 96-well plate. The results showed that at the flow rates of 100L/h in cell suspension and 300L/h in oil, the sizes of generated droplets were suitable to encapsulate the cells. The BY-2 cell clusters could be dispersed in isotonic solution, and every droplet encapsulated single cell. The ratio of droplets encapsulating single cell was about 22.9%. The ratio conformed to Poisson distribution. The fluorescence intensity of droplets incubated with COS was detected by fluorescence microscope. The fluorescence intensity from the COS/NO probe/BY-2 cell group was significantly higher than the control groups. In the comparative analysis experiments, the fluorescence intensity of droplets showed similar trend compared with the same reaction system in 96-well plate. This result implied that the cell treated with COS in droplets showed similar trend in defense responses compared to traditional screening method with 96-well plate. Thus, the droplets with COS / NO probe / BY-2 cell show high fluorescence intensity that can be detected by fluorescence microscope, which implies that integrated with fluorescence detecting technique, droplets microfluidics and fluorescence probe can be a novel platform for screening plant immune elicitors.

microfluidic; encapsulation; fluorescence; plant immune elicitors; BY-2 tobacco cell; chitosan oligosaccharide

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.02.042

S4

A

1002-6819(2017)-02-0302-06

2016-07-21

2016-11-18

国家自然科学基金（31370391）；中科院STS计划（KFJ-SW-STS-143）；大连市人才项目（2016RQ064）；辽宁省教育厅项目（2016J008）

苍小鑫，女（满族），黑龙江双城人，主要从事植物免疫诱导剂方向的研究。大连 大连工业大学食品学院，116034。Email：iceycang@foxmail.com

丁 燕，女，吉林白山人，博士，主要从事天然产物方向的研究。大连 大连工业大学，116034。Email：dingyan_515@hotmail.com

苍小鑫，赵小明，钟润涛，王文霞，尹 恒，朱靖博，丁 燕. 基于液滴微流控的壳寡糖植物免疫诱导剂荧光检测[J]. 农业工程学报，2017，33(2)：302－307. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.02.042 http://www.tcsae.org

Cang Xiaoxin, Zhao Xiaoming, Zhong Runtao, Wang Wenxia, Yin Heng, Zhu Jingbo, Ding Yan. Fluorescence detection of chitosan oligosaccharides plant immune elicitors based on droplets-microfluidics[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(2): 302－307. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.02.042 http://www.tcsae.org