超声辅助提取辣椒籽蛋白工艺优化

李 茉，倪元颖，彭 郁，温 馨，王宇晓



超声辅助提取辣椒籽蛋白工艺优化

李 茉，倪元颖※，彭 郁，温 馨，王宇晓

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

以辣椒籽为原料，采用超声辅助法提取辣椒籽蛋白并利用响应面优化法提取工艺，在单因素试验的基础上，选取pH值，提取时间，超声功率，料液比4个因素进行响应面试验，根据所得试验结果确定最佳提取条件为：pH值11，提取时间13.31 min，超声功率336.21 W，料液比1∶35.85，在此条件下蛋白的预计提取量为5.90 g/(100 g)。利用Design expert软件对影响辣椒籽蛋白提取量的主要因素及其相互作用进行探讨，结果由大到小依次为：pH值>料液比>提取时间>超声功率。与传统提取方法相比，超声辅助法使得蛋白提取量增加了0.81 g/(100 g)（占传统方法提取量的15.46%），蛋白纯度提高了5.47%。

蛋白；超声波；提取；辣椒籽；响应面设计

0 引 言

辣椒籽是一种丰富的营养资源，含有蛋白质、油脂、粗纤维、维生素和矿物质等营养物质[1]。要了解或应用辣椒籽蛋白质的理化性质和功能性质，最基本的一步是将蛋白质从这种复杂的机体混合物中分离出来，因此辣椒籽蛋白提取工艺是深加工研究的基础。

碱提酸沉法是最传统的提取方法，应用最广泛，这种方法的优势在于成本低，操作简单，但它的缺点是提取时间长，提取率低[2-4]。所以近些年来，利用一些辅助方法可以缩短提取时间并且可以提高蛋白的提取率，其中最为常用的方法就是超声辅助法。

超声辅助提取法利用超声波产生强烈振动、强烈的空化效应和搅拌作用来破坏植物细胞，结合溶剂浸提法达到提取的目的。高能量的超声波作用可以使液体破裂成很多小空穴，这些小空穴闭合时产生的瞬时压力高达几千个大气压，在辅助提取过程中，能够有效地破坏原料细胞壁或者包埋结构的外层，使细胞内容物释放，加速有效成分进入溶剂，增加有效成分的提取率[5-8]。

植物蛋白因其资源丰富、廉价易得以及其独特的生理功能而备受关注，目前已有大量文献报道了多种植物源蛋白质较动物蛋白具有低胆固醇和低脂肪的营养特性[9-10]，同时还具有良好的功能性质，可用作天然的新型食品添加剂[11-15]，此外一些植物蛋白经过改性或酶解后，可获得具有抑菌，抗氧化，降血压等生物活性的多肽，这些多肽除了用作天然食品防腐剂或抗氧化剂外，还可成为开发保健品或药品的新资源[16-19]。

目前对辣椒籽中蛋白的提取工艺研究很少。有文献对辣椒籽蛋白组分进行了分析，研究了12个辣椒品种的籽蛋白，发现清蛋白或谷蛋白的含量最高[20]。因此，本文采用超声辅助碱提酸沉法对辣椒籽中的蛋白质进行提取分离，先通过单因素试验比较不同条件下的提取效果，再结合响应面设计试验，优选出辣椒籽蛋白的最佳提取时间，超声波功率，料液比及提取液pH值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆甜椒籽（L，由新疆晨光公司提供，打粉过40目筛后在-18 ℃冰箱冷藏备用。正己烷、氢氧化钠、浓盐酸、氯化钠、乙醇均购置于国药集团化学试剂有限公司，考马斯亮蓝G-250、PBS缓冲液、BSA标准品均购置于北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 试验仪器

T6型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；IKA C-MAGHS7型磁力搅拌器：梅特勒-托利多公司；WD-9405B型水平摇床：北京六一仪器厂；TGL-16C型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；KQ-500DE型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；LGJ-12型冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；FE20-K型pH计：梅特勒-托利多公司；WKX型高速粉碎机：青州市精诚机械有限公司；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 辣椒籽脱脂处理

用高速粉碎机将除杂后的辣椒籽粉碎，过筛40目，然后室温下用正己烷1:5（g/mL）料液比浸泡，置于摇床上脱脂3 h，真空抽滤，收集残渣再重复进行脱脂，共3次，最后置于通风橱过夜，得到脱脂辣椒籽粉，置于4 ℃冰箱备用。

1.3.2 脱脂辣椒籽粉中基本成分分析

蛋白质含量测定方法参照GB 5009.5-2010[21]，采用凯氏定氮法测定；脂肪含量的测定方法参照GB/T 5009.6-2003[22]的方法，将样品置于索式提取器中，用石油醚来提取脂肪；灰分含量测定参照GB 5009.4-2010[23]的方法，将样品置于（550±25）℃下煅烧4 h，称量残渣的质量；水分含量的测定参照GB 5009.3-2010[24]的方法，将样品在（105±1）℃的烘箱中干燥至恒重。碳水化合物含量的测定参照Zhu等[25]的方法，按100%减去样品的水分含量，灰分含量，脂肪含量及蛋白质含量的总和。

1.3.3 辣椒籽蛋白组分及含量分析

参考Osborne[26]关于植物蛋白4种蛋白的分离方法，首先称取2.000 g样品，以去离子水为溶剂，料液比1:15（g/mL），室温下磁力搅拌30 min，然后10 000×，4 ℃离心15 min，过滤后留上清液，为了充分提取蛋白，提取和离心过程重复3次，然后合并上清液，所得蛋白为清蛋白。接下来残渣依次用1 mol/L NaCl溶液，70%乙醇溶液和0.1 mol/L NaOH溶液以相同的提取方法提取，获得的蛋白分别为球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。收集的上清液蛋白含量采用Bradford测定，计算每种蛋白占总蛋白提取量比例。

1.3.4 超声辅助法辣椒籽蛋白的提取

采用超声辅助碱溶酸沉的方法对辣椒籽中的蛋白进行提取，因为影响提取效果的因素较多，为确定最佳提取工艺，选取超声功率、提取时间、料液比、溶液pH值为考察指标，先进行单因素试验确定蛋白提取过程中各因素的变化规律。

1.3.5 可溶性蛋白浓度测定

采用Bradford法进行蛋白浓度测定。用牛血清蛋白作为标准物进行测定，精确吸取0、100、200、300、400、500L，不足500L补加0.05 mol/L PBS（pH值 6.80）至终体积500L，同时吸取稀释后的待测样品500L，再加5 mL考马斯亮蓝溶液混合均匀，静置3 min，用紫外可见分光光度计在595 nm下测定吸光值。测标准蛋白和样品吸光值时，以蛋白质浓度（mg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标作图。以BSA标准品作为标准蛋白，绘制标准曲线。根据标准曲线计算样品中蛋白质的浓度，再以此来确定样品的蛋白提取量，单位为g/(100 g)。

1.3.6 单因素试验

1）pH值对辣椒籽蛋白提取效果的影响

准确称取1.000 g左右的脱脂辣椒籽粉，记下质量。用0.5 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L HCl溶液调节提取液的pH值为7、8、9、10、11，料液比（g/mL）为1∶20，在（30±3）℃下超声20 min，超声功率为400 W，然后室温下4 200×离心20 min，收集上清液，按照前文1.3.4所述方法测定提取液中的可溶性蛋白含量。

2）提取时间对辣椒籽蛋白提取效果的影响

准确称取1.000 g左右的脱脂辣椒籽粉，记下质量。加入去离子水，料液比（g/mL）为1∶20，用0.5 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L HCl溶液调节提取液的pH值为9，在（30±3）℃下超声功率为400 W，超声时间分别设为5、10、15、20、25、30 min，然后室温下4 200×离心20 min，收集上清液，按照前文1.3.4所述方法测定提取液中的蛋白含量。

3）超声功率对辣椒籽蛋白提取效果的影响

准确称取1.000 g左右的脱脂辣椒籽粉，记下质量。加入去离子水，料液比（g/mL）为1∶20，用0.5 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L HCl溶液调节提取液的pH值为9，在（30±3）℃下超声时间为20 min，超声功率分别设为200、300、350、400、500 W，然后室温下4 200×离心20 min，收集上清液，按照前文1.3.4所述方法测定提取液中的蛋白含量。

4）料液比对辣椒籽蛋白提取效果的影响

准确称取1.000 g左右的脱脂辣椒籽粉，记下质量。加入去离子水，料液比（g/mL）分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，用0.5 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L HCl溶液调节提取液的pH值为9，在（30±3）℃下超声功率为400 W，超声时间20 min，然后室温下4 200×离心20 min，收集上清液，按照前文1.3.4所述方法测定提取液中的蛋白含量。

1.3.7 响应面法设计试验

采用Design Expert 8.0.6软件，以蛋白质提取量为响应值，采用中心组合试验Box-Behnken Design（BBD）[27]，选定pH值，提取时间，提取功率，料液比为自变量进行四因素三水平试验设计并对结果进行分析。试验设计编码值如表1所示。

表1 响应面四因素三水平响应面试验设计

1.3.8 超声辅助提取法与传统碱溶酸沉法比较

称取1.000 g脱脂辣椒籽粉，在响应面优化出的最佳pH值，提取时间，料液比，40 ℃的条件磁力搅拌，然后室温下4 200×离心20 min，收集上清液，按照前文1.3.4所述方法测定提取液中的蛋白含量。所得结果为传统碱溶酸沉的蛋白提取量，与超声辅助法提取辣椒籽蛋白的结果进行比较。然后调节溶液pH值为4使蛋白沉降，离心去上清液，用适量稀碱液中和，将分离出来的蛋白凝胶破解，再冻干制得蛋白粉，测蛋白粉中的蛋白含量。

2 结果与分析

2.1 脱脂辣椒籽粉中基本成分分析

经测定脱脂前新疆甜椒籽脂肪质量分数为18.3%，脱脂后的新疆甜椒籽粉主要成分如表2所示，可以发现辣椒籽粉脂肪质量分数明显降低，仅有1.76 %，蛋白质总质量分数为20.5 g/(100 g)。

表2 脱脂新疆甜椒籽的主要成分

2.2 辣椒籽蛋白组分及含量分析

按照Osborns分离植物蛋白的方法发现本实验选用的辣椒籽蛋白4种蛋白组分所占比例如表3所示，蛋白质量分数由高到低排序依次为清蛋白44.90%，谷蛋白31.78%，球蛋白22.36%，醇溶蛋白0.95%。由此可以看出，清蛋白和谷蛋白是辣椒籽蛋白的主要组成，总质量分数超过75%；质量分数最少的蛋白为醇溶蛋白。这与胡志辉等[20]研究的12个辣椒品种的辣椒籽内四种蛋白组成结果一致，他们发现蛋白以清蛋白和谷蛋白质量分数最高，清蛋白为种子干质量的1.79%～19.07%，谷蛋白为种子干质量的2.40%～19.03%，其次是球蛋白，质量分数为2.10%～8.13%，醇溶蛋白质量分数最低，为1.57%～3.03%。

表3 新疆甜椒籽蛋白组分及质量分数比较

注：表中数值用平均值±标准差表示。

Note: Values in the table were expressed in average value ± standard deviation.

2.3 单因素试验

2.3.1 pH值对辣椒籽蛋白提取效果的影响

如图1所示，辣椒籽蛋白的提取量随着pH值的增加而增大，在pH值为11时达到最大。因为在高pH值条件下有利于氢键断开，氢离子脱离碳原子或硫酸盐基团，使蛋白质表面电荷数增加[28]，促进了蛋白质与蛋白质间的静电排斥和水合作用使蛋白质更易溶解。但天然植物蛋白常与酚类物质以各种方式结合，过高的pH值可能会促进酚类物质的褐变而影响蛋白产物的色泽[29]。毛晓英[2]和Venkatachalam等[30]研究核桃蛋白提取得到相似结果，在pH值11以后，核桃蛋白的提取率提高不显著（>0.05），且提取液颜色发生褐变[30]。因此本试验没有选择pH值≥12的严苛条件，避免出现严重的美拉德反应和蛋白质变性。试验显示在pH值为11时蛋白提取量最大。

此外，本研究通过对辣椒籽蛋白乳化性，起泡性及吸水吸油性等功能性质进行检测，判断在此条件下蛋白是否变性。试验结果显示辣椒籽蛋白与大豆油的乳液平均粒径为5.49m，呈正态分布，说明辣椒籽蛋白可形成较稳定的乳液，具有较好的乳化性质；辣椒籽蛋白溶液的起泡性为2.3，虽低于大豆蛋白溶液（3.3），但仍高于葡萄籽蛋白（0.25）[11]；辣椒籽蛋白的吸油性为（5.63±0.30）g/g高于大豆蛋白（2.43 g/g），吸水性为（2.66±0.06）g/g，与豌豆分离蛋白的吸水性（2.57～2.88 g/g）和草豌豆的吸水性（2.63～3.11）g/g[31]接近。上述结果说明在pH值11的条件下辣椒籽蛋白仍具有较好的功能性质，它在食品加工中应用的潜力有待进一步的系统研究。

2.3.2 提取时间对辣椒籽蛋白提取效果的影响

如图2所示，当提取时间≤15 min时，蛋白提取量随着时间增加而显著升高（<0.05）；当提取时间从15 min增大到30 min时，提取量没有显著变化（>0.05）。在提取初期，辣椒籽蛋白没有充分溶解，随着提取时间增加，脱脂粉中蛋白不断溶出，当提取时间为15 min左右时，在固定条件下，大部分蛋白已经溶出，因此随后即使再增加时间，提取液中蛋白含量的变化没有显著性差异（>0.05）。

2.3.3 超声功率对辣椒籽蛋白提取效果的影响

如图3所示，随超声功率的增加，辣椒籽蛋白提取量也随之增大，当功率达到400 W时，提取量最高，但随后当超声功率增大到最大功率500 W时，蛋白提取量反而略有下降，这可能是在超声功率低于400 W时，随着功率增大，空化作用和机械作用越强烈，分子扩散速度也越大，溶剂更容易渗透到辣椒籽内部，蛋白质分子渗出越快，溶出量越大[32]。功率超过一定范围时，超声频率过高，会产生大量的无用的汽泡，增加衍射衰减，形成声屏障，不利于空化现象的产生[33]。

2.3.4 料液比对辣椒籽蛋白提取效果的影响

如图4所示，在开始阶段随着料液比的增大，辣椒籽蛋白提取量也显著增大（<0.05），当料液比达到1∶30后，蛋白提取量开始出现下降趋势，且变化趋于和缓。这是因为当料液比达到一定程度时，分子扩散速度趋于一定，溶液稀释作用也对蛋白质的溶解增加作用不显著，蛋白质分子与蛋白质分子之间的吸附作用可能大于蛋白质分子与水之间的扩散作用，从而导致蛋白质溶出量略有下降[7]，此外料液比过大也不利于节约资源。

2.4 响应面优化法

2.4.1 Box-Behnken试验设计与结果

以辣椒籽蛋白提取量为响应值进行响应面优化的试验结果如表4所示，采用Design Expert软件，选择Box-Behnken Design模型，对试验设计中各组的蛋白提取量进行回归分析，得到回归方程如下：

=5.24+0.511+0.0622+0.0283+0.324−0.1212−0.05513−0.03214−0.04523−0.1224+0.0134+0.04512−0.1822−0.03232−0.2842

式中为辣椒籽蛋白提取量，g/(100 g)；1，2，3，4分别为pH值，提取时间，超声功率，料液比4个自变量的编码值。响应值中蛋白提取量与回归方程预测值的相关系数为0.974 8，拟合状况良好，说明建立的回归模型可行。

表4 响应面分析试验设计及结果

2.4.2回归方程显著性分析

为检查回归方程的有效性，进一步确定相关因素对辣椒籽蛋白提取量的影响程度，对回归模型进行方差分析，结果如表5。

经分析发现，该模型的值为38.73，<0.000 1，说明所选模型极为显著，失拟项=0.289 3>0.05，说明失拟项差异不显著；由自变量的值可知，模型一次项1、4，二次项42差异极显著（<0.0001），二次项22，交互项12，24显著（<0.05），其他项差异不显著。由自变量值大小可知，各因素对辣椒籽蛋白提取量的影响由大到小依次为：pH值>料液比>提取时间﹥超声功率。

表5 回归方程模型系数的显著性检验

2.4.3 反应条件优化及模型验证

利用Design Expert软件优化试验数据，得出超声辅助碱溶酸沉法提取蛋白的最佳工艺参数为：pH值11，提取时间为13.31 min，超声功率336.21 W，料液比1∶35.85，在此条件下蛋白的预计提取量为5.90 g/(100 g)。为了检验上述优化结果，本试验利用优化后的试验参数进行验证试验。考虑到实际的可行性和便利性，修正提取工艺为：pH值11，提取时间为13 min，超声功率350 W，料液比1∶36，在此条件下做3次平行试验蛋白的提取量为(6.05±0.09) g/(100 g)，略高于Design Expert软件预测值。说明采用响应面法优化得到的辣椒籽蛋白提取条件准确可靠，具有实用价值。

2.5 超声辅助提取法与传统碱溶酸沉法比较

超声辅助提取法和传统碱溶酸沉法辣椒籽蛋白的提取量分别为（6.05±0.07）和（5.24±0.05）g/(100 g)，蛋白纯度分别为83.93%和78.46%，可以发现超声辅助法使得蛋白提取量增加了0.81 g/(100 g)（占传统方法提取量的15.46%），蛋白纯度提高了5.47%，还提高了辣椒籽蛋白粗提物的纯度5.47%。这是因为超声波可以产生强烈振动、空化效应和搅拌作用来破坏植物细胞，使细胞内的蛋白更易溶出，提高了蛋白产率。

3 结 论

本文采用超声辅助法提取辣椒籽蛋白，利用响应面法对提取工艺进行优化，应用Design-Expert8.0.6软件，采用Box-Behnken建立了pH值，提取时间，超声功率，料液比与辣椒籽蛋白提取量的数学模型，决定系数2=0.9748，回归模型显著，拟合程度好，有实际意义。

通过单因素和响应面试验确定最佳提取条件为：pH值11，提取时间为13.31 min，超声功率336.21 W，料液比1∶35.85。与传统溶剂法提取辣椒籽蛋白相比，超声波辅助法提取量和蛋白纯度较高。此外通过显著性试验得到，影响提取量的主要因素由大到小依次为：pH值>料液比>提取时间>超声功率。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction of capsicum seed protein isolate

Li Mo, Ni Yuanying※, Peng Yu, Wen Xin, Wang Yuxiao

(100083,)

Capsicum seed protein isolate is a new type of plant protein resources. From this research, the protein isolate was separated into water-soluble(WS), salt-soluble(SS), alkaline-soluble(AS) and ethanol-soluble(ES) fractions. Water-soluble and ethanol-soluble fractions were the major constituents, about more than 75% of the total protein. This paper focused on ultrasonic-assisted extraction technology of extracting protein isolate from capsicum seed. Response surface methodology was used to determine optimum conditions for protein extraction. The experiments designed 29 groups of different conditions to extract protein from capsicum defatted flours. Independent variables which would affect protein extracting rate were discussed, such as pH (7, 8, 9, 10 and 11), ultrasonic power (200, 300, 350, 400 and 500 W), extraction time (10, 15, 20, 25 and 30 min) and material-solvent ratio (1:10, 1:20, 1:30, 1:40 and 1:50). The model equation was set up. In the model equation, the coefficient of association (2) was 0.9748, indicating it’s a reasonable matching to the experimental data. The optimized conditions were as follows: pH value was 11, ultrasonic power was 336.21 W, extraction time was 13.31 min and the material-solvent ratio was 1:35.58. According to this optimized condition, the extraction rate of protein isolate was 5.90 g/(100 g) defatted red pepper seed. Due to the limitations of experimental facilities, the optimized conditions were modified. The results were as follows: pH value was 11, ultrasonic power was 350 W, extraction time was 13 min and the material-solvent ratio was 1:36. The optimum conditions were verification. The results showed that extraction at the modified conditions gave a protein yield at 6.05 g/(100 g). The experimental values were found to be in agreement with the predicted ones. Analysis of variance (ANOVA) of independent variables was performed. The statistical analysis data revealed that linear, quadratic and interaction terms was significant (<0.05). The lack of fit test measured the failure of the model to represent data in experimental domain at points which are not included in the regression. There was a non-significant lack of fit that further validates the model (> 0.05).The significance of each coefficient was determined using thetest andvalue. pH value and solvent/meal ratio were the most significant factors (<0.001). Also, interaction effect of pH and extraction time, interaction effect of extraction time and materials/solvent ratio were both significant (<0.05). The ultrasonic power was not significant factor (>0.05). The main factors were analyzed by Design software, which could affect the yield of protein. The results were as follows: pH value>material/solvent ratio>extraction time>ultrasonic power. Compared with traditional extraction methods, the extraction yield of protein increased from 5.24 to 6.05 g/(100g), while the purity of capsicum seed protein isolate enhanced from 78.46% to 83.93% by ultrasonic-assisted method. These results give the advices in processing protein from capsicum seeds according to optimized condition. Furthermore, it provides a theoretical reference for the industrial production and application of capsicum seed protein isolate.

protein; ultrasonic; extraction; capsicum seed; response surface methodology

10.11975/j.issn.1002-6819.2016.24.042

TS255.36

A

1002-6819(2016)-24-0309-06

2016-07-02

2016-11-20

国家公益性行业专项园艺作物产品加工副产物综合利用（201503142）

李茉，博士生，主要从事天然产物提取研究，北京 中国农业大学食品科学与营养工程学院，100083。Email：limo_0125@163.com.

倪元颖，教授，博士生导师，主要从事果蔬加工研究，北京 中国农业大学食品科学与营养工程学院，100083。Email：niyuany@163.com