都匀毛尖本地种茶树代谢组研究

裴会敏， 陈 志， 张龙芬， 文 狄， 王 芬

(1.黔南民族师范学院生物科学与农学院， 贵州 都匀 558000；2.长顺县农业农村局， 贵州 长顺 550700)

代谢组学[1-3]是后基因组时代各种组学中一种下游的研究方法，可以对组织、器官或细胞中的所有低分子量代谢产物进行系统分析，是基因与表型的媒介，能够揭示细胞内各种代谢物生物分子网络的关联性，能识别具有重要作用的组间显著差异代谢物，并阐明这些差异物在生物活动中的分子机理[4-6]。李萌茹等[4]利用代谢组学技术对黄芩根、茎、叶、花的醇提物进行研究，结果表明，这些代谢物能够对衰老大鼠代谢紊乱起到一定的改善作用。代谢产物可以直接反映生物学过程，也是反映生物学表型的基础，通过对代谢组的探索，可以对代谢产物进行定性和定量研究[7]。王春波等[8]比较分析了贵定云雾茶本地种和引进种的差异代谢物，表明儿茶素和原花青素B 1在本地种的含量较高，因此本地种更适合绿茶的加工。汪生等[9]利用超高液相色谱-高分辨质谱联用代谢组技术比较分析了普洱生茶和普洱熟茶的差异代谢物，为科学合理解释两种茶之间的功效差异提供理论依据。徐春晖等[10]利用超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱(Ultra Performance Liquid Chromatography-quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry,UPLC-QTOF-MS)代谢组方法比较狗牯脑、庐山云雾和婺源绿茶的差异代谢物，并对它们的品质进行分析，研究结果为保护这3种茶叶提供一定的理论依据。曾亮等[11]利用UPLC-MS/MS检测普洱生茶水提物，研究表明，随着贮藏时间的延长，茶多酚、儿茶素等呈现下降趋势，黄酮上升。于然等[12]采用高效液相色谱法同时测定茶叶中6种茶多酚含量，结果表明，白茶水提物中表没食子酸儿茶素最多，而竹叶青绿茶中含量最多的是表没食子儿茶素没食子酸酯。贾浩等[13]基于代谢组学技术对单面针的叶、根和茎进行研究，结果表明，单面针根茎部有效成分含量高于叶。本研究将代谢组学技术应用于茶树中，主要是研究其各个器官的代谢物种类、数量的差异以及它们之间的相互关系，并结合生物信息学的分析技术，对茶树各个器官中化学成分进行定性和定量分析，从整体上探讨茶树各化学成分的特征和规律。

贵州地处东经103°36′～109°35′，北纬24°37′～29°13′，地形复杂、气候温暖湿润、土壤肥沃、水源丰富，是中国茶树的起源中心，具有生产优质茶的自然环境[14-15]。都匀毛尖茶产自中国贵州，主要生长在黔南布依族苗族自治州的都匀市和贵定县等地，1915年在巴拿马万国博览会上获得“金奖”[16]。茶树中含有很多对人体健康有益的生理活性物质[17-19]，如茶多酚和茶氨酸，具有极高的营养价值、科研价值和经济价值。茶是世界公认的健康饮料[20-21]，茶叶中的化学物质直接影响茶叶的口感和品质[22-23]。以往关注的焦点主要在茶树的叶片上，对茶树茎和根的功能价值研究不足，事实上茶树茎含有大量对人类有用的生物化学物质，以代谢组为基础分析都匀毛尖本地种茶树根茎与叶的代谢物差异，挖掘根茎和叶中的有益成分，可推动都匀毛尖本地茶树品种的健康发展。UPLC-QTOF-MS技术[24-25]具有灵敏性强且通量高的特点，可以对茶树叶片的代谢产物进行测定。因此，本实验利用UPLC-QTOF-MS技术结合生物信息学的方法，研究都匀毛尖本地种茶树茎根与叶之间的代谢物差异，以期为挖掘都匀毛尖茶叶、茎中的有益功能性成分和培育优良品种等提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2018年11月，在贵州省黔南州都匀市红敏茶园选取一株健康、无病的本地种茶树作为母株，剪取带叶茎枝条扦插。2021年4月选取6株长势良好并且株高一致的茶苗分为3组，每组2株，在第1组中剪取叶3片作为叶的第一个生物学重复，茎3根作为茎的第一个生物学重复，根须大约1 g作为根的第一个生物学重复，每个样本3个生物学重复，共9个样本，将样本全部放入离心管中再放入液氮中，最后放入-80 ℃的冰箱中保存备用。

甲醇 CAS：67-56-1，纯度：LC-MS级；乙腈 CAS：75-05-8，纯度：LC-MS级；L-2-氯苯丙氨酸 CAS：103616-89-3，纯度≥98%；醋酸铵 CAS:631-61-8，纯度：LC-MS级；氨水 CAS:1336-21-6，纯度：LC-MS级别。

Agilent 1290高效液相色谱仪，AB Sciex品牌TripleTOF 5600型高分辨质谱仪，Thermo Fisher Scientific品牌Heraeus Fresco 17型离心机，Sartorius品牌BSA 124 S-CW型天平，Merck Millipore品牌明澈D 24型纯水仪，深圳市雷德邦电子有限公司的PS-60 AL型超声仪， Waters品牌ACQUITY UPLC BEH Amide(1.7 μm 2.1×100 mm)型色谱柱。

1.2 实验方法

1.2.1样本制备

称取样品50 mg，然后加入1 000 μL提取液(V甲醇∶V乙腈∶V水=2∶2∶1，内标浓度2 μg/mL)，涡旋混匀30 s。加入磁珠，45 Hz研磨仪处理4 min，超声5 min(冰水浴)，重复3次。低温条件下离心15 min(13 000 r/min，4 ℃)，取出200 μL上清液于2 mL进样瓶，每个样本各取20 μL混合成QC样本，再取200 μL上机检测。

1.2.2色谱条件

沃特世Acquity UPLC BEH Amide色谱柱(1.7 μm，2.1×100 mm)；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：0.1%甲酸乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5 min(5% A)，0.5～7 min(35% A)，7～8 min(60% A)，8～9 min(60% A)，9～10 min(5% A)，10～12 min(5% A)；流速：400 μL/min；进样量：3 μL。

1.2.3质谱条件

利用AB 5600 Triple TOF质谱仪，根据IDA功能并应用Analyst TF 1.7，AB Sciex进行一二级数据的搜集。雾化气压：60 Psi，辅助气压：60 Psi，气帘气压：35 Psi，温度：65 ℃，喷雾电压：5 000 V(正离子模式)或-4 000 V(负离子模式)。

1.2.4数据处理

基于标准品上机建库的信息和二级质谱信息进行代谢产物的测定，并且利用软件ProteoWizard[26]和XCMS[27]对数据进行转化、代谢产物进行鉴定等一系列数据处理，然后进行数据归一化对代谢物进行定量，随后对9个样本进行主成分分析，并利用R包ropls进行OPLS-DA模型计算[28]，最后根据代谢物名称在对应数据库中进行查找，对代谢物进行KEGG、HMDB和Lipidmaps注释。

2 结果与分析

2.1 重复相关性评估

负离子模式下通过对3个器官9个样品进行生物学重复关联性评价，利用斯皮尔曼相关系数r进行评估，其平方值如果接近1，说明器官内生物学重复较好(图1)，3个器官的重复相关性值大部分介于0.7～0.9之间，说明器官内的重复性是可用的，而器官间的相关性值几乎都在0.4以下，表明3个器官间的差异代谢物比较可靠。

图1 样品间相关性评估Fig.1 Correlation assessment among samples

2.2 主成分分析

负离子模式下利用UPLC-QTOF-MS对根茎和叶进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，茎、根和叶组间很明显被划分开，表明3个器官的化学组成存在显著差异(图2)，除根外，茎和叶的样本组内较为聚集，说明数据的稳定性和重复性较好，可用于后续分析。在叶和根的主成分分析中，第一主成分和第二主成分贡献率累计达95%以上，表明可靠性较强。在叶和茎的主成分分析中，主成分1的贡献值达78.18%，主成分2的贡献值达14.7%，二者之和达92%，表明可信度较高。在茎和根的主成分分析中，主成分1和主成分2的值分别达67.34%和25.07%，二者总值超过92%，说明主成分分析可为鉴别两种器官提供足够的可信度。在叶、茎和根的主成分分析中，主成分1和主成分2的贡献率分别为68.48%和16.12%，累积贡献率超过84%，说明3组样品在代谢产物种类、含量等方面存在差异。

图2 不同器官组织主成分得分 Fig.2 PCA scores of different organs

2.3 正交偏最小二乘法判别分析

虽然主成分分析法能够有效地提取主要信息，但是往往会忽略一些敏感性不强的信息，而正交-偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)能筛选掉无关紧要的变量，从而更好地观察组间的差异。在叶与根的OPLS-DA模式分析中，叶和根很明显的分布在横坐标的两侧，R2X=0.895，R2Y=1，Q2=0.991，这些数值很明显揭示了OPLS-DA模型可以反映出两种器官间的代谢产物差异。在叶与茎的OPLS-DA模型分析中，R2X=0.715，R2Y=0.995，Q2=0.922，表明模型稳定性可靠。在茎与根的OPLS-DA模型分析中，两种器官组织划分明确，模型验证后参数值R2X=0.765，R2Y=1，Q2=0.97，说明模型具有较好的预测性和可靠性(图3)。

图3 3种器官组织的正交偏最小二乘判别分析Fig.3 OPLS-DA of the three organs

为检查OPLS-DA模型的可靠性，采用置换测试法对负离子模式下模型进行外部交叉验证(图4)，当R2和Q2回归线的斜率大于1，且置换检验图中所有R2和Q2左边的点都低于横坐标为1处的点，表明模型未过拟合且稳健，具有很好的稳定性和预测性。

图4 正交偏最小二乘判别分析模型置换检验Fig.4 OPLS-DA model permutation test

2.4 差异代谢物筛选

本研究筛选差异代谢物的标准为VIP>1，p<0.05并且Fold Chang>1，其中VIP指第一主成分变量投影重要度。负离子模式下共鉴定出504个差异代谢物。叶与根有205个差异代谢物，其中156个差异代谢物下调，49个差异代谢物上调，299个无变化，显著性最高(p值最大)的5个代谢物分别是梫木毒素(Grayanotoxin I)上调、胸腺嘧啶核苷(Thymidine)下调、络氨酸，天冬氨酸，亮氨酸和谷氨酸(Tyr，Asp，Leu，Glu)下调、脱氧次黄苷酸(2′-Deoxyinosine 5′-monophosphate)下调、表儿茶素单没食子酸酯(epicatechin monogallate)下调。叶与茎有112个差异代谢物，其中24个上调，88个下调，最显著的5个差异代谢物分别是3-甲基-2-氧戊酸钠(3-methyl-2-oxovaleric acid sodium salt)下调、氟尿苷(floxuridine)下调、阿拉伯糖(arabinose)下调、美索达嗪(mesoridazine)上调、羟基积雪草酸(madecassic acid)下调。茎与根有130个差异代谢物，其中46个上调，86个下调，最显著的5个差异代谢物分别为5-羟基L色氨酸(5-Hydroxy-L-tryptophan)下调、拉米夫定(lamivudine)下调、异亮氨酸，天冬氨酸和赖氨酸(ILE，ASP，LYS)上调、丝氨酰组氨酸(serinyl-histidine)下调、奥美拉唑(omeprazole)下调(图5)。火山图中每个点代表一个代谢物，横坐标代表倍数变化，纵坐标是t检验的p值，散点大小代表VIP值，蓝色、红色和灰色的点分别表示上调、下调和非差异代谢物。

图5 3种器官差异代谢物火山图Fig.5 Volcano plot of differential metabolites in three organs

负离子模式下叶与根和茎与根的共同差异代谢物有90个，叶与根和叶与茎的共同差异代谢物有86个，叶与茎和茎与根的共同差异代谢物有43个，叶、茎和根共同的差异代谢物有29个，说明这些差异代谢物在各自的器官发挥独特的作用(图6)。

图6 3种器官共同差异代谢物Fig.6 Common differential metabolites in three organs

2.5 代谢物注释

将代谢产物按照KEGG COMPOUND数据库的注释信息匹配到对应的通路。负离子模式下次级代谢物的生物合成((ko 01110)，130)、不同环境下的微生物代谢((ko 01120)，130)、碳代谢((ko 01200)，130)、氧代羧酸代谢((ko 01210)，130)、脂肪酸代谢((ko 01212)，130)、芳香族化合物的降解((ko 01220)，130)、氨基酸生物合成((ko 01230)，130)、辅因子生物合成((ko 01240)，130)、代谢通路((ko 01100)，130)等中的代谢物最多。

HMDB数据库广泛用于代谢组学研究，负离子模式下在四级水平分类中，有181个代谢物注释到HMDB数据库中，其中类黄酮、类肽、类固醇及其衍生物、有机膦酸及其衍生物、有机磷酸及其衍生物、异黄酮类、羧酸及其衍生物、大环内酯类、有机氧复合物、香豆素类及其衍生物、缩酚酸及缩酚酸环醚、杂色曲霉素、单宁、肉桂酸及其衍生物中的代谢物注释最多。

Lipidmaps数据库是脂质代谢研究和脂质组学分析领域重要的工具，有81个代谢物可以注释到lipidmaps数据库中。负离子模式下注释到酚类脂、线性四环素、多烯类等的代谢物最多。

利用R软件包[29]，选用超几何检验的方法对正负离子模式下所有差异代谢物KEGG注释结果进行富集分析，在根茎叶的所有差异代谢物中，四氢叶酸(neg_368)、4-烯丙基苯甲醚(pos_335)、咖啡酸(neg_246)、芥子酰基菜果酸酯(pos_755)、芥子醇(pos_180)、氯代物(neg_183、pos_999)、伞形酮(neg_123、pos_1113、pos_681)、羟基阿魏酸(pos_480)、对烯丙基苯酚(pos_359)、香豆醇(pos_535)、莨菪亭(neg_171)、松柏醇(pos_1098、neg_423)、2-羟基肉桂酸(neg_23)、甲基硫腺苷(neg_13)、4-羟基香豆素(neg_115)富集在苯丙素生物合成、类黄酮生物合成和花青素生物合成通路中；飞燕草素(pos_141)、表没食子儿茶素(neg_22、pos_45)、橙皮苷(neg_325)、异戊烯焦磷酸(neg_106)、表儿茶素(neg_80、pos_20、neg_210)、根皮素(neg_70)、柚皮苷(neg_218、pos_980、neg_82、pos_993)、5,7二羟基黄酮(neg_181)、生松素(pos_865、neg_296)、新橙皮苷(pos_961、neg_304)、芹菜素(pos_710)、二氢槲皮素(pos_140)、去甲氧基姜黄素(neg_205)、牡荆素(neg_75、pos_926)、半乳糖醛酸(neg_45)、紫铆查尔酮(neg_107)、木犀草素(neg_271)、没食子儿茶素(pos_72)富集在类黄酮生物合成和花青素生物合成通路中；3-甲基苯甲醛(pos_44)、香豆醇(pos_53)、天葵素3-O葡萄糖苷(neg_67)、芹菜素7-O-葡萄糖苷(pos_927、neg_340)、锦葵素3-O-葡萄糖苷(neg_50)、芦丁(neg_68)、槲皮素3-O-葡萄糖苷(pos_21、neg_28)、槲皮苷(neg_32、pos_316)、芹菜素7-O-新陈皮糖苷(pos_1076)、芹菜苷(neg_272、pos_1069)、异牡荆素(neg_27)、紫云英苷(neg_449、pos_26)、葡萄糖苷(pos_161)富集在花青素生物合成路径中(图7)，以上结果表明，在同一通路中的代谢物具有功能上的相关性。图中红色的椭圆形节点为通路，蓝色的三角形节点、绿色的菱形节点和桃红色的矩形节点表示差异代谢物。

图7 3种器官差异代谢物富集网络Fig.7 Differential metabolites enrichment network in three organs

3 讨论与结论

本研究利用UPLC-QTOF-MS代谢组技术对3种器官9个样品的负离子模式下504个代谢物进行了分析，揭示了在都匀毛尖本地种茶树的3种器官中存在较大的成分差异，叶与根有205个差异代谢物，叶与茎之间有112个差异代谢物，茎与根之间有130个差异代谢物，3种器官中共同的差异代谢物有29个。通过主成分分析、正交偏最小二乘法判别分析和重复相关性评估证明获得的差异代谢物比较可靠。

负离子模式下叶与根有61个差异代谢物在KEGG中被注释。异牡荆苷、根皮苷、锦葵素3-O-葡萄糖、伞形酮、莨菪亭、绿原酸盐、豆异黄酮、柚皮素、马钱苷酸、芹菜苷、新橙皮苷、6′氧丙二酰黄豆苷、巴卡亭等在叶中上调，参与茶多酚代谢过程，主要有黄酮和黄酮醇生物合成、类黄酮生物合成、花青素生物合成、苯丙素生物合成、异黄酮类生物合成、单萜生物合成、二萜生物合成等。这些代谢物主要决定茶汤涩味。次黄嘌呤核苷、脱氧次黄苷、2′脱氧次黄苷5′单磷酸、黄嘌呤核苷等也在叶中上调，主要参与嘌呤代谢和咖啡因代谢，嘌呤类物质影响茶叶适制性，咖啡碱使茶叶具有辛苦味。奎宁酸、莽草酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、O-乙酰-L-丝氨酸、5-羟基-L-色氨酸、右旋脯氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、肌肽、3,4二羟基扁桃酸、叶酸、四氢叶酸等主要参与各种氨基酸代谢和生物合成，这些氨基酸是茶叶滋味的组分，使茶叶具有鲜爽味。肌醇、棉子糖、蔗糖、L-核酮糖、N′N′二乙酰基壳二糖、D-木酮糖、2-脱氢-3-脱氧-葡萄糖酸盐、半乳糖醛酸等主要参与各种糖类代谢，增加茶的甜味。都匀毛尖本地种茶树中含有丰富的氨基酸、茶多酚、嘌呤等物质，与王春波等[8]的研究结果一致。

负离子模式下叶与茎有26个差异代谢物注释到KEGG数据库中，谷氨酸钠、水杨酸、落叶松脂醇、N羟乙酰神经氨酸等在茎中上调，其中谷氨酸钠主要参与各种氨基酸代谢和氮代谢，谷氨酸能与氨结合从而降低血液中的氨含量起减毒作用[30]。谷氨酸钠还可作为调味剂提高食品的鲜味。焦谷氨酸在茎中也上调，参与谷胱甘肽代谢，由谷氨酸分子内脱水而成，如果谷胱甘肽合成酶缺陷，可引起焦谷氨酸血症[31-32]。水杨酸主要参与苯丙氨酸代谢和植物激素信号转导，可用于制备阿司匹林、水杨酸钠、水杨酰胺、止痛灵等药物[33]。落叶松脂醇对肿瘤细胞具有抑制作用[34]。N羟乙酰神经氨酸参与氨基糖和核苷酸糖代谢，是某些癌症中的一种特异性标志物，在肿瘤细胞转移中起重要作用[35]。

负离子模式下茎与根有36个差异代谢物注释到KEGG数据库中。异牡荆苷、槲皮苷、锦葵素-3-O-葡萄糖苷、4-羟基香豆素、6′-O丙二酰黄豆苷、芹菜素7-葡萄糖苷、松柏醇等在茎中上调，主要参与黄酮、黄酮醇、黄烷醇、花青素、苯丙素等的生物合成，说明这些嫩茎具有抗氧化、抗辐射、抗癌、解毒等功能。定性与定量分析都匀毛尖本地种茶树不同器官代谢组比较研究在茶叶生物学研究中具有重要意义，为培育良种茶树提供理论基础。