蕙兰E类MADS-box SEP基因的克隆与时空表达特性

田云芳， 梅惠珍， 卢 超， 周明媚， 陈丽培，张耀广， 刘宇邈， 陈景鲜， 杨玉珍

(1.郑州师范学院生命科学学院， 河南 郑州 450044；2.郑州市观赏药用特色资源植物重点实验室， 河南 郑州 450044；3.荥阳索河郊野公园， 河南 郑州 450100)

开花是高等植物个体生长发育的中心环节，是植物从营养阶段向生殖阶段的过渡[1]。20世纪90年代，继Coen等[2]提出植物ABC花器官形成模型以来，2001年Theiben[3]又在此基础上将ABC模型扩展为ABCDE花发育模型，理论上认为参与调控植物花器官组织形成的有A、B、C、D、E五类功能基因。

在拟南芥中，E类基因有4个，SEPALLATA1(SEP1)，SEP2，SEP3，SEP4[3]，它们的基因功能存在极大的冗余性，在花器官的四轮组织中都可以表达，表达模式相近，仅是突变SEP4无明显或非常微弱的表型改变，若四类基因SEP1、SEP2、SEP3、SEP4均进行突变，四轮花器官组织变成苞片的结构，说明拟南芥的SEP类基因SEP1、SEP2、SEP3、SEP4均和花的发育有关。

因此，拟南芥中SEPALLATA类转录因子与A、B、C类转录因子构成蛋白质复合体一起参与控制花器官的生长发育。E类蛋白不但可以与A、B、C类同源异型蛋白一起作用，控制萼片、花瓣、雄蕊和心皮的发育，而且可以和D类同源异型蛋白共同作用，控制决定胚珠的发育[4-5]。

MADS-box花同源异型基因SEP类基因分属为E类，在许多经济作物果实的生长发育中产生不同的调节作用[5-6]，在甘菊中，ClSEP1在胚珠中高度表达[7]；在枣中，3个E类基因(ZjSEP1/2、ZjSEP3和ZjSEP4)在枣花和果中均有表达[8]；在小麦中，TaSEP3-A1，TaSEP3-B1和TaSEP3-D1均在花和果实中表达[9]；在铁皮石斛中，SEP-A基因在合蕊柱与唇瓣中表达，SEP-B基因在唇瓣、花萼和幼叶中表达[10]；在水稻中，SEP基因参与调控小穗表型、穗花发育，花器官产生和花分生组织的决定[11-14]。

蕙兰(Cymbidiumfaberi)为兰科兰属，是地生兰的重要种之一，是花中珍品。花轮状结构较为典型，相比双子叶植物花器官的组成结构较为一致，其唇瓣高度特化。蕙兰的花器官对于花发育相关基因在单子叶植物中的作用研究是非常理想的实验材料。

本实验以蕙兰作试材，通过RT-PCR技术克隆得到1个与花发育相关的SEP基因，并利用实时荧光定量的方法对目的基因进行相对表达分析，为明晰在蕙兰花发育进程中E类基因的作用机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

蕙兰植株采于河南大别山，后栽植在郑州师范学院校园智能玻璃温室。采用蕙兰3个生长发育阶段的13种不同器官组织作试材，分别为成苗阶段的根与叶片，花蕾阶段的根、叶片与花葶，盛花阶段的叶片、花葶、子房、合蕊柱、唇瓣、花瓣、萼片等发育期样品。所取每种器官或组织样品分别用液氮速冻30 s，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 方 法

1.2.1RNA提取和cDNA合成

所取蕙兰不同时期样品通过TRIzol Reagent (Ambion)试剂盒提取其总RNA，蕙兰花蕾阶段的花蕾总RNA 通过M-MLV 逆转录酶(TaKaRa)合成cDNA，进行克隆蕙兰SEP目的基因。RT-qPCR(实时荧光定量)实验用cDNA模板通过PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)进行合成，10倍体积稀释后用于RT-qPCR。

1.2.2蕙兰SEP目的基因的获得

依据NCBI数据库中同源SEP基因序列(建兰JQ 326258.1、文心兰HM 140844.1小兰屿蝴蝶兰KF 673857.1、木石斛DQ 119842.1 )设计上下游简并引物，进行目的基因中间片段的克隆，预期长度为383 bp，PCR反应体系是25 μL：10×buffer 2.5 μL，dNTP 600 μmol/L，cDNA 1 000～2 000 ng，上下游引物各0.5 μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U，其余用ddH2O补齐。反应程序设置为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，设循环数为35；72 ℃延伸10 min。获得目的片段后进行凝胶回收，再连接到载体pMD 19-T，热激转化感受态细胞大肠杆菌DH 5 α，涂布于含有Amp、IPTG和X-cal的固体LB培养基上，37 ℃培养箱中倒置暗培养14 h，筛选、PCR检测、扩摇、测序。引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2.3蕙兰SEP基因的表达分析

根据所获得蕙兰SEP基因序列设计1对特异引物(SEP-QF和SEP-QR)，以蕙兰ACT(JN 177718)和UBQ3(KC 794503)作内参照基因，通过SYBR Premix ExTaqTMⅡ kit(TaKaRa)进行RT-qPCR实验，扩增体系为25 μL，扩增条件如下设置：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，58 ℃复性15 s，72 ℃延伸15 s(共设循环数为40)。反应在荧光定量PCR仪(realplex2，德国Eppendorf)上进行。利用熔解曲线和测序来验证分析引物特异性，PCR反应结束后表达相对丰度计算方法为：Rel.Exp=2-ΔΔCt。

2 结果与分析

2.1 SEP基因cDNA的同源克隆

以蕙兰花蕾总RNA为模板反转录，再以其反转录产物结合同源序列设计的上下游简并引物，进行RT-PCR扩增，得到目标扩增产物后，对其切胶回收、热激转化、筛到阳性克隆后进行核苷酸序列测序。测序鉴定后得到核苷酸序列长度为373 bp(图1)，将该核苷酸序列提交NCBI数据库检索其与其他物种的同源性，依BLASTN显示，与春兰KF 924272.1的SEP基因同源性达到98%，与建兰JQ 326258.1、文心兰HM 140844.1 小兰屿蝴蝶兰KF 673857.1、木石斛DQ 119842.1的SEP基因同源性分别为97%、92%、88%、82%。

表1 扩增SEP基因cDNA序列所用的引物及引物之间在各扩增反应中的组合Table 1 PCR primers for amplification of cDNA sequence of SEP gene and combination of primers in amplification reaction

2.2 蕙兰SEP氨基酸序列分析

NCBI数据库中Blastp搜索该基因氨基酸序列显示，所克隆基因包含典型的MADS功能域(图2)，属于SEPALLATA1-likeMADS-box亚家族，进一步分析发现，CfSEP1基因所编码的蛋白也有一个K盒结构域(图2)，GenBank中登录号为：MW 654191。该基因编码的蛋白与春兰AXY 87448.1和建兰AFH 66785.1的同源性达98%，与木石斛AAZ 95252.1、小兰屿蝴蝶兰AHW 52536.1、文心兰ADJ 67238.1的同源性均可达到90%。

图2 CfSEP 1蛋白保守功能域Fig.2 Conservative functional domain of CfSEP 1 protein

2.3 CfSEP1在蕙兰各组织器官中的表达

从图3可以看出，CfSEP1在蕙兰各组织器官中的相对表达丰度顺次为：花瓣(Ⅲ)>萼片(Ⅲ)>唇瓣(Ⅲ)>花蕾(Ⅱ)>合蕊柱(Ⅲ)>子房(Ⅲ)>花葶(Ⅱ)>花葶(Ⅲ)，在花器官中高丰度表达，尤其是花被片；在营养生长期、花蕾期、盛花期的根、叶中几乎未检测到荧光信号。很明显，CfSEP1只在蕙兰的生殖器官中表达，而在营养器官中均不表达。对于3个生长时期，CfSEP1在蕙兰器官组织中的表达量逐渐升高，说明CfSEP1主要调控蕙兰的生殖器官的生长发育，促进蕙兰的生殖生长。

注：G0为苗期根，Y0为苗期叶，G1为花蕾期根，Y1为花蕾期叶，T1为花蕾期花葶，L1为花蕾期花蕾，Y2为盛花期叶，E2为盛花期花萼，B2为盛花期花瓣，C2为盛花期唇瓣，R2为盛花期合蕊柱，F2为盛花期子房，T2为盛花期花葶。Ⅰ为成苗期；Ⅱ为花蕾期；Ⅲ为盛花期。 图3 CfSEP1在蕙兰各组织器官中的表达Fig.3 Expression of CfSEP1 in the tissues of Cymbidium faberi

3 讨论与结论

本研究中CfSEP1与春兰SEP基因表达特性相似[15]，CgSEP3在春兰花器官中均有检测到，其中表达量较高的组织是萼片、侧瓣和唇瓣，表达量较低的是子房和蕊柱。CgSEP3可能在春兰花瓣和萼片的形成过程中具有重要作用。本研究中CfSEP1基因核苷酸序列和所编码的氨基酸序列与CgSEP3基因核苷酸序列(KF 924272.1)和所编码的氨基酸序列(AXY 87448.1)的同源性均可以达到98%。CgSEP3属于AP1/AGL9亚族的SEP分支。与芒果MiSEP3基因的表达特性也相似[16]，叶中表达量较低在花中达到表达高峰。莲NnSEP3也主要在花中表达[17]。

小麦(Triticumaestivum)WSEP(wheatSEPALLATA)[18]、加利福尼亚罂粟(Eschscholziacalifornica)EscaAGL9(AGAMOUSlike9)[6]、矮牵牛(Petuniahybrid)FBP2(floralbindingprotein2)[19]、西红柿(Solanumlycopersicum)TM5(tomotoMADSboxgeneno.5)[20]等仅在花器官内三轮组织(花瓣、雄蕊和雌蕊)表达，而萼片部分未有表达。CfSEP1相对表达分析表明，CfSEP1在花被片花萼、花瓣中均见表达，其表达特征显然异于矮牵牛、西红柿等的SEP3类基因，但相似于文心兰(OncidiumGower Ramsey)SEP3类基因OMADS6和百合(Liliumlongiflorum)SEP3类基因LMADS3[21-22]，蝴蝶兰(Phalaenopsisamabilis)PeSEP3也参与控制花萼与花瓣的形成[23]，这极可能是由于在拟南芥、矮牵牛等植物中，花萼花瓣形态完全相异，因此SEP3类基因在花萼中未检测到，但在文心兰、百合和蝴蝶兰中花萼与花瓣形态极其类似，所以，参与调控花瓣形成的SEP3基因也会于花萼中表达，这表示SEP3基因在植物花萼花瓣的形成分化中可能起着非常重要的作用。

因此，本研究中CfSEP1基因被推断为SEPALLATA3(SEP3)，SEP3与同源基因均属于E类MADS-box基因的AP1/AGL9组。

SEPMADS-box基因与A、B 和C类MADS-box基因协同调控花器官组织特性[24-26]，于被子植物花起始与花发育中起着重要作用[5,27]。本研究中，CfSEP1表达较高的组织是花萼、花瓣与唇瓣，推断CfSEP1的作用可能是与AP1和PI及其他A、B类基因共同控制蕙兰花萼花瓣的发育形成。CfSEP1于子房和蕊柱检测到的表达量少，这和拟南芥、矮牵牛等植物中SEP3类基因的表达特点相似，推断CfSEP1可能与AG等C类基因共同调控蕙兰子房与合蕊柱的发育形成。CfSEP1于蕙兰怎样发挥其复杂的功能需要进一步分析明确。