利用红外光谱测定谷子种子活力的研究

田 雪， 刘 刚， 车 前， 严伟敏， 欧全宏， 时有明

(1.云南师范大学物理与电子信息学院， 昆明 650500；2.曲靖师范学院物理与电子信息学院， 云南 曲靖 655011)

种子活力即种子的健壮度，是种子发芽和出苗率、幼苗生长的潜势、植株抗逆能力和生产潜力的总和，是种子品质的重要指标[1]。随着贮藏时间的延长会发生种子活力丧失的不可逆变化，因此认识种子老化过程中的活力变化，是确保贮藏种子保持较高活力的前提和基础[2]。老化种子劣变表现为种子变色、内部膜系统破坏、逐渐丧失产生与萌发有关的激素的能力、发芽率低、发育迟缓和抗逆力弱等特点。种子活力是衡量种子老化程度的综合指标[3]，高活力种子具有产量高、抗性强等特点。因此，研究种子老化、种子活力对农业生产有重要意义。

测定种子活力及品质的传统方法主要依据气味、颜色、形状和表面纹理[4]等属性进行辨别，存在一定的主观性。其余方法包括标准发芽试验、酶活性测定等化学方法、气相色谱法、机器视觉技术、近红外光谱技术、高光谱成像技术和电子鼻探测技术[4-10]等。但是这些方法在应用过程中都存在一定的缺点，如化学检测方法耗时且具有破坏性；气相色谱法操作繁琐且成本高；机器视觉技术对测量环境要求高、计算量大且检测正确率低；近红外光谱技术易受其他环境因素干扰且建模工作量大；高光谱成像技术分析处理过程中数据冗余量大，繁琐且模型构建复杂；电子鼻探测技术需重复建模且工作量大[11]。因此，建立简便、有效的种子活力检测方法非常必要。

FT-IR通过光与物质的相互作用，反映出物质的分子官能团振动信息，依据分子振动揭示样品的结构成分，具有快速、简便和低成本的特点，已应用于大豆、水稻、玉米和小麦等[12-14]农作物种子的检测，但现阶段对老化后谷子种子活力的相关研究鲜见报道。由于种子自然老化所需时间较长，为了缩短老化时间、提高效率，采用人工老化处理，模拟老化后种子的生命状态。本研究以龙山小米种子(济谷25号和济谷1165号)为材料，采用高温高湿法对其进行人工加速老化处理，测定其活力指标，利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)结合统计分析方法对老化处理后谷子种子的萌发能力进行初步研究，以期建立一种简便、快速研究种子活力的有效方法。

1 材料与方法

1.1 实验样品

供试谷子为2020年收获的龙山小米种子(济谷25号和济谷1165号)，购于山东省龙山贡米基地。

1.2 仪器设备

杭州绿博仪器有限公司的LH-150 S型人工老化箱，邦西仪器科技上海有限公司的GZX-350 B型光照培养箱。美国Perkin Elmer公司的Frontier型傅里叶变换红外光谱仪，配备DTGS探测器，动态光谱使用的温度控制仪型号为Eurotherm公司的SYD-TC-01型温控仪，压片使用YP-2压片机。

1.3 谷子种子老化处理的设置

设置高温(41 ℃)、高湿(相对湿度95%)的环境对谷子种子进行人工老化处理，处理时间分别为0、2、4、6、8、10 d，以0 d(未经老化处理)为对照(ck)，然后按照所需处理时间取出处理种子，并置于真空干燥箱45 ℃条件干燥12 h备用。

1.4 谷子种子老化处理后的发芽试验

选取不同老化时间干燥后的种子，用3%的次氯酸钠(NaClO)进行消毒，之后用蒸馏水充分冲洗，再用滤纸吸干种子表皮的水分，均匀放入铺有2层滤纸的发芽盒内，每盒100粒，3次重复。将发芽盒放入光照培养箱内(温度设置26 ℃)，光照时长12 h，并早晚喷洒蒸馏水以保证其正常萌发，每天记录发芽数。培养7 d时完成发芽试验，并测量幼苗长度。种子干燥待测。

1.5 谷子种子活力相关特性指标的测定

发芽势(%)=(4 d发芽数/供试种子总数)×100%；

发芽率(%)=(7 d发芽数/供试种子总数)×100%；

发芽指数=∑Gt/Dt；

活力指数=S×GI；

式中：Dt为发芽日数；Gt为与Dt对应的发芽数；S为幼苗生长量(长度)；GI为发芽指数。

1.6 光谱测量与数据处理

利用溴化钾(KBr)压片法进行红外光谱检测，样品与KBr比约为1∶15。红外光谱仪实验参数设置：分辨率为4 cm-1，波数范围为4 000～400 cm-1，扫描次数为16次；动态光谱测温范围为50～120 ℃，每隔10 ℃测试一次动态红外光谱，升温速率每分钟升温2 ℃。

采用OMNIC 8.2软件对实验所得原始光谱数据进行基线校正、5点平滑、平均谱图、纵坐标归一化和导数谱图等预处理；运用Origin 9软件对光谱数据处理、绘图，以及利用其Peak Analyzer功能进行曲线拟合分析；利用Spectrum 10.03软件对动态光谱数据进行基线修正处理，采用清华大学分析中心开发的TD 4.2软件对动态光谱进行二维相关红外光谱处理分析；用The Unscrambler X 10.4软件以原始光谱数据进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 人工老化处理对谷子种子活力指标的影响

由表1可以看出，2个品种谷子种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均呈先升后降的趋势，这可能是由于短期的高温高湿处理打破了贮藏种子的休眠期，获得了更为有利的萌发条件，提高了种子活力；而随老化时间延长，种子有毒有害物质累积以及内部保护酶活性减弱，导致种子加速劣变，说明在老化过程中，可能同时存在休眠解除和老化劣变两种相反作用力，它们共同决定了种子活力的变化[15]。短期(2～4 d)老化处理可提高2个品种种子的各项活力指标，在老化处理2 d时达到最高，但随老化时间的增加，均有不同程度的降低，其中活力指数变化幅度明显大于其他活力指标，说明活力指数对种子老化反应更敏感，能更好地反映种子活力变化[16]。济谷1165号种子活力下降速率明显低于济谷25号，说明不同品种的谷子种子抗老化能力存在差异，济谷1165号种子抗老化能力更强。

表1 人工老化处理对谷子种子活力指标的影响

2.2 谷子种子的原始红外光谱分析

济谷25号和济谷1165号种子在不同老化时间处理后萌发的原始红外光谱如图1所示，图中各光谱均为10个样本光谱的平均谱图。可以看出，不同老化时间处理的这2个品种种子的原始红外光谱整体相似。表2列出了光谱的主要吸收峰及其归属，反映谷子种子的主要成分为淀粉、蛋白质和脂质。图2为两种谷子种子在老化处理后萌发种子的几个特征吸收峰强度比，各峰强比均来自10个样本光谱的平均谱图。可以看出，两种谷子种子A858/A1 022和A1 653/A1 022的比值均随老化时间的增加而增加，表明其淀粉和蛋白质的相对含量随老化时间的增加而发生变化；A1 082/A1 022和A1 745/A1 022的比值均随老化时间的增加而减小，表明其淀粉和脂肪的相对含量随老化时间的增加而变化。

表2 谷子种子的主要特征峰及归属

2.3 谷子种子的二阶导数红外光谱分析

二阶导数光谱可提高原始光谱分辨率，能够显示更多的信息，对两种谷子种子样品在光谱范围1 800～800 cm-1进行二阶导数处理，如图3所示。可以看出，济谷25号和济谷1165号谷子种子在多糖区域(1 200～950 cm-1范围)均出现7个峰，随着老化时间的增加，1 053 cm-1和960 cm-1附近的吸收峰强度逐渐增强，1 126cm-1和1 020 cm-1附近的吸收峰强度逐渐减弱，且1 020 cm-1和1 158 cm-1处的峰向较低波数移动，1 080 cm-1处的峰向较高波数移动，表明不同老化时间处理的萌发种子的多糖结构和含量可能发生了变化。1 800～1 600 cm-1区域主要是酰胺Ⅰ带C=O伸缩振动和饱和脂肪酸酯C=O伸缩振动的贡献，由该区域的二阶导数光谱观察到两种谷子种子随着老化时间的增加，1 662、1 633、1 604 cm-1附近的吸收峰强度逐渐减弱，且1 743 cm-1处的峰向较高波数蓝移，表明不同老化时间处理的萌发种子的蛋白质和脂肪结构和含量可能发生了变化。

2.4 谷子种子的二维红外光谱分析

二维相关红外光谱能获取微弱和重叠的特征光谱信息，进一步提高了红外谱图的分辨率[20]。以温度作为外界微扰，得到样品的二维相关红外光谱.从二维相关光谱图中可以看出，不同老化时间的2个品种萌发种子在1 340～820 cm-1(图4)、1 800～1 350 cm-1(图5)范围内自动峰的数目、强度和位置在老化过程中均存在明显的差异。

图4为不同老化时间处理后2个品种的萌发种子在1 340～820 cm-1范围的二维相关红外光谱，这个范围主要为多糖振动区[20]，其自动峰的情况如表3所示。可以看出，济谷25号种子(图4 a)随老化时间的增加，所有自动峰强度呈逐渐减弱的趋势，其中979 cm-1处峰强先增强后减弱，而1 070 cm-1处峰强先减弱后增强，849 cm-1处自动峰在老化处理2 d后出现，同时1 269 cm-1和1 289 cm-1处自动峰分别在老化8 d和4 d后消失，但出现了1 279 cm-1和1 314 cm-1处的自动峰。济谷1165号种子(图4 b)随老化时间的增加，所有自动峰强度呈先增强后减弱的趋势，同时最弱自动峰向低波数移动，次强峰向高波数移动，978 cm-1处峰强先增强后减弱，1 070 cm-1处峰强先减弱后增强，1 291 cm-1处自动峰在老化6 d后消失，但在老化2 d后出现了1 049 cm-1附近自动峰。结果显示，不同老化时间处理后2个品种的萌发种子最强自动峰的位置在老化2～4 d时从1 070 cm-1附近移动到979 cm-1附近，但随着老化时间的增加，又移动到1 070 cm-1附近，这些变化可能与这2个品种的谷子种子在老化过程中糖类物质的动员有关。

表3 不同老化时间的萌发种子1 340～820 cm-1范围内二维相关红外光谱的自动峰

图5为不同老化时间处理后2个品种的萌发种子在1 800～1 350 cm-1范围的二维相关红外光谱，这个范围为蛋白质、多糖和脂类振动区[20]，其自动峰的情况如表4所示。可以看出，济谷25号种子(图5 a)随老化时间的增加，所有自动峰强度呈现逐渐减弱的趋势，其中最强自动峰由1 639 cm-1处移动到1 641 cm-1处最后移动到1 639 cm-1附近，1 509 cm-1处自动峰在老化8 d后消失，同时在老化10 d后出现1 788 cm-1处自动峰，1 729、1 710 cm-1和1 529 cm-1处自动峰在老化4 d后出现，但老化6 d后消失。济谷1165号种子(图5 b)随老化时间的增加，所有自动峰强度呈现先增强后减弱的趋势，同时最弱自动峰向高波数移动，次强峰向低波数移动，最强自动峰由1 639 cm-1附近变为1 648 cm-1附近，最后变为1 639 cm-1附近，1 758 cm-1和1 397 cm-1处自动峰在老化2～4 d后消失，但老化处理6 d后又出现。这些变化可能与这2个品种种子在老化过程中蛋白质、多糖和脂类营养物质的动员有关。

表4 不同老化时间的萌发种子1 800～1 350 cm-1范围内二维相关红外光谱的自动峰

2.5 曲线拟合分析

曲线拟合基于Lorentzian-Gaussian函数对特定波数范围的FT-IR光谱进行叠加峰分离拟合的分析方法，能简单、快速地分离出光谱中重叠的子峰，并获得子峰的面积比例，从而估算出子峰的化学成分的相对含量。当拟合结果的相关系数R2值大于0.999时，则结果有效可信[22]。淀粉是一种多糖，是谷子种子中主要存在的物质。植物可以通过光合作用把CO2和H2O转化成淀粉，贮存于器官组织中。在一定温度和酶的作用下，水解为可溶性糖(葡萄糖、麦芽糖等)，为老化过程中种子的呼吸作用提供能量[23]，且一般认为可溶性糖的含量随老化时间的延长而升高，与种子活力呈负相关[24]。因此选取老化处理后的济谷25号和济谷1165号萌发种子在1 200～950 cm-1(多糖区域)范围的原始红外光谱进行曲线拟合分析，结果如图6所示。同时，计算多糖特征峰(1 022、1 046 cm-1和1 157 cm-1)的峰面积所占的百分比(表5)，分析其多糖含量的变化趋势和特点。

表5 不同老化时间的萌发种子特征峰峰面积的相对面积比

2.6 主成分分析

主成分分析(PCA)是将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法。选取济谷25号和济谷1165号谷子种子在1 800～800 cm-1范围的红外光谱进行主成分分析，得到主成分得分图与主要成分(PC-1、PC-2)载荷图，如图7所示。济谷25号萌发种子(图7 a1)中PC-1占总方差贡献率的78%，PC-2占总方差贡献率的16%，2个主成分累积贡献率达94%；老化的济谷1165号萌发种子(图7 b1)中PC-1占总方差贡献率的90%，PC-2占总方差贡献率的6%，2个主成分累积贡献率达96%。可以看出，6种不同老化时间的2个品种种子分别聚合在6个不同的区域，并且老化0～4 d和老化6～10 d的分别各自聚在一起，与人工老化处理对活力指标的影响结果相一致，即短期老化处理(2～4 d)可以提高种子活力，老化6 d后种子活力明显下降。同时，通过图7 a2、图7 a3、图7 b2和图7 b3的载荷图，可以看出分别在1 066、1 602 cm-1和1 734 cm-1附近，979 cm-1和1 632 cm-1附近，1 066 cm-1和1 086 cm-1附近，977 cm-1和1 748 cm-1附近出现较强的吸收峰，主要对应淀粉、蛋白质和饱和脂肪酸的伸缩振动吸收峰。由此推断老化种子中脂肪、蛋白质和糖类物质含量的差异是主成分判别的主要依据，同时在区分种子的不同老化时间中为主要贡献因子。

3 结 论

采用高温高湿法对种子进行人工老化处理，将傅里叶变换红外光谱与统计分析方法相结合，分析研究济谷25号和济谷1165号谷子种子在不同老化时间处理后的萌发种子活力变化规律及贮藏物质的情况。结果显示，种子活力在老化过程中呈先增强后减弱的趋势，短期(2～4 d)老化处理可以提高种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数，但随老化时间的延长，都有所下降，其中济谷25号种子活力下降趋势明显，说明在同样的老化条件下，不同谷子品种的抗老化能力存在一定差异，济谷1165号谷子种子的抗劣变能力和贮藏性较好。红外光谱显示，谷子种子主要由淀粉、蛋白质脂质和组成，吸收峰强度比A858/A1 022和A1 653/A1 022的比值均随老化时间的增加而增加，A1 082/A1 022和A1 745/A1 022的比值均随老化时间的增加而减小，说明蛋白质、淀粉和脂肪的相对含量随老化时间的增加而变化。在1 800～800 cm-1范围的二阶导数红外光谱显示，不同老化时间处理的萌发种子随老化时间的增加，在1 662、1 633、1 604、1 126、1 053、1 020、960 cm-1处的峰强存在明显差异，1 743、1 158、1 080、1 020 cm-1处的峰位发生变化，表明其多糖、脂肪和蛋白质结构及含量可能发生变化。不同老化时间处理的萌发种子在1 340～820 cm-1和1 800～1 350 cm-1范围的二维相关红外光谱自动峰数目、最强自动峰和弱自动峰的位置、强度随老化时间的增加均发生明显变化，这些变化可能与种子在老化过程中糖类、蛋白质和脂类营养物质的动员有关。通过对1 200～950 cm-1范围进行曲线拟合分析并计算相应的特征峰峰面积百分比，结果显示多糖相对含量随老化时间的延长总体上呈现增加趋势。经不同老化时间处理的萌发种子在1 800～800 cm-1范围的主成分分析结果显示，脂肪、蛋白质和糖类物质含量的差异是主成分判别的主要依据，老化0～4 d和老化6～10 d的样品数据聚在两侧且分别各自聚在一起，与人工老化处理对活力指标的影响结果相一致，可以识别不同老化时间的谷子种子。研究表明，红外光谱结合统计分析方法是研究老化种子活力的一种快速、简便的有效方法。