抗根肿病青麻叶近等基因系的高效选育技术体系研究

张 红， 黄志银， 李 梅， 范伟强， 华德平， 王超楠

(1.天津科润蔬菜研究所/蔬菜种质创新国家重点实验室/天津市蔬菜遗传育种企业重点实验室， 天津 300381；2.天津大学生命科学学院， 天津 300354)

青麻叶大白菜(BrassicacampestrisL. ssp. pekinensis)是天津地区的特色种质资源，它对不良的气候和土壤条件具有较强的适应能力，耐冬季储运，加之外形直顺，口感佳，一直是京津地区人民餐桌上不可缺少的蔬菜之一。近年来，由于青麻叶等大白菜栽培效益好，复种指数高，市场范围逐渐扩大，但一种世界性土传病害根肿病的发生严重限制了青麻叶大白菜的安全生产。根肿病由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)引起，主要危害大白菜等十字花科蔬菜，据统计，我国有20多个省、市、自治区都存在十字花科作物根肿病发病的情况，且发病面积不断增加，有1/3以上的十字花科作物种植区受到根肿病的侵染，其中西南地区和中部地区最为严重[1-3]。但试验证明，青麻叶大白菜中缺乏对根肿病的抗性[4]，在云南、湖北等病害高发地区青麻叶的栽培极易受到损害[5-7]。因此，随着我国根肿病发病区域越来越广、病情越来越严重，亟需选育出抗根肿病的青麻叶大白菜。

传统的抗病育种手段仅依靠田间表型和育种经验，不但会受到主观意识的影响，而且由于存在连锁累赘，当与目标性状紧密连锁的遗传物质通过表型无法表现出来时，将降低筛选的效率，此外，传统田间育种周期长，工作量大，费时费力费地，弊端明显。随着分子生物学的快速发展，分子标记辅助育种技术(Marker Assisted Selection，MAS)相较于传统的经验育种，大大缩短了新品种的选育周期，既降低了选育过程中的工作量，也能从基因水平上确保筛选的准确性。分子标记辅助育种技术也逐渐被国内外育种家广泛应用于小麦、玉米、白菜等作物中[8-12]，但针对天津特色种质资源青麻叶大白菜的抗根肿病育种研究尚存在空白，加之国内外学者对分子标记辅助育种的研究多专注于标记的挖掘及开发，针对筛选效率的研究相对缺乏。本研究旨在通过探究影响筛选效率的几个重要因素，提高选育效率，以期构建一套快速高效的抗根肿病青麻叶近等基因系体系，不仅有助于快速选育出性状优良、抗性佳的种质资源，同时对提升天津市大白菜分子育种水平具有重要研究意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试材来源：G 57含有根肿病抗性基因CRb，被作为供体亲本材料；H 227是具有优良性状的青麻叶大白菜，但缺乏根肿病抗性基因，被作为轮回亲本。两试验材料均由天津科润蔬菜研究所大白菜课题组提供。

菌株来源：供试菌株采集自湖北长阳贺家坪的大白菜发病肿根中，该菌经Williams方法鉴定为致病性强的4号生理小种[13-15]，菌株取回后洗净干燥处理，于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1分子标记的前景选择及背景选择

前景选择：首先将G 57中开发的分子标记Bra 0235-2和Bra 19317在抗感双亲G 57和H 227中进行多态性验证，具有稳定多态性则作为前景选择，用于各回交世代筛选兼具抗病带型的单株进行回交转育。

背景选择：首先选择覆盖大白菜全基因组的分子标记[16-17]在亲本间进行多态性分析。然后从多态性标记中筛选出均匀分布于大白菜基因组的分子标记，应用于BC1F1群体及其以后世代的基因组背景分析。根据基因组背景分析，在每个世代选择轮回亲本基因组含量高的单株用于回交或自交，最后获得兼具抗根肿病和轮回亲本优良性状的近等基因系。

1.2.2供试群体数对标记筛选效率的影响

2018年秋季，在武清基地育苗棚将试材播种于72孔穴盘培养，从BC1F1代的一个群体中随机选择5,9,18,27,36株进行分子标记的筛选，每个样本量重复3次，出苗后采集叶片，确定用于各回交世代的最佳供试群体数。

1.2.3分子标记背景选择的最初世代对筛选效率的影响

试材同样播种于武清基地育苗棚，在其他条件相同的情况下，分别对BC1F1、BC2F1、BC3F1群体的入选单株进行分子标记背景选择，每个处理重复3次，对背景回复率进行分析，确定开展分子标记背景选择的最佳世代。

2019年3月，将种子播种到育苗盘中，正常管理，育苗培养30 d后，待幼苗长到5～6片真叶时取样，采集叶片2～3片保存于-40 ℃，用于DNA提取。分子试验在天津科润蔬菜研究所分子实验室开展。

1.2.4大白菜基因组DNA提取及SSR分析

DNA提取：采用改良后的碱裂法提取叶片DNA[18-20]，技术具体过程如下：

1) 取叶片放入2 mL离心管中，然后加入150 μL 0.4 mol·L-1的NaOH溶液，加入磁珠放于高速研磨机内，65 Hz，研磨75 s。

2) 取出离心管，以4 000 r·min-1，离心5 min。吸取40 μL上清液放入新的离心管。

3) 最后加入200 μL Tris-HCl，混匀备用。

采用10 μL的PCR反应体系，各成分具体含量如表1。

表2 前景选择分子标记引物序列

注：C 1、C 2、C 3是样本量为18时的3次重复试验

表1 大白菜PCR标准反应体系

PCR扩增：94 ℃预变性5 min，1个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃(根据引物合成温度调节)退火30 s；72 ℃延伸30 s，一般30～35个循环；72 ℃再延伸10 min。最后将扩增产物4 ℃保存。

以8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物的质量，然后使用快速银染法检测电泳条带多态性。胶片取出后置于灯箱上观察、照相，对条带进行统计并记录。

数据分析：根据筛选出的具有多态性SSR引物扩增结果，在相同迁移位置上，带型与轮回亲本带型相同者赋值为“0”，与供体亲本带型相同者赋值为“2”，为双亲共同的杂合带型赋值为“1”，缺失标记赋值为“—”。最后利用Excel软件对数据进行统计分析。

实际轮回亲本基因组含量(%)=(SSR标记位点纯合数/SSR标记总数)×100%；

轮回亲本基因组含量期望值=(1-1/2r+1)×100%，式中：r为回交次数。

2 结果与分析

2.1 前景标记的筛选

课题组前期开发设计的抗源材料G 57中抗根肿病基因CRb连锁的分子标记Bra 0235-2和Bra 19317，经验证在抗感双亲12 G 57和H 227间多态性表现好，可用于各世代的前景选择。

图1 两标记在双亲间的多态性验证

2.2 背景标记的筛选

在分布于大白菜基因组的680个SSR标记中[21-22]，选择均匀分布于10条染色体的140个分子标记，通过父母本间的筛选，获得稳定的多态性标记20个，可用于各世代的背景选择，序列信息见表2，上述引物均由华大基因公司合成。

2.3 不同供试群体数量对标记Bra 019317筛选效率的影响

研究结果(图2、表4)表明，在每一株系中标记筛选的样本量至少达到5株才可能筛选出含目标性状的抗病单株。但从背景回复率考虑，样本量至少达到18株的回交群体中获得轮回亲本背景恢复率高的近等基因系的几率更高。为在工作效率与中选率中寻找一个平衡点，建议后期筛选的株系样本量设定为18株。

表3 背景选择分子标记引物序列

表4 不同数量的BC1F1群体筛选抗病带型的统计结果

2.4 分子标记背景选择的最初世代对筛选效率的影响

试验从BC1F1世代起在分子标记前景选择的基础上，利用20个背景选择标记对3个回交世代群体的入选单株进行遗传背景回复率统计(表5、表6)，结果发现，经过1代回交，54个样本量的BC1F1群体的背景回复率范围为16.7%～78.0%，RPG含量最高为78.0%，高于回交1代的期望值(75.0%)，但样本间变异系数略大，变异系数为28.6%；回交2代后，BC2F1群体的背景回复率范围为38.9%～94.4%，RPG含量最高为94.4%，高于回交2代的期望值(87.5%)，且变异系数为18.4%；回交3代后，BC3F1群体的背景回复率范围为33.3%～85.2%，RPG含量最高为85.0%，低于回交3代的期望值(93.75%)，变异系数为16.5%。说明在各个回交世代中群体均存在极端个体，但在回交2代后群体间RPG差异相对更小，此时在背景选择的分子标记已获得的情况下，尽早利用背景选择筛选目标单株，可以加快恢复轮回亲本的基因组含量，节省人力、物力的投入，有效提高MAS的效率。

3 讨 论

分子标记辅助育种技术(MAS)是目前提高传统育种效率的常见手段，构建高效准确的MAS体系必须对筛选环节的各影响因素进行系统研究，例如分子标记与基因间的连锁程度，背景选择的标记数量等因素决定着MAS选择的准确性，群体的筛选数量，背景选择开始的世代等因素影响着MAS选择的效率。

分子标记辅助选择的准确性主要在于前景标记与目标基因间的连锁度，一般连锁越紧密，选择的准确率越高，需要筛选的样本量数越少，此外目标基因的连锁标记数量对筛选的准确率也产生影响。潘海军等[23]发现，针对丰富23群体，分别利用单标记RpdH 5和RpdSll 84进行分子标记辅助选择的准确率为91.0%和87.3%，但同时利用这2个标记，筛选准确率可提高到99%。此外，群体的筛选数量对MAS的选择效率也起着重要作用。群体过大，筛选的工作量增加，往往造成人力物力的损耗。群体过小，目标性状中选率则必然降低，尤其是在一些低世代群体或低遗传率的性状存在的情况下更为明显。因此本试验利用2个自主设计的连锁标记作为前景选择，在保证目标单株准确性的前提下，采用前景选择和背景相结合的方法，对不同大小的群体进行目标单株的统计分析，结果发现，筛选群体数量达5株即可获得目标单株，但群体数量至少为18株时，才能获得兼具目标基因与高RPG的单株，这与张腾等[24]的研究结论基本一致。发现通过前景选择随机选择7株即可获得含目标基因的单株，通过背景选择从20株回交群体中更易获得RPG含量高的单株。分析2个试验群体数量的细小差异可能是由于标记的连锁程度造成。

表5 同样本量下不同回交世代背景筛选的目标单株统计结果

表6 各回交群体背景回复率统计结果

针对背景选择执行世代的影响，Hospital等[25]认为，对单个或者连续多个回交世代进行目标单株筛选，背景选择执行的越晚，效率越高。但试验中发现，从回交2代起开展背景选择相对获得高RPG的目标单株概率会更高，而且群体间RPG差异更小，可能是由于低世代群体内重组个体多，变异方差大，所以目标单株中选率大，而随着世代的增加，MAS效率会逐渐降低。