玉米果种皮对其种子萌发及生理特性的影响

刘 京， 朱凯丽， 岳海旺， 李贺勤， 张海艳， 赵延明， 杨然兵， 尚书旗， 江绪文

(1.青岛农业大学玉米研究所， 山东 青岛 266109；2.河北省农林科学院旱作农业研究所， 河北 衡水 053000)

种子是最基本的农业生产资料，其萌发质量直接关系农业生产的成败。种子萌发作为一个复杂的生理过程，根据定义它始于具有生活力的干种子吸胀作用，结束于胚根突破所有覆盖层而伸出[1]。种皮作为重要种胚覆盖层之一，是由数层起源于受精引起的胚珠被分化而形成的特殊细胞所组成[2]。目前关于种皮在调控种子发育、萌发等方面已取得一些进展。Beeckman等[3]基于组织学研究发现，拟南芥种皮可能是在种胚发育阶段与种胚协调作用下形成。Buzi等[4]发现，种子发育后期许多与胁迫相关的蛋白会储存在种皮中，使种子贮藏具有抗菌能力，并在调节种子寿命、发芽和幼苗建成中发挥重要作用。此外，种皮原花青素[5]、种皮黏液[6]等在对拟南芥、乌桕等种子萌发调节中均具有重要作用。因种皮特性而导致的不透水和(或)不透氧、机械限制等是导致许多植物种子休眠、萌发受阻的重要原因[7]。Khodakovskaya等[8]对番茄种子种皮穿刺处理后发现，种皮穿刺可加速种子内部吸水，种子萌发12 d和20 d的发芽率比对照分别提高42%和11%。Duval等[9]发现，去除种皮可有效打破三倍体西瓜种子萌发障碍与种皮机械限制进而促进种子萌发，其中种子发芽率可提高70%。

玉米(ZeamaysL.)作为世界上最重要的粮饲、能源作物之一，在全球经济发展中具有重要的地位和不可替代的作用。种子质量差一直是中国玉米生产发展和产量提高的一个重要限制因素[10-11]。Li等[11]对2013—2018年中国市售玉米品种种子质量进行了调研，发现种子质量整体虽呈上升趋势，但市售玉米品种在种子活力等方面仍存在遗传缺陷，有待深入解析。马洁等[12]发现划伤果种皮后玉米种子吸水速率加快，与对照相比，中农大4号活力指数提高0.229，苗长增加0.7 cm。与其他植物相比，关于玉米果种皮对种子萌发及生理特性的影响研究甚少，包括其对果种皮破裂、胚根鞘破裂等种子萌发关键事件发生及重要种胚组织代谢调控机理等尚不清楚，非常值得深入探讨。

本试验以不同玉米品种种子为材料，围绕上述问题开展初步研究，以期为玉米种子萌发机理深入研究及高活力品种选育等提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

玉米品种为郑单958、先玉335、蠡玉16和迪卡007；参照农作物种子检验规程GB/T 3543.6-3543.7(国家技术监督局1995)[13]测得这4个品种种子千粒重分别为357.7、284.9、342.3 g和306.8 g，水分含量分别为11.7%、11.4%、11.5%和11.4%。各品种种子均为2019年收获，低温冷库中干燥贮藏。

1.2 试验方法

1.2.1果种皮特性测定

果种皮吸水特性观测：参考《种子检验学》[14]的方法，略有改动。取大小均一、健康饱满的净种子50粒，3次重复，共150粒，将种子温水(30～35 ℃)浸种4～8 h后，将其果种皮剥离收集并低温烘干至恒重，备用。50粒种子的果种皮为1个重复，3次重复，于25 ℃恒温箱内进行果种皮吸水特性测定，每隔10 min，20 min，30 min，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h，3.5 h，4 h取出试样，轻拭表面浮水，称重，计算果种皮吸水速率和最大吸水量。

果种皮厚度测定：取大小均一、健康饱满的净种子50粒，3次重复，共150粒，种子吸胀24 h后，沿中部纵切制片，用Leica DM 6 B显微镜结合配套图像分析软件对种子胚部、背部、底部的果种皮厚度进行多点(>6)观测，果种皮厚度以数据集最中部的3个数值的平均值表示。

覆胚果种皮(the testa-pericarp covering embryo, TCE)穿刺力测定：取大小均一、健康饱满的净种子50粒，3次重复，共150粒，利用自研的种子生物力学评价系统(A System for Automated Seed Biomechanical Assessment, ASASBA)进行TCE穿刺力测定，TCE穿刺力以数据集最中部的3个数值的平均值表示。穿刺力测定主要参数为：探针直径0.5 mm，移动速度30 mm·min-1，环境湿度99%，环境温度25 ℃。

1.2.2标准发芽和幼苗生长测定

参照农作物种子检验规程GB/T 3543.4(国家技术监督局1995)[13]进行卷纸发芽测定。取大小均一、健康饱满的净种子100粒，3次重复，共300粒，用1%次氯酸钠溶液消毒10 min(包衣种子清水稍加清洗后消毒)，消毒后用蒸馏水冲洗3遍，拭去种子表面浮水后，备用。以移除TCE的种子为处理(用医用手术刀在体视镜下移除TCE)，未处理的种子为对照。取2张发芽纸(380 mm×255 mm，美国Anchor)叠放好，用油性记号笔标识样品信息，蒸馏水充分润湿后用无菌纱布轻拭床面，除去余液和纸间气泡，种子交错置床，种孔朝向一致，纸边距5 cm。置床后卷起放入自封袋，垂直置于人工气候箱中(25±0.5)℃发芽(种孔端朝下，12 h光暗交替)。

逐日统计种子发芽数目，发芽4 d计算发芽势，发芽7 d计算发芽率，同时计算发芽指数和平均发芽天数。统计发芽率的同时，随机选取大小均一的10株种苗进行芽(苗)长、主根长、芽(苗)鲜重、根鲜重、芽(苗)干重和根干重等6项指标测定，其中烘干条件为105 ℃烘8 h。

1.2.3总淀粉含量、粗蛋白含量和粗脂肪含量测定

采用双波长法[15]、凯氏定氮法[16]和索氏提取法[17]分别测定样品种子的总淀粉含量、粗蛋白含量和粗脂肪含量；参照《种子学实验技术》[18]的方法进行操作，3次重复。

1.2.4破裂测定

选取2个玉米种子萌发质变事件： 1) 果种皮破裂：胚根鞘伸长生长突破果种皮； 2) 胚根鞘破裂：胚根伸长生长突破胚根鞘或胚根鞘组织弱化破裂胚根伸出。基于标准发芽(同1.2.2)，种子置床后24、36、48、60、72、84、96 h和108 h统计果种皮破裂和胚根鞘破裂种子数，计算果种皮破裂率和胚根鞘破裂率。以移除TCE的种子为处理，未处理的种子为对照。

果种皮破裂率(%)=(果种皮破裂种子数/待测种子总数)×100%；

胚根鞘破裂率(%)=(胚根鞘破裂种子数/待测种子总数)×100%；

1.2.5酶活性测定

取足够量的种子进行标准发芽(同1.2.2)，以移除TCE的种子为处理，未处理的种子为对照。萌发60 h时收集种胚(已发生胚根鞘破裂)的胚中部(胚芽与胚根衔接部)、胚根和胚根鞘3部分组织，采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(Catalase, CAT)活性[19]；采用愈创木酚法测定过氧化物酶(Peroxidase, POD)活性[18]；采用NBT光化还原法测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性[20]。不同组织分别取约0.1 g样品，6次重复，-80 ℃保存备用；酶活性以数据集最中部的3个数值的平均值表示。

1.2.6数据分析

采用Microsoft Excel 2016软件和SPSS 20.0软件对数据进行处理、相关性分析和差异显著性检验(LSD法)。

2 试验结果

2.1 不同玉米品种果种皮吸水特性比较

由图1可见，4个玉米品种果种皮吸水量均呈快速吸水至平稳的变化趋势，但不同品种果种皮最大值吸水量不同。其中郑单958果种皮具有最大吸水量，为1.02 g·(50粒)-1。

注：不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，下同。

2.2 不同玉米品种果种皮厚度及覆胚果种皮生物力学特性比较

由图2可见，4个玉米品种间以及同品种不同部位间果种皮厚度不同。从TCE厚度来看，郑单958最厚，为53.33 μm，且与其他3个品种差异显著；4个玉米品种TCE穿刺力大小不同，郑单958最大，为1.81 N，且与其他3个品种差异显著。

注：同颜色不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

2.3 玉米TCE对种子发芽及幼苗生长的影响

由表1可见，移除TCE能促进玉米种子发芽和幼苗生长，但对不同品种影响程度不同。从各项发芽指标来看，处理后郑单958、先玉335和蠡玉16的发芽势和发芽率与对照相比均有所提高；处理后各品种平均发芽天数均显著缩短，发芽指数也明显高于对照且差异显著，其中先玉335提高了58.10%。从各项幼苗生长指标来看，处理后各品种芽(苗)长、主根长、芽(苗)鲜重、根鲜重、根干重均明显高于对照且差异显著。

表1 TCE对4个玉米品种种子发芽的影响

2.4 玉米TCE指标与其他性状指标的相关分析

由表2可见，TCE穿刺力与TCE厚度极显著正相关。TCE穿刺力和TCE厚度2项指标与平均发芽天数均呈正相关，与芽(苗)长、主根长、芽(苗)鲜重、芽(苗)干重、根鲜重、根干重和种子粗脂肪含量均呈负相关，与种子总淀粉含量呈正相关，与种子粗蛋白含量分别呈正相关和负相关。

表2 4个玉米品种TCE指标与其他性状指标的相关分析

2.5 玉米TCE对种子萌发事件发生速率的影响

果种皮破裂和胚根鞘破裂是两个重要的玉米种子萌发事件[21]。由图3可见，4个玉米品种果种皮破裂率均呈先增加后降低的变化趋势，而胚根鞘破裂率和(果种皮破裂+胚根鞘破裂)率2项指标均呈快速增加至平稳的变化趋势。与对照相比，移除TCE后4个玉米品种胚根鞘破裂率指标变化速率均明显上升，如：种子萌发60 h时，移除TCE后4个玉米品种胚根鞘破裂率均明显高于对照，其中郑单958提高了22.59%(图3 B和图3 D)。

注：A为对照果种皮破裂率变化趋势图；B为对照胚根鞘破裂率变化趋势图；C为对照(果种皮破裂+胚根鞘破裂)率变化趋势图；D为处理胚根鞘破裂率变化趋势图。

2.6 玉米TCE对种子萌发不同胚组织酶活性的影响

由图4可见，种子萌发60 h，4个玉米品种胚中部、胚根和胚根鞘3部分组织中CAT、POD、SOD活性大小不同。从整体数据来看，CAT活性大小为胚根>胚根鞘>胚中部；POD活性大小为胚中部>胚根鞘、胚根>胚根鞘，但在胚中部和胚根之间的规律不明显；SOD活性大小为胚中部>胚根鞘>胚根。移除TCE处理后，除郑单958胚中部组织SOD活性与对照相比略有下降但差异不显著外，其余品种处理后各组织3种酶活性均高于对照。

注：A、B和C分别为胚中部、胚根、胚根鞘组织CAT活性测定结果；D、E和F分别为胚中部、胚根、胚根鞘组织POD活性测定结果；G、H和I分别为胚中部、胚根、胚根鞘组织SOD活性测定结果。

3 讨 论

种皮作为种子重要覆盖层，在种子发育、萌发等过程中发挥重要作用，包括为种胚发育提供营养，保护种胚免受不利环境影响等[22]。玉米种子萌发伴随着果种皮破裂、胚根鞘破裂等重要萌发事件的发生，主要表现为胚根鞘伸长生长克服覆胚果种皮(the testa-pericarp covering embryo, TCE)机械限制以协助胚根伸出等方面[21]。特别是种子萌发中胚根伸出快慢可有效评价种子活力高低[23]，但目前关于果种皮特别是TCE对玉米种子萌发及生理特性的影响研究甚少，故本研究以郑单958、先玉335、迪卡007和蠡玉16等4个玉米品种为材料，开展了以下相关工作。

3.1 不同玉米品种果种皮吸水特性及厚度比较

种子萌发吸胀速率与种被和内含物致密度等有关[24]。不同植物种子吸水特性不同，王俊绢等[25]认为，棉花种子的吸水率与种子活力存在显著负相关；山金凤等[26]发现，皇后帝王花种皮结构对种胚吸水无阻碍，但可能对种胚呼吸、胚根伸长存在影响等。在玉米方面，李文端等[27]指出不同类群玉米自交系间种子吸水速率无显著差异，但在吸水时间上存在显著差异；马洁等[12]认为，不同玉米品种吸水速率和活力水平不同，且与种子活力无明显相关性。本研究发现，4个玉米品种果种皮吸水量随萌发时间推移均呈快速增加至平稳的变化趋势，其中郑单958果种皮吸水量最大，果种皮吸水特性差异可能会影响玉米种子萌发速率。此外，在种皮厚度方面，目前主要涉及其与种子硬实等相关的研究报道[26]。本研究发现，4个玉米品种不同种子部位的果种皮厚度不同，其中郑单958的TCE厚度最厚。

3.2 玉米TCE生物力特性对种子萌发的影响

从生物力学角度来看，种子由种胚和外围组织层组成。种子萌发时，种胚感受外部环境信号激发自身组织伸长生长，而外围组织层可能在种胚萌发活力水平恢复提升至阈值中扮演重要角色，只有当种胚活力水平超过一定阈值时胚根才能顺利伸出完成萌发[21,28]，故一些报道基于力学测量对胚乳等组织强度进行分析，以研究种子萌发休眠机理。Müller等[29]利用自研装备结合直径0.3 mm的金属探针，推进速度2 mm·min-1成功检测独行菜种子萌发中胚乳的穿刺力大小。Holloway等[30]基于胚根鞘组织穿刺力测定阐述了小麦种子休眠和萌发新机制。本研究对4个玉米品种种子TCE进行穿刺力测定以评价其机械强度，发现郑单958最大，这可能与其厚度及果种皮内所含物质有关；相关性分析表明，TCE穿刺力与TCE厚度极显著正相关。与对照相比，移除TCE处理后，4个玉米品种种子的发芽势、发芽率、发芽指数均有所提高，且平均发芽天数明显缩短，种子萌发胚根鞘破裂率指标变化速率明显上升，且TCE越薄则其对种子萌发机械阻力越小，发芽速率更快。上述相关结论与马洁等发现划伤玉米果种皮处理可加快种子吸水速率[12]，进而显著提高种子的活力指数、幼苗长度等指标测定值的结论一致。此外，邢妍妍等[31]对不同生育期新鲜玉米种子和移除果种皮后种子的发芽情况进行比较分析，发现种子发育初期移除果种皮可提高种子发芽率，但种子萌发后生长缓慢，而本研究采用发育成熟的玉米种子，移除TCE不仅可提高种子发芽率而且一定程度上促进了种苗形态建成。

3.3 玉米TCE对种子萌发不同种胚组织酶活性的影响

种子萌发伴随着各种生理、生化和分子生物学变化以及相关形态特征的变化。胚根鞘作为禾本科植物种子特有器官，在玉米种子萌发中伸长生长与TCE发生生物力作用，以协助胚根伸出完成萌发[21]。研究TCE对玉米种子萌发不同种胚组织(包括胚中部、胚根、胚根鞘等)酶活性的影响对深入解析种子萌发机理非常重要。目前已有不少关于种子萌发酶活性变化的研究报道，Scheler等[32]研究发现，独行菜种子细胞壁果胶甲基化与果胶甲基酯酶(PME)基因的特异表达和胚乳、胚根、下胚轴中相关酶活性有关，PME处理可提高种皮透性，促进种皮破裂。本研究比较了4个玉米品种移除TCE处理的种子和未处理的种子在萌发60 h时，胚中部、胚根、胚根鞘组织CAT、POD、SOD活性变化情况，结果表明处理后各品种胚中部、胚根和胚根鞘组织CAT、POD、SOD活性基本呈上升趋势；此外，不同种胚组织内酶活性大小也存在一些规律，如：CAT活性大小为胚根>胚根鞘>胚中部，SOD活性大小为胚中部>胚根鞘>胚根。

本研究初步探讨了果种皮特别是TCE对4个玉米品种种子萌发及生理特性的影响，并得到了一些重要结论，但在TCE与胚根鞘生物力作用机理、不同种胚组织间SOD等关键酶的活性大小差异产生机理、TCE对种胚组织内源激素含量的影响以及对相关重要基因功能调控机制等方面还有待深入研究。