Ca2+胁迫下白及种子萌发及原球茎发育过程微形态学观察

孔 娇， 杨丽丽， 韩 雪， 常凡群， 牛敏敏， 吴明开， 夏 与， 唐传照

(1.贵州大学生命科学学院， 贵阳 550025； 2.贵州省农业科学院现代中药材研究所， 贵阳 550006；3.安龙县欣蔓生物科技有限责任公司， 贵州 安龙 552400；4.贵州惠稀生物科技有限公司， 贵州 三穗 556500)

白及[Bletillastriata(Thund.)Reichb.f.]为兰科(Orchidaceae)白及属多年生草本植物，又名良姜、紫兰、甘根等。在我国主要分布于陕西、甘肃、广西、福建、四川、浙江、广东、云南及贵州等省，在朝鲜半岛和日本也有分布[1]，最适宜区为贵州省安龙县、兴义市[2]。白及以干燥块茎入药，具收敛止血、消肿生肌之功效，治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等症[3]。近年来，白及遭到掠夺式采挖，生境和赖以生存的气候环境日益恶化，野生资源濒临灭绝[4]。贵州自古就是白及道地产区，品质、疗效优良，白及种子细小如尘，发育不完全，仅具尚未分化的原胚，在自然条件下很难萌发。贵州喀斯特山区土层浅薄、生态环境脆弱，碳酸盐岩溶蚀是喀斯特山区主要成土方式[5]。碳酸盐土壤中富含丰富的钙(Ca2+)。土壤的钙含量可达1%～3%，是同纬度硅酸盐地区土壤的2～3倍[6]。Ca2+是植物体生长发育必需的矿质营养元素，参与组成细胞壁及细胞膜的结构等[7]。尽管在喀斯特地区土壤中Ca2+含量很高，但可利用性很低，而Ca2+在植物体内较难移动，导致植物各个器官缺钙成为一个普遍性问题[8]。

因此，以植物组织培养为基础，对Ca2+胁迫下白及种子萌发及原球茎发育过程的微形态学进行观察，探讨Ca2+胁迫下白及种子无菌萌发特性与适宜的培养条件，以期为白及种子萌发与幼苗建成提供形态学资料，以获得白及快速繁殖机制。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

1.1.1材 料

试验材料选用成熟的白及蒴果，采自贵州省农业科学院中药材资源圃。

1.1.2仪 器

MLS-3750日本三洋(SANYO)全自动高压蒸汽灭菌器(上海道萨生物科技发展有限公司)；SW-CJ-1G单人净化工作台(苏州净化设备有限公司)；BX 43生物显微镜(奥林巴斯中国有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1果实预处理

将未开裂的白及蒴果用流动的无菌水洗净，在超净工作台上分别用0.1% HgCl2溶液表面消毒1 min，75%乙醇溶液消毒3 min。然后用已灭菌的剪刀纵向剪开蒴果，用镊子夹取粉末状种子，均匀地抖落在培养基表面。

1.2.2培养基制备

以1/2 MS为基本培养基，添加3%蔗糖、7%琼脂、0.2 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-16-BA，对大量元素中Ca2+进行梯度处理，分别为0倍Ca2+(0 g·L-1)、1倍Ca2+(1.65 g·L-1)、1.5倍Ca2+(2.47 g·L-1)、2倍Ca2+(3.3 g·L-1)、2.5倍Ca2+(4.12 g·L-1)、3倍Ca2+(4.95 g·L-1)。培养基配置后于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min备用。

1.2.3培养条件

温度为(24±1)℃，光照时间12 h·d-1，光照强度2 000 lx左右。

1.2.4结果观察统计

对接种的种子每隔10 d取样一次，观察种子萌发及原球茎发育过程特征。体式显微镜(OLYMPUS BX 43)和数码相机(OLYMPUS DP 22)拍照记录实验结果。统计种子的有效萌发数及原球茎直径，结果采用 Microsoft Excel 2010、GraphPad Prism 8软件进行数据整理和绘图。

2 结果与分析

2.1 Ca2+胁迫下白及种子萌发

白及蒴果成熟后，两端呈稍尖的类圆柱体形，蒴果内部包含数万粒细如尘埃的种子(图1 A)。成熟种子呈橄榄型、粉末状，由种皮和胚组成，不含胚乳[9](图1 B)。将白及种子均匀散播于不同Ca2+浓度胁迫的培养基中，5 d后种子均吸水膨胀，颜色变浅，无明显差别(图2 A～F)；接种10 d后种子绝大部分变为绿色，顶端和中心位细胞突起，分化出叶原基(图3 A～F)，其中2.47 g·L-1Ca2+胁迫处理下，白及种子率先撑破种皮(图3 C)；20 d后种子均突破种皮，除0 g·L-1Ca2+胁迫处理下的种子未分化出幼叶外，其他种子均由叶原基分化出第一片幼叶(图4 A～F)，其中3.3 g·L-1Ca2+胁迫处理下的种子叶片长势最优(图4 D)；30 d后0 g·L-1Ca2+胁迫处理的种子分化出一片幼叶，其他种子均分化出两片幼叶(图5 A～F)，2.47 g·L-1Ca2+胁迫和3.3 g·L-1Ca2+胁迫处理下的种子幼叶长势较好。

注：A为白及蒴果与种子；B为白及种子的形态结构(4×10)。图1 白及蒴果与种子Fig.1 Capsule and seed of B. striata

注：A为0 g·L-1 Ca2+胁迫;B为1.65 g·L-1 Ca2+胁迫；C为2.47 g·L-1 Ca2+胁迫；D为3.3 g·L-1 Ca2+胁迫；E为4.12 g·L-1 Ca2+胁迫；F为4.95 g·L-1 Ca2+胁迫。下同。图2 5 d时白及种子萌发的形态结构(4×10)Fig.2 Morphological structure of seed germination of B. striata at 5 d (4×10)

图3 10 d时白及种子萌发的形态结构(4×10)Fig.3 Morphological structure of seed germination of B. striata at 10 d (4×10)

图4 20 d时白及种子萌发的形态结构(4×10)Fig.4 Morphological structure of seed germination of B. striata at 20 d (4×10)

图5 30 d时白及种子萌发的形态结构(4×10)Fig.5 Morphological structure of seed germination of B. striata at 30 d (4×10)

2.2 Ca2+胁迫下原球茎形态学观察

白及种子10 d后开始萌发，形成淡绿色近棒状体和近球体的原球茎，各培养基无明显差异；在20 d后，基部逐渐膨大，颜色逐渐加深，脱落种皮，原球茎分化明显，原球茎呈近棒状体和近球体；30 d后原球茎直径达到1 mm左右，基部长出大量毛状根，根部大量吸收养分以满足植株迅速发育(图6)。不同Ca2+胁迫下的培养基在30 d内原球茎都能分化，形成毛状根，但生长速度不同。

2.3 不同Ca2+胁迫对白及种子萌发率的影响

在培养15 d后，采用苏莹等[10]的观察统计法，统计不同Ca2+胁迫对白及种子萌发率的影响。由图7可知，Ca2+浓度为2.47 g·L-1时萌发率最高，其次是1.65 g·L-1和0 g·L-1，当Ca2+浓度超过2.47 g·L-1时，则会抑制白及种子的萌发。

注：A为原球茎基部长出毛状根(→)；B为近棒状体的原球茎(→)。图6 白及原球茎的形态结构(4×10)Fig.6 Morphological structure of B. striata procorm (4×10)

图7 不同浓度Ca2+胁迫对白及种子萌发率的影响Fig.7 Effects of different concentrations of Ca2+ stress on the germination rate of B. striata seeds

2.4 不同Ca2+胁迫对原球茎直径的影响

白及种子吸水膨大，30 d后形成绿色近棒状体和近球体的原球茎。从图8可知，在30 d后，有Ca2+和无Ca2+参与下，差异较明显，0 g·L-1对原球茎直径影响不大，而4.95 g·L-1则能明显的促进白及原球茎直径。

图8 不同浓度Ca2+胁迫对原球茎直径的影响Fig.8 Effects of different concentrations of Ca2+ stress on the diameter of procorm

3 结论与讨论

在白及种子的萌发过程中，添加不同浓度的外源Ca2+，当Ca2+达到2.47 g·L-1时，对白及种子的萌发与生长有一定的促进作用，而高浓度的Ca2+则对其有一定的阻碍和抑制作用；然而在白及种子原球茎的生长发育过程中，在有Ca2+和无Ca2+参与下，差异较明显，0 g·L-1Ca2+对原球茎直径影响不大，而4.95 g·L-1Ca2+则能明显的促进白及原球茎直径。

Ca2+是植物生长发育的必须元素之一，Ca2+在细胞分裂、极性形成、生长、分化、凋亡等过程中均有重要的调节功能。Ca2+还是植物细胞壁的重要组成成分，是液泡内重要的渗透保护物质，具有维持细胞内离子平衡并保持细胞膜稳定等功能[11]。植物细胞体内存在一套完整严密的调节体系，当外源Ca2+过高会引起细胞的反馈调节，过低则不能满足正常生理需要[12]。适当加入一定浓度的外源Ca2+，能够降低细胞膜渗透率，增加可溶性糖的积累及减缓叶绿素降解等，是细胞内多种酶的活化剂[13]。作为第二信使，Ca2+与受体蛋白如钙调蛋白(CaM)、类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBL)、钙离子结合蛋白激酶(CDPK)等结合，参与了植物对内环境(发育)和外环境的感知和传导[14]。而且还能稳定的直接参与植物抵抗低温、高温、干旱和盐胁迫等逆境[15]。有研究表明，在植物细胞的液泡中存在着大量的Ca2+库，除了植物自身释放Ca2+外，适当的加入一定浓度的Ca2+，能够调高亚麻种子的发芽率和幼苗抗旱性[16]。本研究也发现，加入适当的外源Ca2+能有效调节白及种子的萌发率，因浓度不同，则表现不同，当浓度达到2.47 g·L-1时，能够促进白及种子的萌发，当大于2.47 g·L-1时，则会抑制其萌发，而Ca2+是如何促进白及种子萌发的，这个机制还需要进一步研究和探讨；然而，在原球茎的生长过程中，当Ca2+浓度达到4.95 g·L-1时，对白及的原球茎直径有明显的促进作用。