再生水灌溉对5种常见草坪草种子萌发的影响及作用机理

朱 敏， 隋 燕

(1.内蒙古机电职业技术学院， 呼和浩特 010070；2.山东农业工程学院艺术学院， 济南 250100)

近年来，随着我国城市化进程的加快，城市淡水资源需求量日益增加，水资源日益短缺，供需矛盾日趋突出，增辟新型水资源已成为当前缓解淡水资源供需矛盾的关键措施之一[1-2]。城市用水主要包括生活用水、生产用水和绿地灌溉用水等。城市绿地是城市生态系统的重要组成部分，在提高城市环境质量和丰富市民精神生活方面发挥着重要作用[3-4]。为了不断提高市民生活品质，城市绿地面积逐年加大，增加了城市淡水需求量，加剧淡水资源供需矛盾[5]。因此，科学高效缓解城市淡水资源供需矛盾、增辟新型水资源已成为当前亟待解决的关键问题之一，对维持城市生态环境可持续发展具有重要意义。

再生水是指生活污水、工业污水等经污水处理厂多级处理后的水资源的总称，其成本远低于海水淡化和异地调水，是一种具有较大应用前景的潜在灌溉水资源[6]。利用再生水资源进行城市绿地灌溉，一方面可避免直接用污水灌溉而导致的土壤生态环境污染，另一方面可以极大缓解用水窘境；同时，再生水富含植物生长所必须的N、P、K等营养元素，合理灌溉可明显提高土壤肥力、促进植物生长[7]。此外，再生水含有一定的有毒化学物质和病原体，不合理灌溉可能造成土壤环境污染，可能危害环境和人体健康[8]。前人围绕再生水灌溉进行了大量研究，李翔等[9]研究表明，利用再生水和自来水进行混合灌溉，可提高草坪草叶绿素含量，而对草坪草和土壤环境未造成显著伤害，可作为优质灌溉水资源进行利用；杨嫦丽等[10]研究表明，再生水灌溉可促进大部分绿地植物的生长发育，造成小部分植物电导率升高但均未达到危害程度；李竞等[11]研究表明，利用再生水进行灌溉可显著促进绿化植物生长，提高根际土壤养分含量、酶活性和微生物数量，同时，土壤盐分含量显著提升但未对植物表观造成明显影响；李河等[12]研究表明，自来水-再生水交替灌溉对草坪草生长具有明显的促进作用，而且不会对草坪草和草坪土壤产生危害。种子萌发是植物生命周期的开始，其萌发优劣直接影响植物后期生长发育[13]。然而，目前关于再生水灌溉对草坪草种子萌发及作用机理方面的研究尚未见相关报道。

因此，本研究以5种草坪草种子为研究对象，分析了不同浓度再生水对草坪草种子萌发的影响，并从抗氧化能力和激素含量变化角度对其作用机理进行初步解析，以期为再生水更好地应用于城市草坪绿地灌溉提供一定的参考和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用草坪草种类5种，分别为结缕草(ZoysiajaponicaSteud)、高羊茅(FestucaelataKeng ex E. Alexeev)、黑麦草(LoliumperenneL.)、狗牙根(Cynodondactylon(L.) Pers.)和早熟禾(PoaannuaL.)，种子均购自济南益丰农业科技发展有限公司。试验用再生水取自光大水务(济南)有限公司，清水源自实验室自来水，2类试验用水水质指标由本实验室测定，具体见表1。试验用培养皿规格为：直径12 cm，高1.0 cm，购自济南中山化玻仪器有限公司。

表1 试验用自来水和再生水水质

下同。ck为100%清水；T 1为30%再生水+70%清水；T 2为70%再生水+30%清水；T 3为100%再生水。

1.2 试验方法

1.2.1试验设计

试验于2018年5月15日开始实施，试验地点为山东农业工程学院设施农业科学与工程系实验室。选取大小均匀、饱满的草坪草种子，采用0.5%的NaClO溶液浸种10 min进行消毒，随后将种子均匀放入底部有双层湿润滤纸的培养皿内，每皿100粒。试验共设置草坪草种子和再生水浓度2个因素。其中，草坪草种子共有5种类型，再生浓度为4个水平，即浓度分别为0(ck)、30%(T 1)、60%(T 2)和100%(T 3)，总计20个处理，每个处理9次重复，其中3皿用于统计种子发芽情况，6皿用于测定种子生理生化指标。分别向放入5种草坪草种子的培养皿中加入各浓度再生水5.0 mL，随后将培养皿放入人工气候箱，位置随机，培养条件为：温度，24 ℃/14 ℃(日/夜)；光周期，16 h/8 h(暗/光)；湿度，80%。每隔2 d向各处理培养皿中加入相应浓度的再生水，每皿2 mL。

1.2.2测定数据及方法

播种后第2天开始统计发芽数，以胚根突破中皮为萌发标准，每12 h统计一次。播种后第4天，将各处理的6皿种子分为2皿1组，3次重复，等量取各皿种子进行生理生化指标测定。种子过氧化氢(H2O2)含量、超氧阴离子(O2-·)产生速率及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均参照郭欣欣等[14]的方法测定；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性分别采用抑制NBT光还原比色法、愈疮木酚法和紫外分光光度法进行测定；丙二醛(MDA)含量和相对电导率则分别采用硫代巴比妥酸比色法和相对电导法测定；脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)含量均参照张馨月[21]的方法进行测定。

1.3 试验数据处理及分析

发芽率(%)=(发芽数/供试种子总数)×100%；

发芽势(%)=(发芽高峰期种子萌发数/培养皿总种子数)×100%；

发芽指数=∑Gt/Dt，式中：Dt表示相应天数，Gt表示第t天的发芽数。

各试验数据用Excel 2013软件进行整理、计算及作图，采用SPSS 18.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 再生水对5种常见草坪草种子萌发的影响

由表2可知，再生水对草坪草种子萌发具有一定的抑制作用，且抑制程度与再生水浓度和草坪草种类密切相关。随着再生水浓度的升高，5种草坪草种子的发芽率、发芽势和发芽指数均逐渐降低，且高羊茅和狗牙根的下降幅度明显低于结缕草、黑麦草和早熟禾。与清水萌发(ck)相比，30%再生水处理(T 1)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾的发芽率分别降低8.37%、3.07%、9.12%、3.43%和6.95%，发芽势分别降低9.35%、3.67%、7.92%、3.66%和9.33%，发芽指数则分别降低21.31%、7.83%、22.01%、6.02%和19.93%；其中高羊茅和狗牙根萌发特性未发生显著变化(p>0.05)，而结缕草、黑麦草和早熟禾则达显著差异水平(p<0.05)。与清水萌发(ck)相比，60%再生水处理(T 2)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾的发芽率分别显著降低26.39%、7.85%、28.03%、9.18%和22.46%(p<0.05)，发芽势分别显著降低56.97%、21.34%、57.03%、20.43%和43.69%(p<0.05)，发芽指数则分别显著降低81.67%、35.70%、82.91%、35.86%和43.69%(p<0.05)。与清水萌发(ck)相比，100%再生水处理(T 2)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾的发芽率分别降低39.27%、12.81%、39.69%、15.19%和32.55%，发芽势分别降低44.35%、24.00%、40.58%、24.33%和38.15%，发芽指数则分别降低81.67%、35.70%、82.91%、35.86%和69.08%，均较对照达显著差异水平(p<0.05)。说明再生水明显降低草坪草种子的发芽率、发芽势和发芽指数，高羊茅和狗牙根种子对再生水耐受性明显强于结缕草、黑麦草和早熟禾。

表2 再生水对5种常见草坪草种子萌发的影响

注：图中同列不同小写字母表示不同处理间差异达显著水平(p<0.05)。下同。ck为100%清水；T 1为30%再生水+70%清水；T 2为70%再生水+30%清水；T 3为100%再生水。图1 再生水对5种常见草坪草种子萌发过程中活性氧含量的影响Fig.1 Effects of reclaimed water on reactive oxygen species content during seed germination of 5 common turfgrass varieties

2.2 再生水对5种常见草坪草种子萌发过程中活性氧含量的影响

由图1可知，再生水可造成草坪草种子萌发过程中活性氧含量明显提升，且提升幅度与再生水浓度和草坪草种类密切相关。随着再生水浓度升高，5种草坪草种子萌发过程中活性氧含量逐渐升高，且升高幅度因草坪草种类而异。同一再生水浓度处理下，高羊茅和狗牙根种子萌发过程中活性氧(H2O2和O2-·)含量提升幅度明显低于结缕草、黑麦草和早熟禾。与清水萌发(ck)相比，30%再生水处理(T 1)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾种子的H2O2含量分别提升25.59%、16.34%、28.17%、13.46%和27.67%，除高羊茅和狗牙根外，均较ck达显著差异水平(p<0.05)；O2-·产生速率分别显著提升85.20%、55.56%、95.66%、65.24%和92.46%、7.92%、3.66%和9.33%(p<0.05)。60%再生水处理下(T 2)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾种子的H2O2含量分别提升64.93%、57.43%、74.18%、56.25%和75.24%，均较ck达到显著差异水平(p<0.05)；O2-·产生速率分别显著提升217.76%、141.29%、240.90%、152.62%和251.94%(p<0.05)。而100%再生水处理(T 3)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾种子的H2O2含量分别提升139.81%、115.84%、132.86%、117.31%和150.00%，均较ck达显著差异水平(p<0.05)；O2-·产生速率分别显著提升349.79%、298.15%、373.62%、304.49%和379.74%(p<0.05)。说明再生水可导致种子活性氧含量提升，高羊茅和狗牙根种子提升幅度明显低于结缕草、黑麦草和早熟禾。

2.3 再生水对5种常见草坪草种子萌发过程中抗氧化酶活性的影响

由图2可知，再生水对5种草坪种子萌发过程中抗氧化酶活性具有明显影响，且影响程度与再生水浓度和草坪草种类密切相关。随着再生水浓度升高，5种草坪草种子萌发过程中抗氧化酶活性表现为先升高后降低趋势，且变化幅度与草种自身特性有关。同一再生水浓度处理下，高羊茅和狗牙根种子萌发过程中抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性显著高于结缕草、黑麦草和早熟禾(p<0.05)。60%再生水处理(T 2)下，5种草坪草种子抗氧化酶活性均达到最高，与清水萌发(ck)相比，SOD活性分别提升106.16%、130.54%、86.77%、127.14%和71.82%(p<0.05)；POD活性分别提升119.72%、146.27%、99.98%、133.70%和79.38%(p<0.05)；CAT活性分别提升160.36%、225.12%、134.64%、199.72%和114.89%(p<0.05)；而APX活性则分别提升125.99%、180.57%、110.46%、160.14%和100.80%，均较ck达显著差异水平(p<0.05)。说明低、中浓度再生水可提升草坪草种子抗氧化酶活性，高浓度再生水则相反，高羊茅和狗牙根种子提升幅度明显高于结缕草、黑麦草和早熟禾。

图2 再生水对5种常见草坪草种子萌发过程中抗氧化酶活性的影响Fig.2 Effects of reclaimed water on autioxidant enzyme activities during seed germination of 5 common turfgrass varieties

2.4 再生水对5种常见草坪草种子萌发过程中膜脂过氧化的影响

由图3可知，再生水造成草坪草种子萌发过程中细胞膜氧化损伤加剧，且加剧程度与再生水浓度和草坪草种类密切相关。随着再生水浓度升高，5种草坪草种子萌发过程中相对电导率和MDA含量逐渐升高，且升高幅度因草坪草种类而异。同一再生水浓度处理下，高羊茅和狗牙根种子萌发过程中相对电导率和MDA含量提升幅度明显低于结缕草、黑麦草和早熟禾。与清水萌发(ck)相比，30%再生水处理(T 1)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾种子的MDA含量分别降低83.72%、36.12%、107.53%、40.46%和114.34%，除高羊茅和狗牙根外，其余均较ck达显著差异水平(p<0.05)；相对电导率分别显著降低163.84%、96.28%、200.30%、121.31%和220.08%(p<0.05)。60%再生水处理(T 2)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾种子的MDA含量分别降低198.23%、128.29%、215.59%、154.06%和245.28%，均较ck达显著差异水平(p<0.05)；O2-·产生速率分别显著降低405.02%、293.54%、442.35%、310.12%和446.82%(p<0.05)。而100%再生水处理(T 3)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾种子的MDA含量分别降低300.88%、234.16%、315.59%、253.71%和328.67%，均较ck达显著差异水平(p<0.05)；相对电导率分别显著降低643.05%、488.85%、688.81%、533.79%和683.64%(p<0.05)。说明再生水可加剧草坪草种子萌发过程中的膜质氧化损伤，高羊茅和狗牙根受损伤程度明显低于结缕草、黑麦草和早熟禾。

图3 再生水对5种常见草坪草种子萌发过程中膜质过氧化程度的影响Fig.3 Effects of reclaimed water on peroxidation degree of membrane during seed germination of 5 common turfgrass varieties

2.5 再生水对5种常见草坪草种子萌发过程中ABA和GA3含量的影响

由图4可知，再生水可提升草坪草种子萌发过程中ABA含量、降低GA3含量，且变化幅度与再生水浓度和草坪草种类密切相关。随着再生水浓度升高，5种草坪草种子萌发过程中ABA含量逐渐升高，且提升因草坪草种类而异。同一再生水浓度处理下，高羊茅和狗牙根种子萌发过程中ABA和GA3含量变化幅度明显低于结缕草、黑麦草和早熟禾。与清水萌发(ck)相比，30%再生水处理(T 1)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾种子的ABA含量分别提升57.84%、22.97%、81.08%、35.60%和89.03%，除高羊茅和狗牙根外，均较ck达显著差异水平(p<0.05)；GA3含量则分别显著降低24.69%、13.02%、23.86%、15.22%和27.55%(p<0.05)。60%再生水处理下(T 2)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾种子的ABA含量分别提升150.55%、83.15%、167.14%、101.59%和201.40%，均较ck达到显著差异水平(p<0.05)；GA3含量则分别显著降低46.01%、33.27%、49.47%、36.36%和54.24%(p<0.05)。而100%再生水处理(T 3)下结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾种子的ABA含量分别提升229.45%、156.31%、266.83%、186.86%和288.59%，均较ck达到显著差异水平(p<0.05)；GA3含量则分别显著降低76.06%、60.46%、80.41%、52.34%和83.33%(p<0.05)。说明再生水会提升草坪草种子萌发过程中的ABA含量和降低GA3含量，高羊茅和狗牙根ABA和GA3含量变化幅度明显低于结缕草、黑麦草和早熟禾。

图4 再生水对5种常见草坪草种子萌发过程中ABA和GA3含量的影响Fig.4 Effects of reclaimed water on the content of ABA and GA3 during seed germination of 5 common turfgrass varieties

2.6 相关性分析

由表3可知，再生水灌溉条件下，草坪草种子发芽率、发芽势及发芽指数与H2O2含量、O2-·产生速率、MDA含量及相对电导率均达到极显著负相关(p<0.01)，而与SOD、POD、CAT及APX活性则均达到显著正相关(p<0.05)；种子发芽率、发芽势及发芽指数与ABA含量均达到极显著负相关(p<0.01)，而与GA3含量则均达到极显著正相关。说明草坪草种子抗氧化能力及ABA和GA3含量与再生水灌溉下种子萌发密切相关。

表3 再生水灌溉下草坪草种子萌发与抗氧化能力及激素含量的相关性分析

3 结论与讨论

种子萌发是植物生长发育的起始事件，易受外界环境胁迫，萌发优劣由自身萌发特性及外界环境(光、温、水、肥等)共同决定，对植物后期生长发育具有明显影响[15-16]。发芽率、发芽势和发芽指数是衡量种子萌发能力的重要指标，可反映种子发芽数、发芽快慢及整齐度[17]。本研究发现，再生水对草坪草种子萌发具有一定的抑制作用，且抑制程度因草坪草种类而异，高羊茅和狗牙根种子抑制程度显著低于结缕草、黑麦草和早熟禾，这可能是由于高羊茅和狗牙根种子对再生水具有较高抗性所致；同时，抑制程度随再生水使用浓度增大而提高，60%再生水浓度灌溉下，结缕草、高羊茅、黑麦草、狗牙根和早熟禾的发芽率分别显著降低26.39%、7.85%、28.03%、9.18%和22.46%(p<0.05)，发芽势分别显著降低56.97%、21.34%、57.03%、20.43%和43.69%(p<0.05)，发芽指数则分别显著降低81.67%、35.70%、82.91%、35.86%和43.69%(p<0.05)。说明再生水中含有的盐离子、重金属离子及大肠杆菌等可能是造成草坪草种子萌发受抑的物质，大量使用会影响种子萌发特性，尤其是对再生水比较敏感的草坪草类型(如结缕草、黑麦草、早熟禾)尤为显著。

再生水富含盐离子、重金属、有机污染物等有害物，不合理灌溉会对植物造成逆境胁迫，其中，氧化损伤是逆境胁迫对植物造成伤害的重要机理之一。活性氧代谢是种子萌发过程中的重要代谢事件，正常条件下，活性氧自由基产生与清除处于动态平衡；而当遭遇逆境胁迫时，该平衡被打破，造成活性氧大量积累导致膜脂过氧化启动，其中，MDA含量和相对电导率是衡量膜脂过氧化程度的重要指标[18]。植物在长期进化中形成了一套严密的活性氧清除系统，清除因逆境产生的过量活性氧，缓解逆境氧化损伤。SOD、POD 和CAT是植物进行ROS代谢的重要酶类，其中，SOD是细胞清除ROS的第一道防线，负责将O2-·歧化为H2O2和O2，而H2O2则进一步被POD、CAT和APX还原成H2O和O2-·[19]。本研究发现，再生水灌溉明显提高了草坪草种子萌发过程中活性氧含量(H2O2和O2-·)，导致氧化损伤加剧，MDA含量和相对电导率显著提升；再生水使用浓度越大，膜脂过氧化程度越高；同一浓度下，高羊茅和狗牙根种子萌发过程中活性氧含量、膜脂过氧化程度显著低于结缕草、黑麦草和早熟禾。这说明，再生水灌溉导致的种子氧化损伤是造成萌发特性降低的重要机理之一，高羊茅和狗牙根种子对再生水抗性明显高于结缕草、黑麦草和早熟禾，其原因可能是高羊茅和狗牙根种子抗氧化酶活性显著高于结缕草、黑麦草和早熟禾所致。种子萌发过程中，抗氧化酶活性随再生水使用浓度升高而呈现先升高后降低趋势，且变化幅度因草坪草种类而异，高羊茅和狗牙根显著高于同浓度的结缕草、黑麦草和早熟禾；再生水使用浓度为60%时，5种草坪草种子的抗氧化酶活性达到最高，与ck(清水灌溉)相比，SOD活性分别提升106.16%、130.54%、86.77%、127.14%和71.82%(p<0.05)；POD活性分别提升119.72%、146.27%、99.98%、133.70%和79.38%(p<0.05)；CAT活性分别提升160.36%、225.12%、134.64%、199.72%和114.89%(p<0.05)；而APX活性则分别提升125.99%、180.57%、110.46%、160.14%和100.80%，从而最大程度清除再生水灌溉引起的活性氧，缓解氧化损伤。再生水使用浓度为100%时，5种种子的抗氧化酶活性均显著降低，说明高浓度的再生水会加大对种子的氧化损伤，以至超出种子自身的防御能力，导致活性氧清除系统遭到破坏，抗氧化酶活性大幅降低、种子萌发受到严重影响。

大量研究表明，激素组成及含量变化与种子萌发息息相关，GA3可促进种子萌发，而ABA则会对种子萌发产生抑制[20-21]。本研究发现，再生水灌溉明显提高草坪草种子ABA含量、降低GA3含量，且变化幅度与再生水使用浓度和草坪草种子相关；随着再生水使用浓度的升高，5种草坪草种子ABA含量均逐渐上升，而GA3含量则逐渐降低；同一再生水浓度下，高羊茅和狗牙根种子中ABA和GA3含量的变化幅度明显低于结缕草、黑麦草和早熟禾。说明再生水灌溉导致的草坪草种子ABA含量升高和GA3含量下降也是造成种子萌发特性降低的主要机制之一。

综上所述，再生水会对5种草坪草种子萌发造成一定的抑制，其机理主要包括氧化损伤和激素调节(提升ABA含量和降低GA3含量)；高羊茅和狗牙根种子萌发受抑制程度明显低于结缕草、黑麦草和早熟禾；再生水最佳使用浓度为60%，过高会对种子抗氧系统造成破坏，严重影响种子萌发。因此，在利用再生水进行绿地灌溉时，建议选择抗性较强的绿地植物品种，使用浓度为60%。