等离子体处理对不同含水量穿心莲种子萌发的影响

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(1.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006；2.广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心、岭南中药资源教育部重点实验室、国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室，广东 广州 510006)

物理农业中γ射线和离子注入等方法常用于诱变育种[1-2]。而低温等离子体(low temperature plasma)能量较低，农业上常应用于提高种子活力、促进萌发及种子表面消毒等方面[3-4]。相对于化学试剂处理，低温等离子体处理具有方便、快捷、无残留等优点[3-4]。研究表明，多种方式激发的等离子体处理均可达到提高种子萌发率或萌发速度的作用，包括：电晕放电(corona discharge)[5-6]、射频放电(radiofrequency discharge)[7-10]、低频辉光放电(low frequency glow discharge)[11]、滑动弧光放电(gliding arc discharge)[12]、介质阻挡放电(dielectric barrier discharge)[13-14]、高压纳秒脉冲放电(high voltage nanosecond pulsed plasma)[15-16]、扩散共面表面阻挡放电(diffuse coplanar surface barrier discharge)等[17]。在多种作物种子研究中得到证实，包括：油菜(Brassicanapus)[5,10]、萝卜(Raphanussativus)[6]、兵豆(Lensculinaris)[7]、菜豆(Phaseolusvulgaris)[7-8]、大豆(Glycinemax)[14]、豌豆(Pisumsativum)[17]、小麦(Triticumaestivum)[7,11,13]、菠菜(Spinaciaoleracea)[15]、芥菜(Brassicajuncea)[16]、刺菜蓟(Cynaracardunculus)[9]、欧亚花葵(Lavaterathuringiaca)等种子[12]。Gómez-Ramírez等采用介质阻挡和射频放电等离子体，均能提高昆诺藜(Chenopodiumquinoa)种子的萌发率[18]。

前期实验采用大气压下介质阻挡放电激发的空气等离子体处理种皮具有蜡质层的穿心莲(Andrographispaniculata)种子，结果表明能够刻蚀种皮，提高发芽指数和田间出苗率，并且增强幼苗的抗氧化能力；但过高的电压或太长的处理时间却会伤害种子[21]。进一步研究重新从3个激发电压和3个处理时间组合共9个处理组中优选了适当处理剂量，可以提高穿心莲种子发芽势，促进植株生物量的积累[22]。然而，在实验过程中观察发现，大气压下敞开式放电环境的空气湿度会影响等离子体的激发效果，空气湿度越大需要激发的能量越高。环境的湿度相对容易调节，但是种子不同的含水量是否会影响等离子体的激发，从而对处理效应产生影响。以往的文献大多没有标明种子的含水量，说明前人的研究没有考虑到环境湿度和种子含水量对处理效果的影响。为此，本研究调节穿心莲种子到不同含水量，再进行等离子体处理和发芽试验，考察不同含水量下处理对萌发和幼苗参数的影响，为播种前处理和进一步研究等离子体技术在农业生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

穿心莲(Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees)种子于2014年12月10日收购于广西贵港，批号为GX 20141210 DX-1，经人工净选，含水量为12.9%，试验前保存于4 ℃冰箱内备用。

1.2 仪器与设备

DBD-50低温等离子体放电设备，配CTP-2000 K型电源，南京苏曼等离子体科技有限公司；Sartorius BSA 2245分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；ZRX-1000 EC智能人工气候培养箱，杭州钱江仪器设备有限公司；DGX-9073烘箱，上海福玛实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 种子初始含水量的测定

参照《农作物种子检验规程》[23](下文简称《规程》)及《<规程>实施指南》[24](下文简称《指南》)，采用高温法测定种子初始含水量。

1.3.2 种子水分的调节

十字分样法扦样，取穿心莲种子，装于尼龙网袋内，参考硅胶干燥法[25]，在4 ℃冰箱中的密封盒内脱水处理3 h和24 h。或饱和水蒸汽增湿法加湿8，24，72 h(装种子的尼龙网袋置于4 ℃冰箱内的密封盒上层，下层为灭菌蒸馏水)[26]。取出种子，迅速精密称重，计算干燥或加湿后含水量。每组设置3个重复，每个重复1.5～1.7 g种子。

1.3.3 种子的等离子体处理

采用空调调节室温为25 ℃，相对湿度约70%。调整低温大气压介质阻挡放电(DBD)等离子体装置的石英介质间距(气隙)为8 mm，连接定时插座，调整电压为30 V，把电源频率调整到10 KHz。每个实验重复的种子置于下介质板上，开启定时插座放电处理3 s。处理后密封放置4 d后置种，以未处理种子作对照组[22]。每组设置4个重复，每个重复100粒种子。

1.3.4 发芽试验

按照穿心莲种子发芽试验规程，室温条件纯水浸种20 h，0.3%双氧水消毒5 min，置种，纸上法(TP)发芽，在温度(27.5±1)℃光照培养。以胚根突破种皮达种子长度一半(约1 mm)计为发芽，每天进行发芽计数，置种后第7天结束发芽，并测量胚根长度[27]。

1.3.5 数据分析

参照《规程》及《指南》要求[23-24]按下式计算发芽率、第2天发芽势、发芽指数等参数。数据组间差异采用SPSS 19.0软件进行方差分析，两两比较采用Duncan检验。

发芽率(%)=(试验中所有发芽种子数/供试种子总数)×100%;

发芽势(%)=(规定天数内(2 d)发芽种子数/供试种子总数)×100%;

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)(式中，Gt为置种后第t天的发芽数，Dt为不同的发芽试验天数);

日均发芽数=∑(Gt×Dt)/∑Gt;

活力指数(VI)=发芽指数(GI)×胚根长；

霉变率(%)=(试验中所有霉变种子数/供试种子总数)×100%；

正常幼苗百分比(%)=(第7天所有健康的正常幼苗数/供试种子总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 穿心莲种子水分调节结果

经测定，该批穿心莲种子的初始含水量为(12.91±0.01)%；经过硅胶干燥24 h和3 h，含水量分别降至6.27%和8.58%；饱和水蒸汽加湿8，24 h和72 h，含水量分别提高到18.58%、23.97%和33.39%(见表1)。

2.2 穿心莲种子含水量对等离子体处理后萌发的影响

发芽试验结果表明，穿心莲种子经过水分调节后，未经等离子体处理组中含水量为6.3%种子的发芽势与基础水分组(含水量为12.9%)的发芽势(21.3±3.9)%相比降低了28.2%，但未达到显著性差异；而含水量为18.6%组发芽势相比基础水分组提高了54.0%(p<0.05)。由此看来，4 ℃条件下饱和水蒸汽增湿处理种子8 h有助于提高穿心莲种子发芽势。但是，等离子体处理组和未处理组间发芽势未见显著性差异(见图1 A)。从7 d内的总发芽率来看(见图1 B)，水分增加到18.6%组相比基础水分组的发芽率(52.8±4.2)%显著提高了25.9%(p<0.05)；经过等离子体处理后从含水量为12.9%、18.6%到24.0%各组发芽率有逐渐升高的趋势，含水量为12.9%组和24.0%组的发芽率与未经等离子体处理组相比较分别显著提高了25.0%和39.2%(p<0.05)，其它各组包括含水量为18.6%组差异不显著。发芽指数与发芽率变化情况类似。未经等离子体处理前含水量为18.6%组相比基础水分组的发芽指数(19.48±2.09)提高了34.4%(p<0.05)；经过等离子体处理后从含水量12.9%、18.6%到24.0%各组发芽指数分别比未经等离子体处理组提高了24.8%(p<0.05)、8.1%和29.3%(p<0.05)，含水量为18.6%组差异不显著(见图1 C)。从日均发芽数来看，未经等离子体处理各组间差异不显著；经等离子体处理后从含水量为12.9%、18.6%到24.0%各组日均发芽数有逐渐升高趋势；含水量为12.9%、24.0%和33.4%各组日均发芽数分别比未处理组提高22.1%、51.2%和19.5%(p<0.05)；其它各组包括含水量为18.6%组差异不显著(见图1 D)。

表1 干燥或增湿处理后穿心莲种子的含水量(mean±SD,n=3)

注：“—”表示未进行干燥或增湿调节的初始状态。

2.3 穿心莲种子含水量对等离子体处理后幼苗的影响

置种后第7天结束发芽试验，测量胚根长度，计算试验过程中受到细菌或霉菌感染而腐烂的种子或幼苗与试验种子总数的百分比(霉变率)，剔除霉变等不正常幼苗并计算最终正常幼苗百分比。结果显示，未经等离子体处理前含水量为8.6%组的胚根长度为(1.55±0.13)cm，显著长于基础水分组的(1.16±0.23)cm，表明4 ℃低温干燥3 h后进行播种能促进萌发早期胚根生长；但该组经等离子体处理后胚根长为(1.19±0.09)cm，显著短于未处理前，其原因有待进一步研究。含水量为33.4%未经等离子体处理组的胚根长度为(0.91±0.13)cm，短于基础水分组，差异虽未达显著水平，但是4 ℃低温条件下饱和水蒸汽增湿72 h有可能对种子产生了吸胀冷害的影响。从活力指数来看，受到胚根长度的影响，未经等离子体处理含水量为8.6%组相比基础水分组的的活力指数(22.88±6.61)提高了46.5%(p<0.05)；含水量为18.6%组的活力指数相比基础水分组提高了51.5%(p<0.05)，为未处理组的最高值。经等离子体处理后，含水量为18.6%组的活力指数为最高值(42.65±8.21)，由于试验重复间差异太大，与未处理组差异未达显著水平；但含水量为24.0%处理组相比未处理组的活力指数(25.23±4.20)提高了57.8%(p<0.05)。从种子或幼苗霉变情况来看，各干燥或增湿处理组间未见显著差异，说明4 ℃低温条件干燥24 h或增湿处理72 h对种子萌发过程感染细菌或霉菌情况没有显著影响。经等离子体处理后，含水量为12.9%、18.6%、24.0%和33.4%组霉变率显著降低(p<0.05)，与未处理组比较分别降低36.5%、41.4%、54.7%和31.0%，含水量为24.0%组的霉变率最低。从正常幼苗百分比来看，未处理组间未见显著差异；经等离子体处理后受到霉变率显著降低的影响，含水量为12.9%、18.6%、24.0%和33.4%组正常幼苗百分比显著提高(p<0.05)，与未处理组比较分别提高46.2%，51.0%，58.2%，36.6%，含水量为24.0%组的正常幼苗百分比最高。

注：组间比较采用方差分析，两两比较采用Duncan检验；不含有相同字母的组间差异具有显著意义。下同。图1 穿心莲种子含水量对等离子体处理后萌发参数的影响

图2 穿心莲种子含水量对等离子体处理后幼苗参数的影响

3 讨 论

前人采用等离子体处理种子，大多没有考虑空气湿度和种子含水量对处理效应的影响。本研究把空气湿度调节到70%，尽量避免处理过程中种子受到空气影响而含水量产生变化，从而考察种子含水量对处理效果的影响。结果表明，不同含水量的穿心莲种子进行等离子体处理后萌发效应不一。基础水分为12.9%或提高到18.6%、24.0%水分条件下种子经等离子体处理，发芽指数、日均发芽数和发芽率有逐渐升高趋势，含水量为12.9%和24.0%组相比未处理组有显著提高；水分和等离子体处理对含水量为18.6%组可能有交互作用，差异未达显著意义。前期研究采用相同剂量等离子体处理含水量为11.6%的穿心莲种子，也能达到提高发芽势和促进幼苗生长的作用[22]。但含水量降低到6.3%和8.6%进行等离子体处理，对种子萌发和幼苗生长的效应不明显。

种子含水量为12.9%到33.4%各组，等离子处理除了表现出促进萌发的作用之外，还有明显的抑制细菌和霉菌、降低种子和幼苗染菌，从而提高正常幼苗存活率的效果；含水量为24.0%组效果最好。Jiang等研究表明，等离子体处理番茄(Solanumlycopersicum)种子后，幼苗抗青枯菌感染，从而降低青枯病的发病率[28]；处理小麦种子，对携带的种传病原如雪腐镰刀菌(Fusariumnivale)、大刀镰刀菌(Fusariumculmorum)、粉红单端孢(Trichotheciumroseum)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)等都有显著的灭活作用[29]。其机理是由于等离子体中的带电粒子和激发过程产生的活性氧(reactive oxygen species)有明显的抗菌效果。胡友谊等采用不同含水量的空气等离子体对指状青霉(Penicilliumdigitatum)进行灭活处理，结果显示随着气氛中水分比例的升高灭菌效果越好，分析认为主要是由于水分子电离产生的活性氢氧离子(OH)的作用[30]。

但是，并不是种子含水量调节得越高处理效果越好。当种子含水量升高到33.4%时进行等离子体处理，表现出明显提高日均发芽数，也有显著的杀菌和提高正常幼苗百分比的效应，但没有明显提高发芽指数和发芽率。研究表明，空气中水分含量越高，激发产生的等离子体中带电氢氧离子浓度越高；但是从液态水激发产生等离子体需要更高的能量，否则无法产生等离子体[30-31]。而前期研究表明，过高剂量的等离子体处理会对穿心莲种子产生伤害，从而降低发芽率[32]。同时，结果显示，调节水分处理的长时低温(72 h，4 ℃)高湿环境可能对种子产生吸胀冷害，这在实际运用中也要考虑避免。此外，不同作物种子的大小、种皮厚薄和质地等具有多态性，最适合的种子含水量区间可能不同，应用前需要进行试验摸索。

4 结 论

由于大气压敞开环境下等离子体的激发会受到空气湿度和处理对象所含水分的影响，采用该条件的介质阻挡放电等离子体处理种子来促进萌发，种子含水量是影响处理效果的重要因素，需要适当的含水量才能达到促进萌发的效果，过低或过高的水分条件下进行处理都有可能达不到效果。总体来说，穿心莲种子含水量在11.6%～24.0%范围以内是合适的，该水分条件下进行等离子体处理能够促进发芽，抑制种子携带的微生物的生长，从而获得更多的健康幼苗。