贵州紫心甘薯种质资源ISSR遗传多样性分析

宋吉轩， 李 云， 李 标， 邓仁菊， 李 丽

（贵州省生物技术研究所， 贵阳550006）

甘薯属旋花科甘薯属一年生作物，由于块根产量高、适应性广，是重要的粮食、饲料、工业原料及生物能源作物之一。而紫心甘薯薯肉一般为紫色或深紫色，除含有普通甘薯各种营养成分外，还富含有丰富的花青素，由于花青素具有特殊的功能，从而表现出一些特有的生理活性和功能［1］。有研究表明，紫心甘薯具有抗氧化、保肝和改善视力等功能，同时还能降低血清中的相关酶，对高血压等心血管病有较好的预防功能［1－2］。

ISSR分子标记在作物种质资源鉴定、分类及亲缘关系分析等中有重要的应用，对研究材料的背景要求不严，且具有引物设计简单、多态性高、重复性好和结果可靠等优点［3］，在一些作物种质资源鉴定和亲缘关系研究中进行了相应的应用［4－5］。同时，ISSR分子标记在甘薯遗传多样性等方面获得了肯定，并有较高的分辨力［6］。目前利用ISSR分子标记分析贵州紫心甘薯种质资源的遗传多样性还未见报道。本研究利用ISSR分子标记对23份贵州紫心甘薯种质资源的亲缘关系进行分析，初步了解紫心甘薯材料间的亲缘关系，为贵州省选育紫心甘薯新品种，提高育种效率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验材料为引进和新选育的贵州紫心甘薯种质资源，一共23份（见表1）。

表1 23份贵州紫心甘薯种质资源

1.2 方 法

1.2.1 紫心甘薯基因组DNA的提取

紫心甘薯种质资源基因组DNA的提取［7］，获得的基因组DNA溶液的质量可达到ISSR分子标记要求。

1.2.2 ISSR－PCR反应与电泳检测

ISSR－PCR的反应体系、扩增参数和电泳检测［8］。反应体系：采用20μL体系，Taq 酶（1U／L）0.2μL，10×buffer 2μL，甲 酰 胺 （1%）1μL，dNTP（0.3mmol／L）：0.6μL，引 物（1U）2μL，DNA模板（45ng／μL）：2μL，加水补至20μL；扩增参数：94℃充分变性5min，然后40个循环：94℃变性90s，50～60℃退火45s，72℃延伸7min，最后72℃延伸8min，4℃终止反应；电泳检测：取PCR扩增产物5μL在1.5%琼脂糖凝胶上进行，需45min左右，以DL 2 000作为标记，电泳完后进行照像保存，方便下一步读取条带。

1.2.3 数据分析

以琼脂糖电泳的每条DNA带为1个单位，有带的赋值为1，无带的赋值为0，应用Excel进行数据输入，统计结果为0～1型的数据，然后利用DPS统计软件进行数据处理并聚类分析。

2 结果与分析

2.1 紫心甘薯种质资源的ISSR结果

通过从15个ISSR引物中最终筛选出7个多态性好且条带清晰的ISSR引物［9］。利用筛选出的7个引物一共扩增出45个条带，每个引物平均扩增出6.5个条带，其多态性带为41个，多态性百分数达到91.1%。其中，引物825、835和引物841对23份贵州紫心甘薯种质的ISSR－PCR扩增结果见图1～图3。

2.2 ISSR聚类分析

通过DPS统计软件对23份贵州紫心甘薯种质资源进行了聚类分析，所获得的聚类图结果见图4。

23份贵州紫心甘薯种质资源的遗传相似系数范围为0.07～0.62，平均值为0.32，表明23份贵州紫心甘薯种质资源的亲缘关系比较接近，黔紫薯1号和13－4－1的最大，为0.62；13－32－36和13－27－5的最小，为0.07。

由图4可知，ISSR分子标记产生的聚类图将23份贵州紫心甘薯种质资源分为5大类群，第1类为13－4－1、13－24－2、13－26－3、13－27－6、13－27－1、13－4－2、13－19－3、13－24－2、13－27－5、13－32－36、13－34－15、13－34－22、徐紫1号和徐紫糯共15份；第2类为13－24－1、13－27－2、济 薯 18 和 13－32－38 等 共 4 份；第 3 类 为13－35－16和宁紫薯1号共2份；13－32－35和黔紫薯1号分别为第4类和第5类，都只有1份。

图1 23份贵州紫心甘薯种质资源的扩增结果（引物：825）

图2 23份贵州紫心甘薯种质资源的扩增结果（引物：835）

图3 23份贵州紫心甘薯种质资源的扩增结果（引物：841）

其 中 13－4－1 与 13－24－1、13－32－35、13－35－16、福薯9号和黔紫薯1号的欧式距离达0.4以上，最高达0.62。在今后贵州省紫心甘薯新品种选育工作中，应引进一些遗传相似系数较大即亲缘关系较远的紫心甘薯种质资源进行亲本组配，可选育出性状优异的杂交后代。

3 讨 论

ISSR分子标记具有不受取材、时间及人为限制等优点，这是传统的形态标记无法相比的。李强等研究表明，利用ISSR分子标记采用17个引物分析62份甘薯亲本材料的遗传多样性，一共检测出490条多态性的条带，表明ISSR分子标记是甘薯遗传多样性分析的可行有效的手段［10］。贺学勤等研究表明，RAPD、ISSR和AFLP这3种分子标记都可明晰甘薯品种间的亲缘关系，但ISSR分子标记的聚类分析图与系谱图最相近，所以ISSR分子标记更合适用于甘薯品种亲缘关系的分析［11］。本研究结果与前人的基本一致，说明ISSR分子标记的稳定性较好，多态性高，达到91.1%，最后通过琼脂糖凝胶电泳结果表明，出现的条带也是较丰富的。

国内紫心甘薯种质资源数量有限，本实验仅对23份贵州紫心甘薯种质资源进行ISSR分析。结果表明，15个ISSR引物中最终筛选出7个多态性好且条带清晰的ISSR引物，这些筛选出的引物最终共扩增出45个条带，每个引物平均扩增出6.5个条带，其多态性带为41个，多态性百分数达到91.1%。ISSR分子标记产生的聚类图将23份紫心甘薯品种分为5大类群，遗传相似系数范围为0.07～0.62，均值为0.32，表明23份贵州紫心甘薯种质资源的亲缘关系比较接近，黔紫薯1号和13－4－1的最大，为0.62；13－32－36和13－27－5的最小，为0.07。 第 1 类 为 13－4－1、13－24－2、13－26－3、13－27－6、13－27－1、13－4－2、13－19－3、13－24－2、13－27－5、13－32－36、13－34－15、13－34－22、徐紫1号和徐紫糯共计15份；第2类为13－24－1、13－27－2、济薯18和13－32－38等4份；第3类为13－35－16和宁紫薯1号等2份；13－32－35和黔紫薯1号分别为第4类和第5类，都只有1份。

ISSR分子标记聚类分析把23份贵州紫心甘薯种质资源分为不同的群别，较好地明晰了23份贵州紫心甘薯种质资源的亲缘关系，在今后贵州省紫心甘薯新品种选育工作中，应引进一些遗传相似系数较大即亲缘关系较远的紫心甘薯种质资源进行亲本组配，可选育出性状优异的杂交后代。

图4 23份贵州紫心甘薯种质资源的ISSR聚类分析

［1］Yoshimoto M，Yamaka O，Suda I.Physiological function of purple colored flesh sweetpotato［J］.Food Processing，1998，33（8）：15－17.

［2］明兴加，李坤培，张明，等.紫色甘薯的开发前景［J］.重庆中草药研究，2006（6）：55－60.

［3］孙洪，程静，詹克慧，等.ISSR标记技术及其在作物遗传育种中的应用［J］.分子植物育种，2005，3（1）：123－127.

［4］Pradeep R M，Sarla N，Siddiq E A.Inter simple sequence re－peat ISSR polymorphism and its application in plant breeding［J］.Euphytica，2002，128：9－17.

［5］孙洪，程静，詹克慧，等.ISSR标记技术及其在作物遗传育种中的应用［J］.分子植物育种，2005，3（1）：123－127.

［6］贺学勤，刘庆昌，王玉萍，等.中国甘薯地方品种的遗传多样性分析［J］.中国农业科学，2005，38（2）：250－257.

［7］李强，揭琴，刘庆昌，等.甘薯基因组DNA高效快速提取方法［J］.分子植物育种，2007，5（5）：743－746.

［8］宋吉轩，雷尊国，黄团，等.甘薯ISSR－PCR反应体系的优化［J］.贵州农业科学，2009，37（11）：25－26，29.

［9］宋吉轩，雷尊国，丁海兵，等.贵州甘薯地方种质资源ISSR遗传多样性分析［J］.种子，2011，30（3）：76－80.

［10］李强，刘庆昌，翟红，等.中国甘薯主要亲本遗传多样性的ISSR分析［J］.作物学报，2008，34（6）：972－977.

［11］贺学勤，刘庆昌，翟红，等.用 RAPD.ISSR和 AFLP标记分析系谱关系明确的甘薯品种的亲缘关系［J］.作物学报，2005，31（10）：1 300－1 304.