抗拿扑净除草剂谷子快速鉴定方法分析

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(1.山西省农业科学院作物科学研究所，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，太原 030031；2.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，太原 030031)

谷子是传统的粮、饲、草兼用作物，也是我国北方重要的粮食作物。谷子生产中，间苗是一项极其繁重的劳动，不但费工费时，而且劳动效率低下，难于进行集约化规模种植，严重制约着谷子的大面积生产，简化栽培谷子品种的选育成为目前的主要育种目标之一[1-3]。河北省农林科学院1993 年从国外引进了谷子抗除草剂基因，并将其成功导入到栽培种中，谷子的抗除草剂育种由此开始[4]，2003年河北省农林科学院谷子研究所提出了“简化栽培谷子品种选育及其配套栽培方法”，提出在培育抗、感拿扑净同型姊妹系的过程中，苗期通过喷施拿扑净同步实现化学间苗、化学除草，这一理论思想为谷子育种开拓了新的思路[5]。

谷子抗拿扑净除草剂类型遗传基础简单，同时具有抗性强等优点，缺点是拿扑净对双子叶杂草无效，田间除草不彻底，但可以配套使用“谷友”防治双子叶杂草，从而达到彻底除草的目的。自抗“拿扑净”谷子栽培种成功获得后，抗“拿扑净”除草剂材料在全国范围内引入研究，为谷子抗除草剂新品种的选育，解决谷田杂草提供了理论依据和技术保障。如何快速准确地鉴定谷子的拿扑净抗性，并将其抗性应用到谷子杂交及系谱选育过程中，具有重要的现实意义。

谷子中抗“拿扑净”基因Srf来源于谷子的一个近缘物种青狗尾草的突变株，其抗性由细胞核显性单核基因控制[6-7]。F1代便可以进行真杂种鉴定，解决了在没有指示性状，谷子由于颗粒小，去雄困难，鉴定真杂种难的问题。植物除草剂抗性鉴定的方法主要有整株植物测定法、组织或器官的形态结构比较鉴定法、生理生化鉴定法、DNA分子水平鉴定法等[8-10]。整株植物测定法和形态结构鉴定法简单、重复性好，适用于植物的大批量鉴定或田间进行抗性植株的筛选，但鉴定结果不太准确，且工作量大；生理生化和分子检测法方法比较快捷，但较难掌握，试验条件要求严格[8-10]。因此，育种工作者和种子相关企业常采用培养皿法进行种子抗性的快速鉴定。传统的培养皿鉴定技术一般是在种子出芽后喷施除草剂，反应慢，周期长，在此过程中，如果加水不及时或出现低温等情况，容易造成芽死亡，最终影响判断结果。张婷等[9]采用的是将种子置于滤纸上即喷药处理，该方法简便快捷，但在药剂量上把握不够准确。因此，本研究以抗除草剂品种、后代材料及常规品种进行浓度和时间梯度试验，旨在选择一种更快更准确的方法进行鉴定，从而为谷子育种提供理论支撑和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为河北省农林科学院谷子研究所选育的冀谷41号、冀谷36号及山西省农业科学院作物科学研究所选育的后代材料K 1043及常规谷子新品种晋谷36号，测试除草剂为拿扑净。

1.2 试验方法

为了获取最佳的拿扑净除草剂处理剂量及浸泡时间，设置0.1%、0.2%、0.4%、0.6% 4个不同的浓度梯度；浸泡时间设置10，20，30，40，50，60 min 6个梯度。

每份样品选取100粒健康饱满的种子，按照试验要求浸泡完成后将种子晾干进行培养皿发芽，2次重复；培养皿内放置约0.5 cm厚的海绵，加水至海绵吸足后，滤去多余的水分，发芽时间4～5 d；记录种子发芽粒数，定义为“出芽数”，种子发芽后，由于部分种子没有抗性，出芽的幼苗后期失去活力，最终枯萎。死亡的种子粒数，定义为“死苗数”，后期正常生长的种子粒数，定义为“存活数”。

发芽培养箱采用DHP-90508智能型电热恒温培养箱，设定27 ℃恒温。

1.3 统计方法

采用Excel 2007 软件处理原始数据，SPSS 16.0软件进行绘图与统计分析。

2 结果与分析

2.1 拿扑净浸泡液浓度对种子抗性的影响

应用冀谷41号进行试验，在相同浸泡时间下，随着拿扑净浸泡液浓度的提高，种子发芽并正常生长即种子的存活率逐渐降低，不同的浸泡时间，种子的存活率降幅为0.5%～15.5%(表1)，最低降幅发生在浸泡时间10 min，浸泡液浓度由b=0.2%提高至c=0.4%，最高降幅发生在浸泡达50 min，浓度由c=0.4%提高至d=0.6%。

在相同拿扑净浸泡液浓度下，前3个时间梯度(10，20，30 min)下种子的存活率持续降低，当浸泡浓度为d=0.6%时，此时间梯度内，种子存活率由81.5%降低至70.0%，延长浓度c和浓度d的浸泡时间，发现浸泡时间延长后，种子存活率开始提高，并没有持续下降，其中原因有待进一步试验验证。

表1 不同浓度梯度不同浸泡时间下冀谷41号存活率

注：浓度梯度a=0.1%，b=0.2%，c=0.4%，d=0.6%；ck表示种子没有浸泡时间；梯度1=10 min，2=20 min，3=30 min，4=40 min，5=50 min，6=60 min。下同。

2.2 不同品种对拿扑净浸泡液反应差异

在品种进行田间抗性选择或纯化的过程中，随着田间拿扑净选择的压力，品种的抗性水平有些增强，有些降低。由表2和图1可以看出，2个抗性品种在拿扑净除草剂的浸泡下，种子存活率较对照均有下降，同一品种在不同拿扑净浓度浸泡下，种子存活率的下降水平有差异，浓度越高，下降程度越大，冀谷36号在浓度c和浓度d浸泡下，与对照相比，种子存活率下降百分比分别为11.33%和17.17%；冀谷41分别为9.50%和14.75%。

表2 不同品种不同药液浓度浸泡时间的发芽率

图1 冀谷36号和冀谷41号浸泡前后的发芽率差

2.3 育种后代材料的鉴定分离

从后代抗性分离规律中(表3)，发现随着拿扑净浓度的提高和浸泡时间的延长，种子死苗数的比例逐渐提升，同样当浸泡时间超过30 min后，种子的存活数开始有所提升，然后随着浸泡时间的延长，开始下降。抗性与非抗性材料的比例在所有处理中均未符合3∶1的分离比例，且随着拿扑净浓度的提高，种子的存活数下降很大，在同样浸泡10 min的处理下，0.6%浓度较0.4%浓度种子的存活率下降高达30.0%，这表明后代材料对拿扑净药液的敏感程度很强。

对常规谷子新品种晋谷36号进行同样浓度和梯度的试验，结果显示，在最低浓度0.1%且浸泡最短时间10 min处理下，种子存活率仍然为零，这表明对于不抗除草剂的谷子品种对拿扑净药液的敏感程度更强。因此建议对后代材料进行抗性判断时，应用低浓度浸泡10 min即可。

表3 后代材料K 1043抗性分离规律

3 结论与讨论

通过对抗拿扑净谷子新品种冀谷36号、冀谷41号及K 1043进行不同浓度和不同时间梯度的试验，发现同一浸泡时间下，随着拿扑净浓度的提高，种子的存活率有所下降；同一浸泡浓度下，随着浸泡时间的延长，种子的存活率逐渐下降，且拿扑净浸泡30 min是一个时间拐点，因种子的发芽率受诸多因素影响，其中原因有待进一步分析。随着田间药剂的喷施选择，有些抗性增强，有些降低，后代材料表现最敏感，本研究中不同谷子品种表现的敏感程度不一致。培养皿试验排除了大田的误差，验证了不同材料对除草剂浓度的敏感程度不同。

谷子中抗“拿扑净”基因是由一对显性单核基因控制[6-7]，F1代抗感分离比例理论值为3∶1，但种子的发芽率受很多因素影响，种子的发芽性能还取决于种子本身的遗传特性及种子的形态结构和生理活性等[11-12]，因此应用培养皿进行后代分离鉴定不一定符合抗感分离比例，但仍可以作为快速鉴定方法进行应用，且后代材料和常规谷子品种对拿扑净敏感，本研究建议采用低浓度浸泡10 min即可进行抗性判断。这种方法较大田种植进行苗期鉴定省时、省力，且不受季节限制，可以缩短育种周期，提高育种效率。