3种抗生素对白菜种子萌发的影响

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(江苏师范大学生命科学学院， 江苏 徐州 221116)

3种抗生素对白菜种子萌发的影响

李萌，杨磊，季剑南，冯小娜，黄荣，温洪宇，高霞莉，曹露芬

(江苏师范大学生命科学学院， 江苏 徐州 221116)

以白菜种子为试材，采用保湿培养法，研究金霉素、土霉素和氯霉素3种抗生素在不同浓度下对白菜种子萌发率、根长和抗氧化酶活力的影响。结果表明，在0.5～50 mg/L抗生素作用下，白菜种子萌发率无显著变化，500 mg/L抗生素显著抑制白菜种子萌发率。抗生素浓度与白菜根长抑制率之间存在剂量-效应关系。3种抗生素对白菜种子萌发的抑制作用大小依次为：氯霉素gt;金霉素gt;土霉素。抗生素浓度对白菜幼苗的抗氧化酶活性的影响表现为低浓度促进而高浓度抑制。

白菜种子； 抗生素； 发芽率； 根长； 抗氧化酶

抗生素是微生物次级代谢产生的具有杀灭病原微生物作用的化学物质，在感染治疗与预防中有显著效果[1]。自20世纪弗莱明发明青霉素以来，抗生素对人类生命健康和社会发展做出卓越的贡献。由于抗生素具有促进农作物生长的功能而被大面积应用于农业。人们过度依赖抗生素防治病虫害，且缺乏对抗生素合理使用的认识，导致抗生素使用量和使用浓度大大增加[2]。中国科学院广州地球化学研究所发布的一项研究显示，2013年中国总的抗生素生产量24.8万t，其中抗生素使用量高达16.2万t，约占世界使用量的一半左右，人均使用量是西方的5～8倍。与西方国家相比，我国已经成为世界上滥用抗生素最为严重的国家之一[3]。抗生素经过动物等生物体生物代谢后，大多以原形排出[4]。在自然界, 抗生素可通过多种途径如土壤、微生物、动植物进行传递[5-6]，再经过一系列生理生化过程，直接或间接地对环境和动植物造成不利影响。

王朋等[7]通过发芽试验发现，玉米对环丙沙星的吸收量随培养液中环丙沙星浓度的增加而上升，环丙沙星使玉米幼苗的生长受到不同程度抑制，玉米根中谷胱甘肽硫转移酶(GST)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活力发生明显变化。魏塞金等[8]研究发现，高浓度农抗702使种子中的淀粉酶活性和蛋白质含量降低。魏子艳等[9]采用水培法研究发现，培养液中金霉素浓度为70 mg/L时，显著抑制黄瓜芽长。鲍艳宇等[10]研究四环素类抗生素对小麦种子萌发的影响，小麦根伸长抑制率随抗生素浓度升高呈上升趋势。

在充分掌握抗生素对农作物生长机制影响的基础上，人们才能合理使用抗生素，减少过量使用抗生素带来的危害。目前关于抗生素对蔬菜种子萌发的生态毒理机制尚未明确，因此开展此类研究很有必要。基于上述原因，本试验以白菜种子为试材，研究金霉素、土霉素和氯霉素3种常用的抗生素对白菜种子发芽率、发芽势、根长及其体内抗氧化酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验使用的“丰抗80”白菜种子由莱州金源种子有限公司生产，采购于江苏省徐州市食品城种子批发市场。盐酸金霉素(纯度gt;95%，Cas：64-72-2)，土霉素(纯度gt;95%，Cas：79-57-2)，氯霉素(纯度gt;99%，Cas：56-75-7)。

1.2 方法(保湿培养法)

配制1/2 Hoagland溶液，并以此溶液配制不同浓度的抗生素溶液。每种抗生素均设置9种浓度，分别为0，0.5，5，10，20，30，40，50，500 mg/L。选取结构完整、均匀饱满的白菜种子，经过10%的次氯酸钠浸泡10 min，用去离子水清洗3次。

表1 抗生素对白菜种子发芽率和发芽势的影响

处理浓度(mg/L) 氯霉素 金霉素 土霉素 发芽率(%)发芽势(%)发芽率(%)发芽势(%)发芽率(%)发芽势(%)087．33+0．0977．33+0．4987．33+0．0977．33+0．4987．33+0．0977．33+0．490．584．67+0．0980．67+0．0184．00+0．1676．00+0．4886．00+0．0980．67+0．09585．33+0．0976．67+0．3786．67+0．0981．33+0．0587．33+0．0980．00+0．041084．00+0．0080．67+0．0986．67+0．0183．33+0．4188．67+0．0482．00+0．282084．00+0．2874．67+0．0186．00+0．0480．00+0．1688．00+0．2582．67+0．213083．33+0．0175．33+0．4985．33+0．0980．00+0．0487．33+0．0180．67+0．414082．67+0．0976．00+1．2486．00+0．0481．33+0．0186．67+0．0178．00+0．045083．33+0．0974．67+0．3785．33+0．0983．33+0．0986．67+0．0983．33+0．1750068．67+0．09∗∗64．67+0．17∗70．00+0．04∗64．00+0．12∗73．33+0．09∗∗68．00+0．04

注：“*”plt;0.05，“**”plt;0.01。

1) 在直径为9 cm的培养皿中平铺2层滤纸，加入适量新配制抗生素溶液。在培养皿中均匀放入50粒处理后的白菜种子，盖上皿盖，每个处理重复3次[11]。在温度为(25±1)℃的培养箱中，12 h暗培养，12 h光照培养，每天定时记录萌发种子粒数，并适当补充抗生素溶液，保持滤纸和种子湿润，每2 d更换抗生素溶液和滤纸，7 d后结束培养[12-13]。测定在不同抗生素的不同浓度溶液作用下，白菜种子发芽率、发芽势及抗氧化酶活性。

2) 打开种子萌发袋折槽，在种子萌发袋上方纸芯形成的20个凹槽中放置20粒处理后的白菜种子，加入适量新配制的抗生素溶液，将种子萌发袋垂直放置在相应支架上。在温度为(25±1)℃的培养箱中，12 h暗培养，12 h光照培养，每2 d向萌发袋内适当补充抗生素溶液，保持纸芯和种子湿润，7 d后结束培养。计算在不同抗生素的不同浓度溶液作用下，白菜种子根伸长抑制率。

1.3 分析方法

1.3.1 白菜种子发芽率、发芽势及根伸长抑制率的测定

发芽率(%)=供试种子的发芽数/供试种子总数×100%；

发芽势(%)=3 d内供试种子的发芽数/供试种子总数×100%[11]；

根伸长抑制率(%)=(对照组-处理组)/对照组×100%。

1.3.2 酶液的提取

取代表性处理白菜幼苗，用去离子水清洗3次后用液氮冷冻，加入适量预冷至4 ℃的Tris-HCl缓冲液(pH=7.0，内含1 mmol/L EDTA)研磨成匀浆后，置于4 ℃冷冻离心机中，12 000 r/min离心25 min。取其上清液即得粗酶液，用于CAT、SOD、APX、GR活性测定[14-15]。

1.3.3 白菜种子CAT、SOD、APX、GR活性测定

过氧化氢酶(catalase，CAT，EC 1.11.1.6)活性采用紫外可见分光光度法进行测定[16]，30 s读取OD 240 nm值1次，在240 nm处以每分钟吸光值减少0.1的酶量为一个酶活单位[U/(g·min)]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，EC 1.1.15.1.1)活性采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定[16]，在560 nm处以抑制NBT光化还原50%为一个酶活单位(U/g)。测定抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX，EC 1.11.1.11)活力时[14,16]，每隔10 s在290 nm处测定一次吸光值，反应时间为30 s，以每分钟氧化1μmol ASA的酶量为一个酶活单位[μmol/(g·min)]。测定谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR，EC 1.6.4.2)活力时[14,16]，每隔30 s测定OD 340 nm值1次，以每分钟消耗1μmol NADPH的酶量为1个酶活单位[μmol/(g·min)]。

1.4 数据处理

用Microsoft Excel 2010软件对实验测得数据进行处理，并对数据进行单因素方差显著性检验。

2 结果与分析

2.1 抗生素对白菜种子发芽率和发芽势的影响

由表1可看出，3种抗生素浓度≤50 mg/L时，白菜种子发芽率和发芽势无明显变化，即在该实验浓度范围内，3种抗生素对白菜种子萌发无明显抑制或促进作用。由表1可知，用500 mg/L氯霉素处理后，白菜种子发芽率与对照组相比差异极显著，发芽势与对照组相比达差异显著水平。用500 mg/L金霉素处理后，白菜种子发芽率和发芽势与对照组相比均达到差异显著水平。用500 mg/L土霉素处理后，白菜种子发芽率与对照组相比达到差异极显著水平，发芽势与对照组相比差异不显著。

2.2 抗生素对白菜种子根伸长的影响

从图1可以看出，不同浓度、不同种类的抗生素对白菜种子根伸长抑制作用不同。0.5 mg/L氯霉素、0.5 mg/L金霉素、0.5～5 mg/L土霉素对根伸长有促进作用。5 mg/L氯霉素、金霉素开始抑制白菜根伸长，抑制率分别为12.0%、6.0%。在实验浓度范围内，抗生素浓度越大，对白菜根伸长的抑制作用越大。以抗生素浓度为横坐标，以白菜种子根伸长抑制率为纵坐标，得抗生素的回归方程(见表2)。从表2可以看出，抗生素浓度对白菜根伸长抑制率之间存在剂量-效应关系。通过对比3种抗生素对白菜种子根伸长抑制率，可知3种抗生素对白菜种子萌发根伸长的抑制作用强弱顺序为：氯霉素gt;金霉素gt;土霉素(图1)。

图1 抗生素对白菜种子根伸长抑制率的影响

表2 抗生素与小白菜种子根伸长抑制率的相关性

抗生素根伸长抑制率回归方程R2p氯霉素I=0．1417C⁃0．1210．8557∗∗金霉素I=0．0682C⁃0．24120．8753∗∗土霉素I=0．054C⁃0．19870．8083∗

注：I表示根长抑制率，C表示抗生素浓度，“*”plt;0.05，

“**”plt;0.01。

2.3 抗生素对白菜幼苗抗氧化酶活性的影响

白菜幼苗体内CAT、SOD、APX、GR 4种抗氧化酶活性测定结果如图2所示，同一抗生素不同浓度处理之间抗氧化酶活性差异显著(plt;0.05，数据未列出)。氯霉素和土霉素在低于50 mg/L的浓度范围内，随着抗生素浓度增加，白菜幼苗体内CAT、SOD、APX、GR的活性呈现上升趋势，当抗生素浓度为500 mg/L时，CAT、SOD、APX、GR的活性显著下降，组间处理差异显著。随着土霉素浓度增加，白菜幼苗体内SOD活力呈现下降趋势，而CAT、APX、GR活力呈现先升高后下降的趋势。

3 讨 论

采用保湿培养法，通过测定在不同浓度的氯霉素、金霉素和土霉素作用下，白菜种子萌发情况及白菜幼苗体内的抗氧化酶活力，观察抗生素对白菜种子萌发期的影响。结果表明，3种抗生素浓度为0.5～50 mg/L时，对白菜种子发芽率无明显抑制或促进作用，当抗生素浓度升高至500 mg/L时，种子发芽率受到明显抑制。3种抗生素浓度为0.5～50 mg/L时，对白菜种子发芽势无明显影响，在抗生素浓度为500 mg/L时，种子发芽势才受到抑制。

图2 抗生素污染对小白菜体内抗氧化酶的影响

种子发芽率和发芽势可以作为研究抗生素对种子萌发影响的表观参数，但不能全面反映种子萌发过程中的生理活性变化。白菜种子的根长可以作为种子生长的表观参数，白菜幼苗根部直接与外部环境接触，对其中的污染物响应较为迅速，因此，种子萌发实验经常将根长作为衡量植物受外界污染物胁迫的表观生理参数[17-19]。较低浓度的抗生素(0.5 mg/L氯霉素、0.5 mg/L金霉素、0.5～5 mg/L土霉素)对种子根伸长有一定促进作用，这与林琳等[20]的实验结果有一定相似性。当抗生素浓度在白菜种子体内的积累超出其生理承受范围，白菜种子根伸长受到明显抑制，且根伸长抑制率随抗生素浓度增大而升高。由抗生素浓度和种子根伸长抑制率之间的回归方程可知，抗生素浓度对白菜根伸长抑制率之间存在剂量-效应关系，此外，由于3种抗生素的分子结构和理化性质之间存在差异，它们对白菜种子的影响机理不同。3种抗生素对白菜种子根伸长抑制作用的强弱顺序为：氯霉素gt;金霉素gt;土霉素。

植物体在其正常代谢过程中会产生活性氧(ROS)，许多环境因子可诱导植物体内活性氧浓度改变，植物的抗逆性和抗氧化能力与植物体内的抗氧化酶系统的保护功能有密切的关系[21]。CAT、SOD、APX和GR是植物体内重要的抗氧化酶保护系统中的主要酶类。CAT可以清除ROS[14,22]。SOD能够清除氧自由基，与CAT共同作用保护植物免受损伤[14,23]。APX在抗坏血酸-谷胱甘肽循环中有重要的调节H2O2作用[24]。谷胱甘肽还原酶可以维持植物体内还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽相对含量[25]，并与APX共同作用清除H2O2。通过测定3种抗生素在实验设置浓度范围内的白菜幼苗抗氧化酶活性，发现抗生素浓度对白菜幼苗的抗氧化酶活力的影响表现为低浓度促进而高浓度抑制。由此说明，在低浓度抗生素溶液的诱导下，植物本身的抗氧化酶系统被激活，从而减少ROS对机体的损伤。但随着抗生素浓度增大，植物体内的抗氧化酶活性受到抑制，原因可能是抗生素浓度超出植物体的承受范围，使植物体的抗氧化酶系统受到不同程度的破坏，降低了抗氧化酶活力，从而影响植物体的正常生长。

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(本栏目责任编辑：曾 勇)

Effect of Three Kinds of Antibiotics on the Germination ofChinese Cabbage Seeds

LIMeng,YANGLei,JIJiannan,FENGXiaona,HUANGRong,WENHongyu,GAOXiali,CAOLufen

2016-10-27

李 萌(1994—)，女，江苏徐州人；本科在读，研究方向：植物生理学；E-mail:2057680405@qq.com。

温洪宇(1973—)，男，副教授，博士，硕士生导师，主要从事环境微生物学研究；E-mail:wenhy2007@126.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.102

S 634

A

1001-4705(2017)03-0102-04