SNP对盐胁迫下南瓜种子萌发和幼苗光合碳代谢的影响

，

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江省抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室， 黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔市卫生监督所， 黑龙江 齐齐哈尔 161005)

土壤盐渍化作为一种非生物胁迫因子，已成为除干旱外影响作物生长发育、导致减产的第二大生态逆境。全球不同类型的盐碱地达10亿hm2，大约占可耕地面积的10%，我国的东北、西北、华北、新疆、甘肃等干旱和半干旱地区，盐荒地和盐渍化耕地面积达2×107hm2和6.7×106hm2，大约占可耕地面积的25%[1]。盐害使植物水分平衡失调、物质代谢紊乱、光合机构受损。但植物细胞在长期进化过程中，也形成了一定的耐盐和抗盐机制。植物在幼苗阶段对环境中的逆境信号感受最为敏感，而此时也是对其进行代谢调控的最佳生理活跃期。通过外源调控措施增强光合碳代谢，为氮代谢提供充足的碳架和还原力是改善和减轻盐害的重要途径。一氧化氮(NO)作为植物组织中广泛存在的内源性信号分子，不仅参与了植物从种子萌发、形态建成、呼吸代谢、衰老和细胞程序性死亡(PCD)等生理过程，而且在植物对逆境胁迫的应答中发挥了重要的调节作用[1]。研究证实，外源NO通过提高抗氧化酶活性和抗氧化剂含量，降低活性氧(ROS)和过氧化产物丙二醛(MDA)的积累，增强了棉花(GossypiumhirsutumL.)幼苗的抗冷性[2]；缓解镉胁迫对玉米(Zeamays)幼苗造成的生长抑制，增强其对镉毒害的抗性[3]；诱导盐胁迫下水稻(Oryzasativa)叶片的抗氧化酶活性，增加耐盐相关基因的转录本[4]。而NO对盐胁迫下南瓜幼苗早期碳代谢的影响未见报道。南瓜作为粮、菜、油、饲兼用作物，在我国的三北地区广泛种植，尤其在东北，耕作层土壤的返盐期和南瓜生长发育的苗期在时间上同步与叠加，造成苗期盐害。本试验以硝普钠为外源分子信号——NO，研究其对盐胁迫下供试材料南瓜种子萌发和幼苗早期碳代谢及相关酶活性的影响，探讨外源NO缓解南瓜盐胁迫的生理机制，探索提高南瓜耐盐性的途径。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试南瓜品种为银辉2号[Cucurbitamoschata(Duch.)Yinhui2]，由齐齐哈尔市种子经销处提供。NO供体为硝普钠[Na2Fe(CN)5](Sodium nitroprusside，SNP)，购自Sigma公司，纯度为98.5%。先配制成100 mmol/L母液，4 ℃保存，用时按所需浓度稀释[5]。

1.2 实验设计

1.2.1 种子萌发胁变设计

试验于2014年3—7月在齐齐哈尔大学生化实验室进行。精选大小和饱满度一致的南瓜种子，先经0.1%的KMnO4消毒后，根据预试验结果，用0，50，150，250 mmol/L的NaCl(对照、轻、中、重度胁迫)分别复合0，30，90，150μmol/L的SNP浸种6 h。试验的10个处理分别以(N0S0、N0S30、N0S90、N0S150、N50S30、N50S90、N50S150，N150S30、N150S90、N150S150……N250S150)表示，将各处理置于人工气候培养箱中(28 ℃，13 h/11 h光周期)发芽(30粒/皿)。为保持处理浓度恒定，各处理液平行定量补充。以胚根长2～3 mm为发芽标准，每天记载发芽种子数，第5天进行种子发芽参数的测定。

表1 外源NO对NaCl胁迫下南瓜种子萌发的影响(平均数±SE)

处理 发芽率 发芽势 N0N50N150N250N0N50N150N250S087.49±1.38b88.16±3.67c57.32±1.02b29.41±2.04b47.13±2.59c39.12±0.87b30.51±2.64b26.34±1.07abS30 88.11±2.14b91.35±1.87b60.55±2.91b33.30±1.09ab 53.16±1.71b42.38±2.75b33.54±0.85b29.42±3.01aS90 89.95±2.37a93.41±1.07a76.34±1.98a40.69±2.03a56.94±2.88a48.26±1.96a41.88±2.77a28.87±0.92aS15084.67±0.90c75.79±2.34d51.49±0.89c20.08±1.22c45.89±1.58c29.78±2.00c20.175±0.59c19.56±2.64c

注：表中同列不同小写字母表示p<0.05水平差异显著。下同。

1.2.2 SNP浓度的筛选和苗期胁变处理

以预试验中150 mmol/L的NaCl为影响种子萌发和幼苗生长的致害处理，分别添加0，30，60，90，120，150，180μmol/L的SNP，培养4 d后，南瓜幼苗相对生长量呈现随SNP浓度递增而先升后降的变化趋势，其中选出相对生长量最大的90μmol/L SNP作为处理浓度。每处理重复3次，每次重复60粒种子。

将催芽后的种子播于细砂经高温灭菌(130 ℃，3 h)的花盆中(12粒/盆)，于实验室室温下(23 ℃±2 ℃)自然光照培养，出苗后以Hongland营养液浇灌。待幼苗至3叶1心时，每盆保留生长整齐一致的幼苗8株，共30盆[5]。

试验共设4个处理：分别为处理Ⅰ(对照)：Hongland营养液(ck)；处理Ⅱ：Hongland营养液+150 mmol/L的NaCl；处理Ⅲ：Hongland营养液+90μmol/L的SNP；处理Ⅳ：Hongland营养液+150 mmol/L的NaCl+90μmol/L的SNP。每天用相应的处理液定量浇灌2次(100 mL/盆/次)。分别于处理后的第4、8、12天进行光合碳代谢相关指标的测定，每次取样4株，3次重复，随机排列。

1.3 测定项目和方法

1.3.1 种子发芽参数的测定

发芽率(%)=(第5天发芽种子总数/供试种子总数)×100%；

发芽势(%)=(第3天发芽种子总数/供试种子总数)×100%。

1.3.2 光合色素含量的测定

用乙醇丙酮混合液暗提取24 h，测定663、645、470 nm的光吸收值，计算叶绿素和类胡萝卜素含量[6]。

1.3.3 碳代谢及相关酶活性的测定

可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法[6]；1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPcase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPcase)活性分别采用偶联法和比色法测定[7]。

1.4 统计分析

试验数据用Microsoft Excel 2003软件进行统计，所有数据以平均数±标准差表示，用SPSS 17.0软件进行统计分析，用Duncan新复极差法进行多重比较(p<0.05)[5]。

2 结果与分析

2.1 外源NO对NaCl胁迫下南瓜种子萌发的影响

表1显示，南瓜种子发芽率和发芽势均随NaCl浓度的升高而降低，N150S0和N250S0处理，发芽率分别降至对照的65.52%和33.61%，发芽势降低了35.26%和44.11%(p<0.05)，说明中、重度盐害显著抑制了南瓜种子的萌发。复合30～90μmol/L的SNP浸种处理，不同程度提高了中、重度盐胁迫下南瓜种子的发芽率，N150S30、N150S90和N250S30、N250S90处理发芽率分别较对照提高了5.64%、33.18%和13.22%、38.35%，90μmol/L的SNP处理均达差异显著水平(p<0.05)。N150S90处理，南瓜种子发芽势达对照的1.37倍(p<0.05)，但对重度胁迫处理，发芽势仅提高了9.61%，未达到差异显著水平(p<0.05)。复合高剂量SNP(150μmol/L)浸种，发芽率和发芽势呈同步下降趋势。说明适宜浓度外源SNP可以有效缓解中度盐害对南瓜种子萌发造成的伤害，促进种子萌发，但过高浓度则产生抑制效应，加重盐害。

2.2外源NO对NaCl胁迫下南瓜幼苗叶片叶绿素、类胡萝卜素含量的影响

叶绿素是光合作用中最有效和最重要的色素，其含量在一定水平上影响南瓜苗期同化外源物质和进行光合积累的能力，并最终影响南瓜产量[5]。由图1可见，正常生长条件的南瓜叶片叶绿素和类胡萝卜素含量随幼苗生长而逐渐升高。单纯盐胁迫，叶绿素和类胡萝卜素含量均显著下降。处理4 d时，分别较对照下降了21.88%和24.64%，处理结束后，检出率仅为对照的72.59%和62.82%(p<0.05)，说明盐胁迫使南瓜叶片的光合机构受损，电子传递和光合磷酸化的偶联机制遭到破坏。且从变化趋势上看，处理达8 d时，叶绿素和类胡萝卜素含量仍为正增长，增幅分别为11.54%和9.62%；处理后12 d时，已呈负增长态势，分别较8 d处理下降了7.39%和14.03%，但叶绿素含量仍高于处理初期，而类胡萝卜素含量仅为初期处理的94.23%。单纯SNP处理，显著提高了光合色素的含量水平。但两者不同的是，叶绿素含量在处理初期和中期(4～8 d)显著升高，分别比对照增加了12.02%和11.74%(p<0.05)，此后升幅减小(8.11%)但仍显著高于对照；而类胡萝卜素含量则在(4～8 d)时与对照差异不显著，后期大幅升高，增幅达23.08%(p<0.05)。复合SNP后，显著提高了盐害下南瓜叶片的光合色素含量。处理后4 d时，叶绿素和类胡萝卜素含量分别比盐胁迫提高了12.64%和21.15%；处理结束时，增幅已分别达到盐害的42.02%和85.71%(p<0.05)。

图1 外源NO对盐胁迫下南瓜幼苗叶片光合色素含量的影响

图2 外源NO对盐胁迫下南瓜叶片可溶性糖含量(a)、RuBPcase(b)和PEPcase(c)活性的影响

2.3外源NO对NaCl胁迫下南瓜幼苗叶片可溶性糖含量、RuBPcase和PEPcase活性的影响

150 mmol/L NaCl胁迫，南瓜叶片可溶性糖含量在处理初、中期(4～8 d)显著高于对照，随幼苗生长，处理结束时已降至对照水平。单纯SNP处理，可溶性糖含量随幼苗发育而升高，各处理时段均显著高于对照。SNP复合处理4～8 d，可溶性糖含量分别较盐害下降低了18.86%和13.33%，后期比盐胁迫提高了21.56%。说明外源NO调控了碳流运转，将前期渗透调节积累的糖经苹果酸-草酰乙酸(MAL-OAA)穿梭，为谷氨酸的转化提供碳架——α-酮戊二酸(α-KG)的同时，将产生的NADH通过迅速还原NO3-，促进了碳流由碳代谢向氮代谢的转换。RuBPcase是催化光合碳代谢中CO2固定的关键酶，其活性高低对光合速率产生重要影响。PEPcase是催化三羧酸循环回补反应的重要酶。正常生长条件下，RuBPcase、PEPcase活性随南瓜幼苗生长而提高；SNP不同程度提高了RuBPcase活性，但4～8 d时与对照差异不显著，后期处理比对照高18.31%，达差异显著水平，而PEPcase活性则与对照无差异。盐胁迫使RuBPcase活性呈逐渐下降的趋势。PEPcase活性在处理初期较对照下调了35.76%，8 d处理酶活略有回升，但处理结束时PEPcase活性仍下降至仅为对照的51.74%；SNP复合后，RuBPcase活性增幅由单纯SNP处理的18.60%上升到复合盐害逆境下的82.35%、PEPcase活性则由初始处理的29.19%进一步上调至处理结束时的46.47%(图2)。说明NO作为分子信号能有效启动南瓜幼苗对逆境的应答，有助于提高盐胁迫下南瓜幼苗光合碳同化能力的提高和碳流的转化。

3 讨 论

从自由基伤害学说的观点出发，盐害逆境下，南瓜种子和幼苗ROS的产生和清除系统失衡，ROS的积累诱发膜脂过氧化，叶绿体的类囊体膜是对环境最为敏感和脆弱的生物膜，盐害造成叶绿体膜结构受损，叶片的光合损伤导致2种光和色素含量下降。此外，盐环境下叶绿素酶活性升高，加速叶绿素的降解也是导致光和色素含量下降的重要原因。外源SNP显著提高了盐害环境下南瓜叶片的叶绿素及类胡萝卜素含量，说明SNP作为活性氮能有效修复类囊体膜的结构损伤，促进膜蛋白复合体的稳定，降低叶绿素酶的活性，缓解了光合色素的下降，增强了南瓜幼苗光合碳代谢的能力。试验结果表明，90μmol/L的SNP浸种，能显著提高盐胁迫下南瓜种子的发芽率和发芽势，显著缓解了盐害导致的幼苗可溶性糖堆积，提高了碳同化酶RuBPcase、PEPcase的活性，光合碳同化的正常进行为氮代谢提供了丰富的碳架和还原力，促使了碳流向氮代谢方向运转，提高了幼苗的耐盐性，促进了南瓜幼苗的早期发育和形态建成。