EMS诱变处理芸豆(Phaseolous vulgaris L.)种子条件分析

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(1.杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室/农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室， 山西 太原 030031；2.山西省农业科学院玉米研究所， 山西 忻州 034000；3.山西省农业科学院农作物品种资源研究所， 山西 太原 030031)

芸豆(PhaseolusvulgarisLinn.sp.)学名菜豆，是普通菜豆(如小黑芸豆、小白芸豆等)和多花菜豆(如圆奶花芸豆H、N、D、X等)的总称[1]。芸豆在我国种植面积广泛[2]，芸豆籽粒营养丰富，富含蛋白、碳水化合物、膳食纤维及多种人体必需的维生素和矿物质[3]，食药同源，是现代功能食品开发的重要资源[4]。然而，在芸豆的长期育种过程中，筛选和育种目标太过单一，造成了在选育过程中遗传基础狭窄的限制，所以寻找打破狭窄的遗传基础的方法，加快芸豆的种质创新成为需要解决的问题。化学诱变具有特异性强，诱变后代较易稳定遗传的特点。化学诱变是指利用化学诱变剂处理植物材料，以诱发可以遗传的突变，然后根据育种目标，对这些变异进行鉴定、选择和固定，育成需要的遗传稳定的品系或品种[5]。通过化学诱变已得到一些有价值的材料。Gustafsson等[6]用芥子气处理大麦获得突变体，Laudencia-Chingcuanco等[7]从创建的六倍体小麦EMS突变体库中得到一个突变株，对这一突变株进行分离得到Dy 10和AX 1高分子质量谷蛋白亚基缺陷突变株。其中甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate,EMS)目前在作物诱变育种中具有很高的应用价值，因其具有成本低、易操作、突变率高、染色体畸变相对较少、突变多为点突变且显性突变率高等优点[8]，使得EMS在作物化学诱变育种中应用效果明显，得到了一致公认。

EMS分子具有多个活性烷基，可置换碱基中的氢原子，从而起到对碱基的烷化作用。EMS烷化作用主要发生于DNA的鸟嘌呤(G)上，烷基化的鸟嘌呤不再与胞嘧啶配对，而与胸腺嘧啶配对，导致G/C突变为/T，利用EMS诱变构建突变体库已成为获得突变体、创新种质和育种的有效手段[9]。据IAEA/FAO突变品种数据库最新统计，截止2017年10月，联合编入目录的数据库中有71个国家3 271个植物突变品种，其中通过EMS育成的品种有106个，我国利用EMS育成品种5个。各国学者对EMS诱变作物种子的适宜剂量进行了广泛的研究。选择适宜的剂量(剂量=处理液剂量×处理时间)是得到理想突变株、获得最佳突变率、提高突变频率的关键[10]。不同作物都有一定范围的适宜剂量，在适宜剂量范围内，能更高效地产生突变体，并保持原有的优良性状[11]。Vicente-Doleara等利用不同浓度诱变西葫芦，研究表明，致死率达40%，65 mmol/L的EMS处理液为最佳诱变处理条件[12]。胡志峰等研究发现，0.7%EMS诱变处理9 h和0.9%EMS诱变处理6 h的组合为金花菜种子最佳诱变条件[13]；王学征等研究表明，EMS处理浓度1.0%、诱导时间9 h是西瓜品系“W 1-17”种子最佳诱变条件[14]；孔德培等研究表明，0.6%EMS溶液对石系亚1号棉花种子处理8 h，诱变效果最佳[15]。詹远华等研究表明，EMS处理豇豆种子，剂量以浓度0.3%EMS、时间3～4 h为宜。[16]

IAEA/FAO突变品种数据库可见各国育成大豆、绿豆等豆类突变品种304个，俄罗斯育成芸豆突变品种2个(Mukhranula，Svetlaya)，但数据库中未见有利用EMS育成的芸豆品种。利用EMS对芸豆进行突变筛选和诱变育种的研究未见报道。本试验以诱变剂EMS诱变处理芸豆品种“英国红”的纯系干种子，采用5个EMS诱变浓度(0.0%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)，5个诱导时间(0，6，8，10，12 h)，分析诱变后的种子发芽率、相对出苗率和相对成苗率，确定EMS对芸豆种子的最佳诱变条件，以期为芸豆EMS诱变育种技术的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试芸豆种

试验材料为山西省农业科学院玉米研究所杂粮研究室从芸豆品种“英国红”连续定向选择出的纯系干种子，种子饱满、圆润、无破损、色泽与大小均匀一致。

1.1.2 供试试剂

EMS诱变剂(甲基磺酸乙酯)原液购于山西基诺泰克生物科技有限公司，由美国SIGMA公司生产。

1.2 试验方法

参考国内外学者应用EMS对蓖麻[17]、大豆[18]、小豆[19]、芝麻[20]、大麦[21]的诱变剂配置方法及处理条件，选择本试验中EMS处理的浓度和时间。试验设5种浓度梯度×5种时间水平，共25个处理，每处理3次重复。5种浓度梯度：0.0%EMS，0.4%EMS，0.6%EMS，0.8%EMS，1.0%EMS(因素A 1-A 5)。浸种时间：0，6，8，10，12 h(因素B 1-B 5)。

试验设不浸种不做EMS处理的芸豆做对照。

1.2.1 不同浓度EMS溶液的配置

EMS溶液浓度配置见表1。

表1 EMS溶液浓度配置

溶液浓度原液95%酒精0.01mol/L磷酸缓冲液(pH=7.2)0.0(ck)005000.4284900.6374900.8464901.055490

1.2.2 种子处理

将芸豆种子预先划破种皮，用蒸馏水浸泡10 min，然后将浸泡过的种子擦干，100粒为一个处理，共60个处理；各处理在通风橱中浸入500 mL不同浓度EMS溶液中，然后在28 ℃摇床上分别震荡6，8，10，12 h。浸种结束后，在通风橱中每个处理加入5%的1 mol/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)1 000 mL，混匀后，将溶液倒入废液筒，将各处理种子蒸馏水冲洗10 min后，平铺在湿润滤纸上，稍干后，种子直接种在砂床发芽盒中，28 ℃培养箱内催芽；废液筒中废液用20%的1 mol/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液中和后，丢弃。

1.2.3 催芽方法和发芽率测定

EMS诱变处理且种子稍干后，将各处理种子及对照利用砂盒发芽，做好标记，置于(25±1)℃光照培养箱中。催芽7天后统计发芽率。

发芽率(%)=(供试种子的发芽数/供试种子总数)×100%。

1.2.4 测定成苗率的指标与方法

发芽试验结束1周后将出苗种子移栽于温室，移栽20 d后统计成苗率，计算相对成苗率。

相对出苗率(%)=(处理的出苗率/对照出苗率)×100%。

1.2.5 数据处理

采用DPS 7.5软件对试验数据进行处理和分析。采用Excel 2007软件进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 EMS诱变处理对芸豆种子发芽率的影响

2.1.1 EMS不同浓度对芸豆种子发芽率的影响

如表2和图1所示，未经EMS处理与缓冲液浸种的芸豆发芽率为100%，经6，8，10，12 h缓冲液浸种未经EMS溶液处理的芸豆发芽率分别为60%、51%、29%、19%，说明磷酸缓冲液浸种时间长短与芸豆发芽率存在显著的负相关。当时间一定时，EMS不同浓度处理对芸豆的发芽率有不同程度的影响。

6 h诱导时间下，0.4%、0.6%、0.8%、1.0%EMS的发芽率分别为74%、65%、66%、70%，高于6 h浸种未经EMS处理的发芽率为60%，各浓度EMS处理芸豆发芽率显著高于对照(p<0.05)，说明6 h不同EMS浓度均对芸豆发芽率有提升作用，6 h 0.4%EMS提升作用较大。

12 h诱导时间下，0.4%、0.6%、0.8%、1.0%EMS的发芽率分别为10%、6%、6%、8%，远低于12 h浸种未经EMS处理的发芽率(19%)，各浓度EMS处理的芸豆种子发芽率显著低于对照(p<0.05))，说明12 h诱导时间条件下不同EMS浓度对芸豆发芽率有显著的抑制作用。

8 h诱导时间下，0.6%EMS的发芽率显著低于8 h浸种未经EMS处理的发芽率(p<0.05)，1.0%EMS的发芽率显著高于对照(p<0.05)，说明8 h诱导条件下，有提升有抑制。

10 h诱导时间下，0.4%、0.8%EMS的发芽率分别为33%、34%，显著高于10 h浸种未经EMS处理的发芽率(p<0.05)；1.0%EMS处理发芽率显著低于对照(p<0.05)，产生抑制作用。所以，在芸豆低诱导时间条件下，EMS不同浓度对发芽率有显著的提升作用；在芸豆高诱导时间条件下，EMS不同浓度对发芽率有显著的抑制作用；在本试验中8 h和10 h诱导条件下，EMS对芸豆发芽率的影响呈现出不规则的抑制和提升作用。

表2 不同EMS处理组合对芸豆种子发芽率的影响

浓度(%)处理时间(h)06810120100a60d51bc29b19a0.4100a74a49c33a10b0.6100a65c39d27b6c0.8100a66c53ab34a6c1.0100a70b54a9c8bc

图1 不同EMS浓度对芸豆种子发芽率的影响

2.1.2 EMS不同诱导时间对芸豆种子发芽率的影响

未经EMS处理与缓冲液浸种的芸豆发芽率为100%。由表2和图2可知，0.4%EMS浓度条件下，经6，8，10，12 h诱导，100%芸豆发芽率逐步下降为74%、49%、33%、10%。0.6%EMS浓度条件下，经6，8，10，12 h诱导，100%芸豆发芽率分别逐步下降为65%、39%、27%、6%。0.8%EMS浓度条件下，经6，8，10，12 h诱导，100%芸豆发芽率分别逐步下降为66%、53%、34%、6%。1.0%EMS浓度条件下，经6，8，10，12 h诱导，100%芸豆发芽率分别逐步下降为70%、54%、9%、8%。说明当EMS浓度处理一定时，随着诱导时间的增大，对芸豆发芽的抑制作用越大，芸豆的发芽率均呈现显著下降的趋势。

图2 EMS不同诱导时间对芸豆种子发芽率的影响

2.1.3 EMS浓度和诱导时间对发芽率的影响

清水与缓冲液浸种对作物种子发芽率有显著影响。未经EMS处理与缓冲液浸种的芸豆发芽率为100%，经6，8，10，12 h缓冲液浸种未经EMS溶液处理的芸豆发芽率分别为60%、51%、29%、19%。这4个芸豆发芽率是磷酸盐缓冲液浸泡时间所致，与EMS并无关系。如把诱导时间B 2作为先决条件，EMS浓度A 2作用于芸豆，使得芸豆发芽率由60%变为74%，涨幅为23.33%；而如把EMS浓度A 2作为先决条件，诱导时间B 2使得芸豆发芽率由100%变为74%，减幅为26%。26%>21.31%，可视为A 2 B 2共同作用于芸豆，诱导时间B 2对芸豆发芽率的作用大于A 2。表3为先决条件不同时，EMS浓度或诱导时间对芸豆发芽率的影响(如B 2 A 2代表6 h 0.4%EMS，表示先决条件为浸种6 h，芽率影响由0.4%EMS所致；A 2 B 2表示先决条件为0.4%EMS，芽率影响由浸种6 h所致)。

从表3可看出，EMS浓度为先决条件，芽率的涨幅最小为-94%，最大为-26%，诱导时间对芸豆种子发芽率均是抑制作用；诱导时间为先决条件，芽率的涨幅最小为-70.00%，最大为23.33%，仅B 2 A 2，B 2 A 3，B 2 A 4，B 2 A 5，B 3 A 4，B 3 A 5，B 4 A 2，B 4 A 4等处理对芸豆发芽率有促进作用。组合B 2 A 2，B 4 A 2涨幅相对较大。

表3 不同处理条件下芸豆发芽率的涨幅

处理涨幅(%)处理涨幅(%)A2B2-26.00B2A223.33A2B3-35.00B2A310.00A2B4-33.00B2A48.33A2B5-30.00B2A516.67A3B2-51.00B3A2-5.88A3B3-61.00B3A3-25.49A3B4-47.00B3A41.96A3B5-46.00B3A53.92A4B2-67.00B4A221.43A4B3-73.00B4A3-7.14A4B4-66.00B4A417.86A4B5-91.00B4A5-71.43A5B2-90.00B5A2-55.00A5B3-70.00B5A3-70.00A5B4-94.00B5A4-65.00A5B5-92.00B5A5-55.00

表4 EMS不同浓度和处理时间对芸豆种子萌发的影响

处理浓度处理时间(h)发芽率(%)相对出苗率(%)相对成苗率(%)A1B10.00100aA2B10.40100aA3B10.60100aA4B10.80100aA5B11.00100aA2B20.4674b96.51b94.40bA5B21.0670c89.83e88.65eA4B20.8666d91.17de90.12dA3B20.6665d93.50cd93.50cdA1B20.0660e100a100aA5B31.0854f72.83g72.65gA4B30.8853fg90.37e90.30eA1B30.0851gh100a100aA2B30.4849h95.5bc95.44beA3B30.6839i97.00b96.41bA4B40.81034j83.83f82.65fA2B40.41033j93.57cd93.50cdA1B40.01029k100a100aA3B40.61027k91.03de90.12deA1B50.01219l100a100aA2B50.41210m90.87de89.88fA5B41.0109m70.00g69.5gA5B51.0128mn80.54gh78.6gA4B50.8126n73.5g76.89gA3B50.6126n72.97g68.98g

2.2 EMS诱变处理对芸豆种子出苗的影响

EMS浓度和处理时间影响芸豆种子的发芽率，在0.05水平上差异显著。相对出苗率和相对成苗率则影响不大。结果表明，不同的EMS浓度，不同时间的处理以及两者互作的因素上对芸豆的种子萌发呈显著影响(p<0.05)。一般认为，经过EMS诱变处理后植株存活50%的剂量(即半致死剂量LD50)为诱变敏感性指标，为可遗传变异应该吸收的能量阙值，也是最佳诱变剂量[22]。结果表明，A 5 B 3，A 4 B 3处理为芸豆种子EMS处理的适宜条件，其中0.8%EMS浓度处理8 h为最佳诱变条件。

3 讨 论

EMS诱变处理对芸豆籽粒发芽有显著的抑制作用。不同浓度的EMS对芸豆籽粒发芽抑制的时间效应明显，6 h处理组，芸豆发芽率为0.6%～0.8%，EMS浓度间差异不显著，发芽率为0.4%～0.6%，EMS浓度间差异显著(p<0.05)。8 h处理组，芸豆发芽率为0.4%～0.8%，EMS浓度间差异显著(p<0.05)，在0.8%～1%EMS浓度间没有显著性差异。不同EMS处理时间对芸豆种子发芽抑制的浓度效应明显。在0.4%～0.8%EMS处理浓度条件下，芸豆籽粒发芽率在6～12 h处理组间呈显著差异(p<0.05)，在0.8%以上高浓度EMS处理浓度条件下，芸豆籽粒发芽率在6～10 h处理组间呈显著差异(p<0.05)，在10～12 h处理组间没有显著性差异。由于不同的EMS浓度，处理时间和两者间的互作效益都在影响着芸豆种子的萌发和出苗成苗情况。以EMS浓度作为先决条件，诱导时间对芸豆发芽率均是抑制作用，以处理时间为先决条件，不同浓度的EMS处理对芸豆发芽有抑制也有促进。两者相比，EMS诱变时间对芸豆发芽率的抑制效应大于诱变浓度。这与胡志峰等[14]的研究结果不一致，可能是互作效应在不同作物间的影响效果不同导致。

EMS处理对育种材料的选育和创新种质资源具有重大意义，而确定其最佳诱变条件成为了关键。不同作物对EMS的敏感性不一样，用的浓度低，处理时间短则变异效应不明显，所用EMS剂量过高，诱变处理时间太长，则容易导致作物致死速率加快，也不利于获取目标材料，因此，确定最佳诱变条件则至关重要。孔德培等[23]利用0.6%EMS，8 h处理亚洲棉种子构建了EMS种子突变库。穆国俊等[24]利用0.5%EMS，4 h处理陆地棉冀棉20，获得了纤维改良突变体材料。通过筛选出最适宜的EMS诱变条件对EMS诱变构建芸豆突变体同样具有指导意义。目前已经在拟南芥[25-26]、水稻[27]、大豆[28]等作物中构建了突变库。但是在芸豆中的EMS诱变处理还未见报道。本研究中采用5个EMS诱变浓度(0.0%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)，5个诱导时间(0，6，8，10，12 h),分析诱变后的种子发芽率，最终筛选出对芸豆种子适宜的诱变条件是0.8%EMS浓度和8 h处理时间。

4 结 论

EMS诱变处理对芸豆发芽率有显著的抑制效应；EMS诱变浓度对芸豆发芽率的抑制效应小于诱导时间；EMS诱变处理对芸豆的相对出苗率和相对成苗率无显著影响；0.8%的EMS诱变浓度和8 h的诱导时间组合，是芸豆种子的最佳诱变条件。

现如今，EMS化学诱变技术和分子标记相结合用于寻找突变位点和基因定位[29]，通过该技术可以进一步研究芸豆领域的化学诱变，有必要结合相关基础理论知识从宏观到微观从细胞到分子，从表型到机理去研究芸豆，以便通过EMS诱变芸豆拓宽芸豆的种质资源，构建突变体库。