睾酮对梅花鹿鹿茸间充质细胞增殖与分化的影响

姚雪原，李柏余，张巧玲，岳占碰，杨占清，郭 斌

(吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

鹿茸角是哺乳动物唯一每年可进行周期性脱落和再生的雄性附属器官，再生过程围绕其位于头部顶端的生长中心进行[1]。处于快速生长阶段的鹿茸，其间充质层细胞的分裂增殖发挥主要作用[2]。该时期内的茸角生长非常迅速，细胞增殖速度远超某些癌细胞[3]，但该过程却能准确无误地进行而不发生癌变，因此鹿茸角可作为理想的动物模型应用于再生医学研究领域。

睾酮(testosterone，T)作为哺乳动物体内最主要的雄激素，可通过与雄激素受体(androgen receptor，AR)结合来发挥作用，参与骨骼的生长和重塑过程[4]。有研究表明，鹿角的再生过程受体内睾酮含量的调节[5]。鹿血清中的睾酮含量在茸角再生过程中呈现周期性的变化，睾酮质量浓度在鹿茸角早期生长过程中维持较低水平，在茸皮脱落和鹿角骨化过程中迅速增加，并在发情期达到最大值，当睾酮含量降低到特定阈值时，触发茸角脱落并进行新一轮的茸角再生[6]。据报道，睾酮对鹿茸角顶端细胞具有诱导增殖和分化的作用[7]。而间充质细胞是茸角顶端重要的一种细胞，但有关睾酮在鹿茸间充质细胞增殖与分化中的作用目前尚不清楚。本试验通过原位杂交检测梅花鹿茸角中AR的表达情况，体外分离培养鹿茸间充质细胞，经适当质量浓度的睾酮作用后，分别采用MTS和荧光定量PCR方法，研究睾酮对鹿茸间充质细胞增殖与分化的影响，为进一步阐明睾酮在茸角再生过程中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验细胞试验所用的细胞为鹿茸间充质细胞，取自2～3岁健康雄性梅花鹿生长约60 d的鹿茸角。

1.2 主要试剂DMEM/HIGH GLUCOSE培养基购自康宁公司；胎牛血清(FBS)购自ScienCell公司；胰蛋白酶购自AMRESCO公司；Ⅰ型胶原酶购自Worthington公司；睾酮购自MERCK公司；荧光定量试剂盒和地高辛RNA标记试剂盒购自Roche公司；凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自ABI公司；MTS细胞增殖试剂盒购自BioVision 公司；TRIzol试剂盒购自MRC公司。

1.3 鹿茸间充质细胞的分离培养将体外分离的鹿茸间充质组织碎块用含双抗的PBS清洗后，Ⅰ型胶原酶消化并离心，获取含有鹿茸间充质细胞的悬液。将细胞悬液均匀接种于培养瓶中，获得原代培养的鹿茸间充质细胞，经0.25%胰酶消化、液氮冻存后用于后续的试验。

1.4 梅花鹿AR探针的制备及原位杂交根据GenBank中已有的相似种属动物AR基因序列设计合成引物。AR正向引物P1：5′-TCTCCGGAAATGCTATGAAG-3′,反向引物P2：5′-TCCAGGAGTACTGAATGACT-3′；扩增片段大小为380 bp。提取鹿茸组织的总RNA，经反转录、PCR扩增和提纯后，将其产物与pGEM-T载体连接，利用PCR和基因测序鉴定重组质粒的插入方向。正义和反义cRNA探针的制备依据Roche公司地高辛RNA标记(T7/SP6)试剂盒说明进行。原位杂交中涉及的相关试剂的配制和具体步骤参照本实验室已有方法[8]。

1.5 MTS法测定细胞增殖将分离的鹿茸间充质细胞均匀接种于96孔板中，待贴壁细胞汇合度为60%～70%时，在培养基中添加用乙醇配制的终质量浓度为10-6g/L的睾酮，对照组加入相同体积的乙醇。睾酮处理48 h后，每孔滴加20 μL MTS，37℃避光孵育3 h后，用酶标仪测定其D值。

1.6 荧光定量PCR提取睾酮处理后的鹿茸间充质细胞的总RNA，反转录后，在LightCycler 96荧光定量PCR仪中进行扩增反应，检测软骨细胞标志物ColⅡ、AGC和COMP mRNA的表达水平，引物序列见表1。反应体系、扩增条件及数据处理参照本实验室已有方法进行[9]。

表1 PCR引物序列

1.7 统计学分析数据分析运用SPSS 19.0软件进行，组间方差分析采用One-Way ANOVA或独立样本t检验进行。P<0.05表示差异显著，所有试验均重复3次。

2 结果

2.1 AR基因的PCR扩增提取梅花鹿鹿茸顶部组织总RNA，反转录为cDNA后，以此为模板进行PCR扩增，电泳结果显示，扩增出与预期一致约为380 bp的目的基因片段(图1)。

M.DL2000 DNA Marker；1.AR基因扩增产物

2.2 AR扩增片段插入方向的鉴定将扩增所得目的基因片段与克隆载体连接，经转化、涂板、挑取阳性克隆质粒后，利用PCR对其插入载体的方向进行鉴定。结果显示，T7-SP6、T7-AR上游引物、SP6-AR下游引物和AR上游引物-AR下游引物扩增后均有相应长度片段，提示AR扩增片段反向插入质粒(图2)。将含有AR片段重组质粒的菌液进行测序，利用Gene Runner软件比对测序结果与目的基因全序列，结果显示，AR扩增片段的同源性为98%，说明目的基因成功插入载体中，插入方向与PCR鉴定结果相一致(图3)。

1.T7-SP6；2.T7-AR上游引物；3.T7-AR下游引物；4.SP6-AR上游引物；5.SP6-AR下游引物；6.AR上游引物-AR下游引物；M.DL2000 DNA Marker

图3 AR片段重组质粒的菌液测序结果

2.3 AR在梅花鹿茸角中的表达使用地高辛标记的反义cRNA探针进行原位杂交，检测AR mRNA在梅花鹿茸角中的表达情况，棕色为阳性信号。结果显示，AR mRNA在梅花鹿茸角的表皮层、真皮层和间充质层内均有表达，但在不同部位的表达强度存在差异，AR mRNA在表皮层的表达水平较低，在真皮成纤维细胞和间充质细胞中的表达水平较高，而在毛囊和皮脂腺内未见明显阳性信号(图4)。

A.鹿茸表皮和真皮(×40)；B.鹿茸表皮和真皮(×100)；C.鹿茸间充质层(×40)；D.鹿茸间充质层(×100)

2.4 睾酮对鹿茸间充质细胞增殖的影响将睾酮用无水乙醇溶解，用质量浓度为10-6g/L的睾酮处理鹿茸间充质细胞48 h后发现，与对照组相比，睾酮对鹿茸间充质细胞的增殖活性未见明显影响(图5)。

图5 睾酮对鹿茸间充质细胞增殖的影响

2.5 睾酮对鹿茸间充质细胞分化的影响鹿茸间充质细胞用终质量浓度为10-6g/L睾酮处理，通过荧光定量PCR方法检测睾酮作用24，48，72 h后，鹿茸软骨细胞标志物ColⅡ、AGC和COMP mRNA的表达水平。结果显示，与对照组相比，睾酮可显著促进ColⅡ、AGC和COMP的表达，且随着睾酮作用时间的延长，ColⅡ、AGC和COMP的表达水平呈逐渐上升的趋势，在72 h时表达水平达到最大值(图6)。

*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)

3 讨论

梅花鹿鹿茸角的再生方式非常独特，鹿茸角的再生过程是以茸角干细胞为基础的复杂的形成过程[10]。茸角顶端间充质层内的鹿茸间充质细胞具有旺盛的增殖和分化能力，可发育为软骨组织[11]。鹿茸角的快速生长和周期性脱落的特性使得鹿茸角成为研究骨骼形成及器官再生的理想模型。

众所周知，多种激素参与了鹿茸角的快速发育过程，它们共同调控鹿的角柄发生和茸角的快速生长，而雄激素在该过程中发挥主导作用。睾酮作为体内雄激素的主要存在形式，通过AR介导鹿的角柄和茸角的发育过程[12]。由于角柄和茸角对睾酮的敏感性不同，致使鹿茸角在高质量浓度的睾酮作用下会发生完全的骨化，而鹿的角柄却能持续发育，并能在下一个生茸周期启动新茸角的再生过程[13]。

鹿体内睾酮水平的周期性变化与鹿茸的周期性生长、骨化及茸皮脱落过程有关，鹿体内的睾酮水平在鹿茸角快速生长期和脱落期含量较低，而在鹿茸角骨化阶段含量较高[14]。据报道，处于快速生长期的茸角，低浓度的睾酮可通过调控茸角顶端细胞的有丝分裂来介导细胞的增殖，而高浓度的睾酮则会促进体内钙盐的沉积，加快茸角的骨化过程而抑制其生长[15]。同时，内源性睾酮可通过影响茸角的脱落时间来决定次年再生茸角的大小，体内睾酮浓度降低至阈值水平，则会激活破骨细胞的活性，促使鹿角提前脱落，因而在繁殖季节开始前有更多的时间长出新的茸角[16]。目前，关于睾酮在鹿体内发挥作用的机制主要有3种：第1种是通过睾酮部分转化为雌激素后促进鹿茸软骨细胞的成熟；第2种是通过增强鹿茸间充质细胞及软骨细胞对胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)的敏感性，介导其对两者的促增殖效应[17]；第3种是通过促进鹿茸间充质细胞及软骨细胞分泌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，进而发挥促进茸角生长的作用[18]。总之，睾酮与鹿茸角的周期性脱落与再生过程密切相关，而关于睾酮对鹿茸间充质细胞增殖与分化的影响目前尚不明确。

本试验利用原位杂交方法研究了AR mRNA在梅花鹿茸角中的表达情况，结果显示AR mRNA在鹿茸组织的多个部位均有表达，其中在鹿茸间充质细胞中的表达量较高，提示雄激素可能在鹿茸间充质细胞的增殖与分化过程发挥重要作用。为了进一步研究睾酮对鹿茸间充质细胞增殖的影响，本试验用质量浓度为10-6g/L的睾酮处理鹿茸间充质细胞48 h后，MTS结果显示，睾酮对鹿茸间充质细胞增殖的作用并不明显；而荧光定量PCR检测了软骨细胞标志物ColⅡ、AGC和COMP后发现，这3种软骨细胞标志分子的表达水平均随睾酮作用时间的延长呈现出表达量显著增加的趋势。以上结果表明，睾酮可能在鹿茸间充质细胞向软骨细胞分化过程中发挥重要的作用。

综上，睾酮对梅花鹿鹿茸间充质细胞的增殖无显著影响，但能促进鹿茸间充质细胞向软骨细胞的分化进程。但有关睾酮在鹿茸间充质细胞分化过程中的调节机制还有待于进一步研究。