牦牛睾丸发育过程中前动力蛋白2(PK2)的动态变化

李心蕊，潘阳阳，韩小红，蔺 蕙，张燕燕，王立斌，余四九，崔 燕，徐庚全*

(1.甘肃农业大学 动物医学学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心，甘肃 兰州 730070)

牦牛(Bosgrunniens)是我国藏区誉有“高原之舟”和“全能家畜”的畜牧资源，生存在3 000 m以上海拔地区，具有耐寒耐低氧的生存特性[1]。精子发育的优良决定着公畜的繁殖性能，而睾丸需要摄取更多的氧气以维持精子的生成，牦牛常年生存的生活环境致使其睾丸中氧分压相对较低，迫使睾丸组织对缺氧具有更强的抗逆性[2]。据报道，高原低氧环境对雄性生育能力具有抑制作用，不仅会导致多种酶及蛋白降解的能力降低，甚至也会使精子生成数量减少[3-4]。牦牛长期适应环境维持正常的繁殖力，其抗逆性的原理尚不清楚，有大量学者对牦牛睾丸的发育进行研究，以期揭示生殖系统对低氧的适应机制。

前动力蛋白2(prokineticin2，PK2)是一种分泌型的小分子蛋白[4]，属于AVIT蛋白家族成员之一。PK2是由MOLLAY等[5]从蟾蜍的皮肤分泌物中发现的，因其相对分子质量为8 kDa，被命名为Bv8(Bombinavariegate molecular mass-8 kDa)。随后Bv8的同源蛋白在一些哺乳动物体内被发现，并分别命名为前动力蛋白1(prokineticinl,PK1)和PK2。PK2一直是作为促进肠道收缩的蛋白而为人们熟知[7]。另据报道，在生理状态的人类和小鼠睾丸组织中，PK2基因在精小管中稳定强烈表达[4-5]并在促性腺发育[8]及精子形成的最后阶段[9]发挥作用；也有研究证实，将小鼠的PK2基因敲除后，其生殖器官的质量降低，睾丸内生精管萎缩，管腔狭小，间质稀疏且间质细胞较少，精子发生缺陷[6-8]。也有研究发现，低氧可以诱导PK2的表达量上调[10]，而表达PK2受体的血管内皮细胞不断分裂增殖[11]，因此推测PK2可以通过旁分泌途径促进睾丸的血管内皮细胞增殖以达到调节睾丸生精功能的作用。

目前，关于PK2在高原动物睾丸发育各阶段中的表达情况尚未见报道。本试验采集发育不同阶段的牦牛睾丸组织，研究PK2的表达情况，为明确牦牛生殖系统低氧耐受适应机制提供理论基础，进而为提高牦牛繁殖力补充资料。

1 材料与方法

1.1 样本采集与处理样本来源于甘肃甘南安多屠宰场,选取幼年期(1～2岁)、性成熟初期(2～3岁)、性成熟后期(3～5岁)和老年期(5～7岁)4个阶段[12]的健康牦牛各3头，处死后采集睾丸组织，液氮冷冻，-80℃保存。另取1 cm3组织块，置于4%多聚甲醛中固定保存。

1.2 主要试剂和仪器PCR仪(Eppendorf,德国)；实时荧光定量PCR仪(Loch1公司,瑞士)；DAB显色液(ZSGB-bio)；TRIzol试剂(全式金生物技术有限公司，北京)；Taq PCR Master Mix(Promeg,美国)；TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ(宝生物，大连)；山羊抗兔IgG/HRP抗体(Bioss,北京)；兔抗PK2多克隆抗体(Novus Biologicals,上海)；SP试剂盒(Bioss,北京)。

1.3 牦牛总RNA的提取和反转录按照TRIzol试剂说明书提取不同发育阶段的牦牛睾丸组织总RNA,分光光度计测D450 nm值，并通过琼脂糖凝胶电泳验证总RNA的完整性。将RNA稀释为统一浓度，根据Go ScriptTMReverse Transcription System说明书反转录，-20℃保存备用。

1.4 引物设计利用Primer Premier 6.0软件设计引物，交由上海生工基因科技公司合成(引物信息见表1)。

表1 引物序列

1.5 qRT-PCR检测牦牛睾丸组织中PK2 mRNA的表达以cDNA为模板扩增牦牛PK2基因。反应体系为：2×SYBR®Premix Ex TaqTMEraserTM10 mL,200 mg/L模板cDNA 1 μL,上、下游引物各 0.5 mL,去离子水 8 μL，共20 μL。反应条件：95℃预变性4 min;95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸20 s，循环40次。试验重复4次，绘制熔解曲线和扩增曲线，Ct值通过2-△△Ct方法计算并得到PK2 mRNA的相对表达量，并用SPSS 25.0软件分析其在不同发育阶段牦牛睾丸组织的表达差异性。

1.6 IHC检测牦牛睾丸组织中PK2的定位制作4 μm厚不同发育阶段的牦牛睾丸组织石蜡切片，常规脱蜡至水，滴加3%H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶活性，沸水浴15 min修复抗原，按照说明书进行染色，一抗1∶300稀释，阴性对照组用PBS代替一抗，DAB显色，树脂封片后拍照。

1.7 Western blot检测牦牛睾丸组织中PK2蛋白的表达将-80℃保存的各发育阶段牦牛睾丸组织研磨成粉末，利用裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF)提取蛋白样品，-80℃保存。将蛋白样品100℃变性10 min，进行SDS-PAGE电泳(10%分离胶与5%浓缩胶)；剪切目的蛋白，用湿转法将其转移到0.45 μm PVDF膜上；PBST洗去多余转膜液后，4℃封闭过夜；4℃一抗孵育8 h；室温二抗孵育1 h；曝光成像，利用Image J收集灰度值分析其相对表达量并通过SPSS 25.0软件分析其差异性。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测不同发育阶段牦牛睾丸组织中PK2 mRNA的表达琼脂糖凝胶电泳显示，PK2 和β-actinmRNA扩增产物条带单一且大小与预期相符(图1)。荧光定量PCR结果显示，其熔解曲线峰单一，因此引物特异性能够满足试验验的要求。统计学分析显示，PK2 mRNA在不同发育阶段牦牛睾丸组织中均有表达，性成熟后期组和老年期组的表达量高，幼年期组与性成熟初期组表达量低，且差异显著(P<0.05)，性成熟后期组与老年期组之间表达量无显著性差异(P>0.05)，同样幼年期组与性成熟初期组之间表达量也无显著性差异(P>0.05)(图2)。

上图为PK2产物电泳分析；下图为β-actin产物电泳分析。M.DL2000 DNA Marker；1.幼年期组；2.性成熟初期组；3.性成熟后期组；4.老年期组

1.相同小写字母之间表示差异不显著(P>0.05)；2.不同小写字母之间表示差异显著(P<0.05)。下同

2.2 IHC检测PK2在不同发育阶段牦牛睾丸中的表达定位IHC结果显示，PK2蛋白在不同发育阶段牦牛睾丸组织中均有表达，且性成熟初期组、性成熟后期组和老年组的阳性表达细胞种类较幼年组多。在1岁幼年期组中，可观察到已有少量精子细胞和精子出现，且PK2主要分布在精子细胞及精子中，在其他细胞中几乎不表达(图3A)。PK2蛋白在性成熟初期牦牛睾丸中主要表达在精子细胞、精子、初级精母细胞及次级精母细胞中(图3B)，性成熟后期组与老年期组表达部位与性成熟初期组相同(图3C，D)，表明随着性成熟的发生，PK2阳性表达的生精细胞的种类与数量增多。

A.幼年期组；B.性成熟初期组；C.性成熟后期组；D.老年期组；E.幼年期组阴性对照；F.性成熟初期组阴性对照；G.性成熟后期组阴性对照；H.老年期组阴性对照。CST.生精小管；RS.精子细胞；LC.间质细胞；SC.支持细胞；PS.初级精母细胞；S.精原细胞；SS.次级精母细胞；Sp.精子

2.3 Western blot检测不同发育阶段牦牛睾丸中PK2蛋白的表达Western blot结果显示，PK2蛋白在各时期组中存在表达差异(图4)。统计学分析发现，PK2蛋白在不同发育阶段牦牛睾丸中均有表达，幼年期为低表达，其他3个时期为高表达，其表达趋势为随着年龄变化先升高，后维持在高水平表达(图5)。在幼年期牦牛睾丸中PK2蛋白的表达量显著低于性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睾丸(P<0.05)，且在性成熟初期、性成熟后期及老年期3组间的表达量差异不显著(P>0.05)。

1.幼年期组；2.性成熟初期组；3.性成熟后期组；4.老年期组

图5 PK2蛋白在牦牛睾丸发育各阶段中的表达

3 讨论

PK2在哺乳动物睾丸、前列腺组织中均有表达并参与维持其正常的生理功能[13]。XIN等[14]建立了PK2敲除小鼠模型，发现敲除PK2后的小鼠基本上丧失了生育能力，雄鼠的睾丸发育障碍；MATSUMOTO等[15]提出敲除PK2的雄性小鼠因GnRH分泌异常导致生精小管缺乏管腔、精母细胞和精子细胞缺失；SAMSON等[16]认为,PK2有助于调节睾丸内外激素的运输，故PK2的缺失会对雄性生殖系统产生直接损害，而且也可通过影响激素的分泌及运输过程使其出现障碍。WECHSELBER等[17]指出，PK2 mRNA的表达主要局限于睾丸，且通过原位杂交表明，其主要表达于第Ⅶ～Ⅸ期的初级精母细胞。郑加翠[18]指出，PK2蛋白主要表达在人睾丸间质细胞中。而在本试验中发现1岁幼年期牦牛睾丸中已经可以出现各级生精细胞，这与朱俊峰等[19]的试验结果相符。IHC结果显示，PK2蛋白在幼年期牦牛睾丸内主要表达在精子细胞及精子中，而在性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睾丸中除在精子中表达外，也在其他各级生精细胞中表达，这与郑加翠等的研究结果不一致。LECOUTER等[10]指出，缺氧可诱导PK2的表达量上调；同时，WECHSELBER等[17]推测，PK2蛋自储存在精母细胞中，只在成熟精子中发挥作用，PK2蛋白在不同动物睾丸中表达部位不一致的主要原因可能是由于物种差异引起，但具体的原因仍需进一步研究。

qRT-PCR结果发现，在幼年期及性成熟初期牦牛睾丸中PK2 mRNA表达水平较低，而在性成熟后期及老年期牦牛睾丸组织中表达水平较高，表明其mRNA表达水平与性成熟程度密切相关。有研究学者发现，在小鼠出生2周后，睾丸开始产生初级精母细胞，此时仅能检测到少量PK2 mRNA的表达[17]；而出生3周后的小鼠睾丸开始出现粗线期晚期和双倍体期的精母细胞，此时睾丸中PK2 mRNA表达水平显著升高，此后一直处于高水平表达[17]，这与本研究结果趋势相符。本试验结果表明，PK2蛋白在不同阶段牦牛睾丸中表达趋势与其mRNA表达趋势大体相同，即在幼年期低表达，性成熟后期及老年期高表达。值得注意的是在性成熟初期时PK2蛋白表达量已经达到较高水平，而PK2 mRNA在同时期仍处于较低水平。近年来基因组计划研究表明，基因转录产物中绝大多数为非编码RNA，按功能可分为调节性非编码RNA及非调节性非编码RNA[20]。LncRNA作为非编码RNA的一种，可通过碱基互补配对抑制或者上调mRNA的表达水平，从而参与机体生理与病理过程的调节[21]。杨花等[22]提出，在性成熟前后湖羊的 53 个差异表达 lncRNA 对雄性生殖和睾丸发育具有潜在作用。何其杰等[23]发现，存在于大足黑山羊睾丸支持细胞中的1ncRNA WNT3-IT，可以通过正向调控支持细胞中WNT3的表达，调节支持细胞在G0/G1期增殖活性，进而影响支持细胞的增殖能力，并在睾丸发育后期的精子发生与支持细胞分化过程中起重要作用。在性成熟初期牦牛睾丸组织中PK2 mRNA与蛋白可能与WNT3蛋白存在相同或类似的生理作用，但具体的机制仍需进一步确定。

LECOUTER等[10]以腺病毒为载体，将PK2递送到小鼠睾丸导致了明显的血管生成反应。PK2已被确定为是一种有效的血管生成因子，可以通过Gaq/Ga13信号通路促进血管内皮细胞的增殖，并在一定程度上调节睾丸的生殖功能[18,24]；由于PK2基因的表达模式与睾丸的成熟密切相关[17]，且在性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睾丸中精子与血管生成趋于稳定[25]，PK2在性成熟后期及老年期的高表达量在此得到了验证。此外，WECHSELBER 等[17]提出 PK2可能在减数分裂和精子形成前的最后一次DNA复制中起自分泌或旁分泌信号分子的作用；LI等[6]指出,PK2/PKR1信号通路在生理条件下与精子发生有关，并推测PK2可能在精子成熟时进行蛋白水解并释放，同时参与精子形成最后阶段的生理过程。由此推测PK2在牦牛睾丸的发育过程中起着重要作用，但其具体参与的生理过程及其机制仍需进一步的探索。

PK2在各发育阶段的牦牛睾丸组织中均有表达，且在幼年期牦牛睾丸中主要表达在精子细胞及精子中，在性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睾丸中也表达于初级精母细胞和次级精母细胞中。PK2蛋白及mRNA表达量随牦牛年龄变化而呈现先升高并维持在较高水平的趋势，即在幼年期处于低表达水平，而在性成熟后期及老年期的牦牛睾丸组织中维持在高表达水平，仅在性成熟初期中其mRNA与蛋白的表达量不同，提示PK2参与了牦牛睾丸的发育过程，促进了精子的发生，为后期研究其在牦牛睾丸中的作用机制奠定了基础。