基于网络药理学分析连翘治疗牛乳房炎的作用机制及体内验证

王小榛，刘 畅，宋雪娇，邢 晨，唐 阳，张岳峰，吴 桐，陈雪英，李艳华，刘艳艳

(东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

乳房炎是由乳房组织感染引起的炎症反应，已成为奶牛最普遍的疾病[1]，它不仅对人类和动物健康产生影响，而且还会给乳制品行业带来相当大的经济损失[2]。微生物感染已成为引起奶牛乳房炎的一个主要因素，其中金黄色葡萄球菌是主要的病原菌之一，其含有多种毒力基因且分布广泛[3]。抗生素在乳房炎的治疗中被广泛的应用，但抗生素耐药发生率的增加以及牛奶和奶制品中抗生素残留的频繁报道引起了人们的关注[4]。

中草药在预防和治疗疾病中发挥着重要作用。连翘被称为“疮家圣药”，具有消肿散结、清热解毒等作用,以连翘为主要成分的隐乳净已被证实对乳房炎具有一定的治疗作用[5]。此外，研究表明连翘的主要临床作用与其抗炎活性具有一定的关联[6]，因此其具有治疗乳房炎的潜力。中药的有效药效基础是由多成分组成的复杂体系，其作用机制复杂，难以阐明。网络药理学通过计算机技术、生物网络构建及网络分析方法可系统而全面地揭示中药多成分、多靶点、多作用通路关系[7]。

本试验通过网络药理学与动物体内试验相结合的手段，通过构建成分-靶点-疾病网络探索连翘治疗乳房炎的药效物质，通过功能注释分析连翘抗乳房炎的生物学过程及潜在作用机制。最后通过构建金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳房炎模型，验证连翘发挥治疗乳房炎的分子机制,为进一步分析连翘抗乳房炎的药效物质及作用机制阐明提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、DisGeNET 数据库(http://www.disgenet.org/)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org)、Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)、Draw Venn Diagram 软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)、STRING数据库(https://string-db.org/)、DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)以及GraphPad Prism 8.0软件等。

1.2 连翘成分及乳房炎靶点预测通过TCMSP数据库检索连翘的化学成分,将口服利用度(OB≥30%)和类药性(DL≥0.18)作为筛选条件，进行活性成分及靶点的搜索；在DisGeNET、GeneCards和OMIM数据库以“mastitis”为关键词检索乳房炎靶点,使用在线韦恩软件Draw Venn Diagram获得连翘-乳房炎的交集靶点，探索连翘可能作用于乳房炎的潜在靶点。

1.3 成分-靶点-疾病网络构建及拓扑分析通过Cytoscape 3.6.1软件构建成分-靶点-疾病网络，使用Network Analyzer进行网络拓扑分析，预测连翘治疗乳房炎的关键药效成分。

1.4 核心靶点的PPI网络构建及分析在STRING数据库输入连翘和乳房炎的共同靶点，物种设置为“Bostaurus”，最低阈值为 0.7，获得相互作用靶点的数据，并通过 Cytoscape 3.6.1软件中Network Analyzer工具进一步分析，根据Degree值筛选作用核心靶点。

1.5 GO和KEGG通路富集分析利用DAVID数据库对连翘-乳房炎共同靶点进行GO分析，探究药物作用的生物学功能。通过Cytoscape插件ClueGO对共同靶点进行KEGG分析，探究药物作用通路。

1.6 连翘水提液制备连翘购于中国黑龙江省哈尔滨市中药市场(批号：201817)，经鉴定为连翘Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl，标本存放在东北农业大学动物药学系。称取连翘药材10 g,加入0.2 L蒸馏水，浸泡60 min,武火煮沸后文火煎3次，每次1 h，过滤，混合3次滤液，减压浓缩至1 g/mL(生药材)，即得连翘水提液。依据2015版中国药典规定对连翘水提物的连翘苷及连翘酯苷A进行含量测定[8]。

1.7 试验动物及分组SPF级哺乳雌性BALB/c小鼠36只，由哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心提供，动物试验均经东北农业大学动物委员会批准(许可证号：NEAUEC20)。适应1周后，将小鼠随机分为6组，每组6只，分别为对照组(Control)、乳腺炎模型组(Model)、连翘低剂量组(FF 2.5 g/kg)、连翘中剂量组(FF 5.0 g/kg)、连翘高剂量组(FF 7.5 g/kg)和阳性药物组(DEX 5.0 mg/kg)。通过将105CFU金黄色葡萄球菌(ATCC,Manassas,VA,United States)注入正常小鼠第4对乳房(从头部开始计数)进行造模。造模次日开始，分别给予2.5，5.0，7.5 g/kg连翘水煎液进行灌胃治疗，每日2次，连续5 d。5.0 mg/kg地塞米松(DEX)作为阳性对照。末次给药12 h后处死雌鼠，取乳腺组织。

1.8 病理组织学观察收集的部分乳房组织用4%多聚甲醛固定，脱色和石蜡脱水后，对乳房切片(4 μm)进行苏木精伊红染色,最后，用光学显微镜对试验样品进行观察。

1.9 荧光定量PCR(qRT-PCR)使用总RNA试剂盒从乳腺组织中提取RNA并反转录至cDNA(天根生化科技有限公司)。采用qRT-PCR方法检测验证相关通路基因的表达，引物由上海生工设计，2-△△Ct值表示基因相对表达量，引物信息见表1。

表1 引物序列

1.10 ELISA分析小鼠乳腺组织称质量后于冰上研磨(1 g组织/1 mL生理盐水)，12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用ELISA试剂盒(上海酶联生物技术有限公司)，根据说明书测定上清液中IL-17A、NF-κB、IκBα、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。在450 nm处读取D值。

2 结果

2.1 连翘HPLC分析定量结果显示，连翘苷和连翘酯苷A在连翘中的百分比含量分别为1.51%和5.80%，这2种活性化合物的含量均高于2015年版《中国药典》规定，说明连翘符合《中国药典》的要求(图1)，可用于后续试验。

A.连翘苷标准品色谱图；B.样品中连翘苷色谱图；C.连翘酯苷A标准品色谱图；D.样品中连翘酯苷A色谱图

2.2 连翘抗乳房炎的药效成分及靶点预测通过TCMSP数据库筛选，共获得23个潜在的连翘成分(表2)和208个成分靶点；通过DisGeNET、GeneCards、OMIM数据库获得167个牛乳房炎靶点。在Draw Venn Diagram在线软件输入208个连翘成分靶点、167个牛乳房炎靶点，获得连翘-乳房炎的交集靶点25个。通过Cytoscape 3.6.1软件构建成分-靶点-疾病网络(图2)，通过拓扑参数Degree值筛选潜在的连翘抗乳房炎的药效成分。网络显示，槲皮素(quercetin，Degree=19)、木犀草素(luteolin，Degree=10)、汉黄芩素(wogonin，Degree=6)和山奈酚(kaempferol，Degree=5)拥有最高的度值,表明这些成分可能是发挥抗乳房炎的药效成分。

图2 连翘成分-靶点-疾病网络

表2 连翘活性成分信息

2.3 PPI分析将25个交集靶点导入STRING数据库，获得交互靶点的蛋白质互作关系。通过Cytoscape 3.6.1软件对PPI网络进行可视化(图3)。拓扑参数Degree值代表每个节点的重要性，度值与节点颜色深浅及节点大小呈正相关，即节点越大，颜色越深，其Degree值越大。排名靠前的分别是白介素-6(IL-6,Degree=13),肿瘤坏死因子(TNF,Degree=12),白介素-8(CXCL8,Degree=11),表皮生长因子受体(EGFR,Degree=11)和细胞间黏附分子1(ICAM1,Degree=10)，这些可能是连翘作用于乳房炎的核心靶点。

图3 核心靶点蛋白-蛋白互作网络图

2.4 GO富集分析运用DAVID数据库对25个药物-疾病交集靶点进行生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)的富集分析，通过富集的基因数值(Count)大小及P<0.05筛选条目并绘图。如图4所示，连翘参与的主要生物过程有RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡ promoter)、免疫应答(immune response)、凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)等；细胞组分主要富集于胞外间隙(extracellular space)，质膜外(external side of plasma membrane)，胞质溶胶(cytosol)等；分子功能主要富集于细胞因子活性(cytokine activity)、序列特异性DNA结合(sequence-specific DNA binding)、转录因子活性(transcription factor activity)等。

图4 GO富集分析结果

2.5 KEGG通路分析运用Cytoscape插件ClueGO对25个药物-疾病交集靶点进行KEGG通路分析，共富集到27条信号通路(图5)，其中包括6个与炎症相关的信号通路，如IL-17信号通路(7.28%)、NF-κB信号通路(6,24%)、TNF信号通路(6,24%)、Toll样受体信号通路(5,20%)和T细胞受体信号通路(5,20%)，这些途径可能在连翘治疗乳房炎中起关键作用,说明中草药通过多种靶点和途径发挥了巨大的作用。

图5 KEGG信号通路分析结果

2.6 乳腺组织形态学及病理学分析与空白组相比，金黄色葡萄球菌感染组的小鼠乳腺管腔结构消失，并伴有更多炎症细胞浸润。与模型组相比,7.5,5.0 g/kg FF和5.0 mg/kg DEX 给药治疗可改善乳腺组织形态，缓解金黄色葡萄球菌诱导的炎症损伤(图6)。

A.空白组；B.模型组；C.7.5 g/kg FF治疗组；D.5.0 g/kg FF治疗组;E.2.5 g/kg FF治疗组；F.5.0 mg/kg DEX治疗组

2.7 IL17/NF-κB信号通路的分子表达与模型组相比，7.5，5.0 g/kg连翘水煎液和5.0 mg/kg DEX干预能显著下调IL-17A、IκBα、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表达水平(图7)和降低相应蛋白含量(图8)。结果表明，连翘可通过IL17/NF-κB信号通路激活缓解金黄色葡萄球菌诱导的乳房炎。

A.IL-17A；B.IκBα；C.NF-κB；D.TNF-α；E.IL-6；F.IL-1β。与空白组相比，##表示P<0.01；与模型组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01；ns:没有显著性差异。下同

A.IL-17A；B.IκBα；C.NF-κB；D.TNF-α；E.IL-6；F.IL-1β

3 讨论

乳房炎是牛群中最常见和最严重的炎症性疾病，患畜治疗费用巨大[9]。当今抗生素治疗依旧是治疗奶牛乳房炎的主要方法，但抗生素的滥用不仅会出现药物残留，还会对长时间使用患畜奶制品的人类带来潜在威胁。连翘具有消肿散结、清热解毒的作用，对乳房炎具有潜在的治疗作用。本试验通过网络药理学、动物实验对连翘治疗乳房炎的药效物质基础和分子机制进行预测，发现核心靶点和通路涉及了细胞因子活性、免疫反应、细胞凋亡和炎症反应等环节。

根据成分-靶点-疾病的网络构建，我们鉴定出11个可能对乳房炎产生巨大治疗作用的潜在活性化合物。根据网络拓扑参数(Degree)分析，槲皮素、木犀草素、汉黄芩素和山奈酚的Degree值排名靠前，表明这些成分可能是连翘治疗奶牛乳房炎的主要成分。此外，槲皮素、木犀草素和山奈酚这3种成分已被证实对乳房炎具有显著治疗作用。富含槲皮素的中药可通过抑制NF-κB的活化，提高Nrf2-ARE的转录活性发挥治疗乳房炎作用[10-11]；木犀草素可通过抑制MMPs表达和NF-κB活化，减轻金黄色葡萄球菌引起的乳房炎的炎症反应[12]；山奈酚可通过调节NF-κB信号通路抑制乳房炎的炎症反应[13]。这些结果再次表明，中药是通过多种成分和多靶点发挥作用的。

众所周知，蛋白质通过相互协调发挥作用[14]，不同的靶蛋白之间存在多种关联，Degree值越高，靶点的潜在作用越大。IL-6、TNF、CXCL8、EGFR、ICAM1排名靠前，可能是连翘治疗乳房炎的关键靶点。细胞因子是保护宿主反应的重要介质，包括防御肿瘤发生和微生物入侵。但是，特定的促炎细胞因子的产生必须受到严格的调控，以防止这些分子的过度表达，也被称为“细胞因子风暴”，这可能导致炎症的增加和组织损伤[15]。在所有细胞因子中，TNF-α和IL-6在细胞因子风暴的发病机制中发挥关键作用，并可能与疾病严重程度的增加有关[16]。此外，IL-6被认为是牛乳房炎的标志物[17]。连翘水提物能有效下调TNF-α和IL-6的mRNA表达和蛋白含量，此结果在金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳房炎模型得到了进一步证实。

中草药通过多种靶点和途径发挥作用。结合GO和KEGG通路富集分析，连翘抗乳房炎的分子机制与细胞因子活性、转录因子活性、免疫调节和凋亡过程密切相关。在富集到的27条信号通路中，其中的6条通路与炎症相关，包括IL-17信号通路、NF-κB信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路和T细胞受体信号通路。在这些炎症相关通路的相互作用中，IL-17、TNF和TLRs的激活可触发NF-κB的活化[18-20]。因此，我们选择NF-κB信号通路作为IL-17信号通路的下游验证通路。IL-17家族是最近被分类为细胞因子的一个子集，在急性和慢性炎症反应中都发挥着关键作用[21],IL-17过表达可促进乳房炎组织损伤[22]。IL-17A不仅与TNF-α协同，在TNF-α诱导mRNA转录稳定后诱导基因表达，而且还激活NF-κB级联，上调多种细胞因子和促炎趋化因子表达，以显示其促炎作用[23-24]。在未激活状态下,NF-κB以同源或异二聚体形式与IκBα结合[25]。此外，经金黄色葡萄球菌感染后的奶牛体细胞中IL-17A基因表达增加，金黄色葡萄球菌培养上清液刺激乳腺上皮细胞其IL-17A基因的表达也增加[26-27]。动物试验结果显示，与模型组比较，7.5,5.0 g/kg连翘显著下调IL-17A、IκBα、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA和蛋白水平，表明连翘可通过IL17/NF-κB信号通路缓解金黄色葡萄球菌诱导的乳房炎炎症反应。

综上，本试验运用网络药理学和动物试验相结合的方法对连翘治疗牛乳房炎的分子机制进行初步探究，揭示了中药发挥作用的多成分、多靶点、多通路的特点，为治疗发病机制复杂的牛乳房炎的研究提供新的思路。