动物RNA病毒VLPs疫苗的研究进展

郭春红，李金斗，丁佳欣，丁 壮*

(1.吉林大学 动物医学学院 人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 130062；2.吉林元和元生物工程有限公司，吉林 长春 130000)

RNA病毒是一类遗传物质由RNA组成的病毒，基因组及转录复制极具多样性。根据病毒基因组的类型可以将RNA病毒分为单链RNA病毒(ssRNA,single-stranded RNA)和双链RNA病毒(dsRNA,double-stranded RNA)。单链RNA病毒被分为单股正链RNA病毒和单股负链RNA病毒[1]。在自然界中RNA病毒的数量极其庞大，参照国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)颁布的最新的病毒种类名单，dsRNA病毒、(+)ssRNA病毒和(-)ssRNA病毒分别涉及11,61,37个病毒科。RNA病毒感染可引起人类、动物以及植物的多种严重疾病。目前,在人类感染RNA病毒公共卫生事件中，彰显实力的冠状病毒，多次肆虐全球，如2002年冬至2003年春流行的重症急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respirator syndrome coronavirus,SARS-CoV)、2012年流行的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)以及2019年冬至今流行的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)[1-2]。在动物养殖业中RNA病毒也产生巨大威胁，例如口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)等。FMDV传播速度快、防治困难，暴发后只能采取屠宰和焚灭感染牲畜，是畜牧业的“头号杀手”。AIV在全球各地广泛流行，其中H9N2型禽流感的暴发带来了巨大的经济损失，乃至当今为家禽养场中常在病原。H5N1型、H7N9型AIV致病力强、传播速度快，人和家禽均易感，发病率及病死率高，是全球公共卫生关注的焦点[3]。众多RNA病毒引起的动物疫病，目前尚无特效治疗性药物。近年RNA病毒疫苗的研究不断深入，目前已经有多种RNA病毒疫苗进入到病毒样颗粒时代。病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)的形态结构与天然病毒高度相似，不含病毒核酸，具有与完整病毒粒子相似的免疫原性，可有效诱导机体产生免疫应答，许多抗原可通过基因工程的方法在VLPs表面展示，进而构建多联多价VLPs疫苗。这种非感染性颗粒可以自行组装，可利用基因工程手段在实验室大规模生产。结构的高度稳定性、重复性和均一性使VLPs被广泛应用于各种生物领域。

1 RNA病毒结构与功能的特点

RNA病毒的中心是核糖核酸(RNA)，基因组RNA携带的遗传信息决定着病毒的遗传和变异特征，病毒核酸的排列形式也是病毒分类的重要依据。RNA基因组外被有规律排列的蛋白亚基包裹，被称为衣壳(capsid)，构成衣壳蛋白亚单位被称为壳粒(capsomer)，其形态也是病毒分类或病毒鉴定的重要依据。衣壳具有多种功能：即保护病毒核酸，使其免受核酸酶或其他理化因素的降解；参与病毒感染细胞的过程，决定病毒对宿主细胞的嗜性；具有抗原性，诱导宿主产生特异性免疫反应等，通常也是新型疫苗的研发靶点。病毒的衣壳蛋白和RNA可组装成为核衣壳(nucleocapsid)。根据壳粒的排列方式，核衣壳被分为3种模式：二十面体对称模式，如脊髓灰质炎病毒；螺旋对称模式，如正黏病毒和副黏病毒等；复合对称模式，如痘病毒。复杂的病毒外层还包含由脂质和糖蛋白构成的包膜(envelope)及刺突(spike)等结构。刺突具有多种生物活性，是启动病毒感染(吸附、穿入)所必需的，同时也含有主要的保护性抗原，是疫苗研发的主要靶点之一。病毒的包膜具有维系病毒结构、保护病毒衣壳的作用，可根据是否含有包膜将RNA病毒分为裸露病毒或囊膜病毒。裸露病毒和由含有核酸(DNA或RNA)与核衣壳蛋白(nucleocapsid protein)的核衣壳(nucleocapsid)粒子构成。例如：猪圆环病毒(porcine circorivirus,PCV)，无囊膜、单链共价闭合环状DNA病毒，基因组编码11个开放阅读框(ORF1～11)，ORF2编码的核衣壳结构蛋白(capsidprotein,cap)，可形成VLPs，具有抗原保护性[4]；FMDV，无囊膜单股正链RNA病毒，基因组编码的4种结构蛋白VPl、VP2、VP3、VP4聚集形成包裹病毒核酸的核衣壳[5]。囊膜病毒含有脂质和糖蛋白构成的包膜(envelope)。例如,AIV为有囊膜的单股负链的RNA病毒，囊膜内为NP蛋白和聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)包裹形成的呈现螺旋状的RNP复合物，囊膜外为发挥受体识别与结合的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)[6-7]。RNA病毒基因组编码的结构蛋白或非结构蛋白在RNA病毒的生命周期中发挥重要作用，具体如下：抗原作用，主要决定病毒抗原性，也是VLPs疫苗等新型疫苗研发的主要靶点，例如NDV F或HN蛋白重要的宿主保护性抗原，与病毒的致病性和毒力密切相关，也是ND VLPs重要的组成部分；识别作用，可靶向含有特异性受体的靶细胞，例如SARS-CoV-2的S蛋白通过识别受体ACE2与宿主细胞结合[8]；包装与保护作用，包装病毒RNA并保护RNA免受核酸酶的降解；传递作用，释放病毒基因组并将其传递至易感细胞等功能。

2 VLPs的分类

依据RNA病毒病原的结构，可将VLPs分为3类，即无包膜VLPs、包膜VLPs及复杂VLPs。无包膜VLPs由一种或多种蛋白亚基自我组装形成，无囊膜包被，无需特殊的细胞环境即可在体外完成装配，例如轮状病毒(RV)[9]、猪细小病毒(PPV)[10]等。包膜VLPs的最外层有脂质包膜，包膜VLPs结构复杂，其结构蛋白通过出芽过程离开细胞，并将衣壳包裹在部分细胞膜内。包膜VLPs的灵活性更高，可用于整合来自同源或异源病原体的多种抗原。例如HIV-1 VLPs就属于包膜VLPs，由Gag多蛋白聚合形成衣壳，衣壳外包膜来源于宿主的细胞膜[11]。新城疫VLPs[12]和禽流感VLPs[13]也是包膜VLPs典型代表。近年比较火热的包膜新型“嵌合VLPs”，它们的结构由病毒蛋白组成，而膜蛋白由第2种病毒衍生而来，例如以AIV H5N1的基质蛋白M1为骨架，在其表面嵌合MERS-CoV的S蛋白，包装成MERS-CoV嵌合型VLPs[14]。包膜蛋白可靶向作为特定组织受体的信号，可将衣壳蛋白与组分连接以递送至靶组织，因此VLPs具有开发成为递送系统的潜能。复杂的VLPs不具有包膜结构，通常由多层的VLPs结构组成，例如呼肠孤病毒科的轮状病毒(RV)VLPs[15]、蓝舌病毒(BTV)VLPs[16]，是多层VLPs的典型代表。

依据VLPs疫苗蛋白结构可分为VLPs疫苗、嵌合VLPs疫苗、耦联VLPs疫苗。VLPs仅由亲代病毒结构蛋白组成，例如由NDV结构蛋白M、F和HN组装而成的ND VLPs[17]。嵌合VLPs则是指VLPs以某种亲本病毒衣壳蛋白为基础，嵌合其他衣壳中的外源蛋白，例如将FMDV的中和B细胞表位(VP1(140～158))和T细胞表位(3A(21～35))插入致兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白而组装形成嵌合VLPs，在小鼠和猪中诱导了强大的中和免疫反应[18]。耦联VLPs是指利用化学或物理的方法将外源目的蛋白与某一病毒的VLPs相偶联而形成的VLPs。

3 VLPs疫苗包装与嵌入策略

大多数无包膜VLPs可以由病毒衣壳蛋白自组装，不含宿主成分。例如，戊型肝炎病毒(HEV)[19]、人乳头瘤病毒(HPV)[20]可以形成无包膜的VLPs。包膜VLPs由衣壳蛋白和宿主细胞膜组成，包括来源于甲型流感病毒(H1N1)[21]、丙型肝炎病毒(HCV)[22]、新型冠状病毒(CoV)[23]等。

3.1 VLPs内的新型RNAi支架RNAi支架是一种通用的嵌合体，包含1个功能性RNA双链体，具有成对的沉默和由miR-30茎环稳定的载体序列。例如，噬菌体(bacteriophage)Qβ的RNA生产包装在Qβ的方法，5′末端的Qβ发夹赋予了对Qβ外壳蛋白(CP)的亲和力。沉默序列可以包括成熟的miRNAs和siRNAs，并且基本上可以靶向任何期望的mRNA。VLP-RNAi装配在CP和RNAi的支架上共表达大肠杆菌[24]。

3.2 分子开关激活VLP组装例如HIV-1 VLPs的装配主要由Gag分子的衣壳(CA)结构域之间的相互作用，核衣壳(NC)结构域与核酸的结合会促进VLPs的组装。SP1在VLPs组装中的作用是CA和NC之间的“间隔物”。SP1的微小变化会严重破坏装配，并且CA-SP1连接处周围序列的肽在高浓度下处于螺旋形式，但在低浓度下会解除这种状态。根据这种浓度依赖性的变化关系，设置亮氨酸拉链(SP1-Zip)结构域可以作为一个分子开关来激活VLPs装配的HIV-1糖胺聚糖，将Gag中的NC取代后依旧可以有效装配VLPs[25]。

3.3 插入标签蛋白组装例如嵌合型口蹄疫苗VLPs，采用FLAG标签蛋白插入衣壳蛋白GH-loop环，通过SP1-Zip大肠杆菌原核表达技术表达口蹄疫病毒衣壳蛋白并体外组装出嵌合FLAG外源多肽的FMDV VLPs[26]；GUO等27利用分子伴侣蛋白SUMO对大肠埃希菌中FMDV的衣壳蛋白VP0、VP1和VP3进行了高效表达，将融合蛋白中的相扑片段用SUMO切割酶去除后，将3种衣壳蛋白组装成VLPs。

3.4 外源蛋白融合及GPI锚定策略外源蛋白融合是指将保护性抗原与病毒跨膜蛋白的胞外域进行替换，借助病毒的胞内域及跨膜域功能将外源蛋白嵌合至VLPs的表面。XU等[28]在ND VLPs载体平台的基础上，采用胞外域替换策略研发了新城疫禽流感二联VLPs疫苗，在囊膜表面同时展示AIV H9N2亚型HA蛋白和NDV F及HN蛋白，免疫后可有效抵御NDV NA-1株和AIV H9N2亚型的攻击。GPI是存在于真核细胞表面的糖基磷脂酰肌醇，包括CD14、CD16B、CD24、CD48、CD52、CD55、DAF等[29]，可通过GPI结构锚定到真核细胞膜的脂筏结构，因此可将外源蛋白与GPI序列进行嵌合表达，而使外源蛋白通过GPI结转移至有囊膜的VLPs表面。例如将布鲁菌BCSP31蛋白与GPI串联表达，与ND VLPs组装而形成嵌合VLPs(cVLPs-GPI-BCSP31)，可在体内、体外有效活化小鼠树突状细胞(DCs)，提供与疫苗菌株M5株相当的免疫保护力[30]。

4 VLPs表达系统及载体动能

应用于VLPs蛋白表达的系统有很多，约175种以上。目前，已经应用成功所构建RNA病毒VLPs的表达系统包括：原核(细菌)表达系统及真核(杆状病毒-昆虫细胞、哺乳动物、酵母、植物)表达系统，在某些情况下也可应用无细胞表达系统。一些表达系统基于它们的可变特征更适合于产生不同的VLPs。选择合适的表达系统制备VLPs，是确保蛋白质正确折叠和翻译后修饰(PTM)的关键因素[31]。由于蛋白质PTM如糖基化和磷酸化，病毒衣壳蛋白的四级结构在不同的表达系统中可以不同，这可能影响疫苗的免疫原性，因为PTM通常是刺激适当的免疫反应所必需的。

4.1 细菌表达系统细菌表达系统可用于制备许多VLPs，是制备重组蛋白最广泛使用的表达系统之一。但是，由于各种因素，如缺乏PTM系统、二硫键形成不完全和蛋白质溶解性问题，它们不是生产包膜VLPs的理想平台[32]。细菌表达系统是生产具有1种或2种病毒结构蛋白的无包膜VLPs的合适表达系统。然而，细菌在疫苗开发中，考虑到产品的成本，基于原核的表达系统通常被视为开发VLPs疫苗的最佳选择，因为其能够生产安全且成本有效的疫苗供全球使用[33]。大肠杆菌是生产VLPs最常见的细菌宿主细胞。其具有许多优点，包括低生产成本、快速细胞生长、高蛋白质表达水平和放大简单。全球首个上市的HEV VLPs疫苗，是第1个使用大肠杆菌表达系统的疫苗，于2011年获得许可并在中国上市[34]。抗人乳头瘤病毒16/18L1 VLPs的二价疫苗的表达平台也是大肠杆菌[35]。疟疾疫苗(MalariVax)是一种嵌合VLPs疫苗，由2个融合蛋白、HBV的核心蛋白和恶性疟原虫的表位组成，已在大肠杆菌中成功生产[36]。许多其他基于VLPs的候选疫苗使用大肠杆菌抗各种传染病如西尼罗河病毒(WNV)、FMDV和HCV表达系统也已进入临床前试验[33]。除了大肠杆菌外，在其他一些细菌种类中也观察到了VLPs的成功形成。利用乳糖诱导启动子系统检测L1蛋白的表达，成功进行了HPV-16 L1蛋白VLPs的自组装。

4.2 酵母表达系统酵母细胞表达系统经常用于重组蛋白表达，也用于VLPs的制备。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichiapastoris)是酵母表达平台较受青睐的酵母细胞，酵母细胞表达系统具有细胞生长快速、表达蛋白产量高、可扩展性、成本可靠，并可以进行一定程度的PTM过程等优点[37]。Engerix-B疫苗(HBV VLPs疫苗)和Gardasil疫苗(HPV VLPs疫苗)，通过酵母表达系统制备，并获得FDA批准[38-39]。最近，基孔肯雅热病毒(CHIKV)的VLPs通过毕赤酵母细胞表达已被报道[40]。虽然都取得了一定成就，但仍缺乏复杂的PTM以至于在生产应用中受到一定限制。另外，还可能存在高甘露糖基化的可能性、质粒丢失和与细菌表达系统相比较低的蛋白质产量等问题[37]。因此，酵母系统通常用于制备无包膜VLPs。有报道，酵母系统也已成功用于HIV1 Gag蛋白VLPs和DENV-2 VLPs的制备[41]。

4.3 昆虫杆状病毒表达系统(IBEVS)IBEVS是生产有包膜和无包膜VLPs最常用的表达系统。IBEVS对于VLPs的制备具有以下几个优点：比细菌/酵母表达蛋白质的产量高，且拥有复杂PTM途径和多蛋白质VLPs的形成优势。用于制备重组蛋白的常规昆虫细胞系来源于草地夜蛾(Sf9/Sf21)和粉纹夜蛾(Tn5)。IBEVS经常用于制备各种传染病的候选疫苗，例如HIV1、H1N1、CHIKV、SARS、EBOV、登革热病毒(DFV)等。IBEVS平台与哺乳动物细胞相比，所表达的糖蛋白的N-糖基化模式相对简单，可通过改善某些昆虫细胞(例如Ea4)的糖基化途径来增强昆虫细胞N-糖基化机制。因此IBEVS有望开发成为VLPs疫苗生产的最强候选表达系统。

4.4 植物细胞表达系统植物表达系统具有高表达水平、低成本和无哺乳动物病原体污染以及产生具有正确折叠和PTM的蛋白质的能力等优点。利用MagnICON和CPMV-HT技术，植物疫苗已成为一个多用途和有前途的平台。烟草花叶病毒研究的悠久历史，确定病毒颗粒的三维(3D)结构和鉴定结构研究暴露的表面区域，是开发重组植物疫苗的里程碑[42]。超过55种不同的植物病毒已被用于在其表面创建抗原表达平台，包括烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、苜蓿花叶病毒(AIMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)、木瓜花叶病毒(PapMV)和马铃薯X病毒(PVX)。TMV、PVX、CPMV和CCMV在高温和高pH下更稳定，并在天然植物宿主中大量表达[43]。植物系统也被用于产生基于动物和人类病毒的VLPs。最近，已经探索了使用基于植物的系统来表达类似于流感病毒VLPs的异源多亚基蛋白复合物，在几天内就可以从植物中获得良好的产量。Medicago公司开发了一个平台，用于生产针对冠状病毒、轮状病毒和诺如病毒等几种病毒病原体的植物疫苗。Medicago公司开发的模拟天然诺如病毒的诺如病毒样颗粒疫苗候选物目前正在临床前研究中进行评估。一种植物衍生的四价VLPs候选物作为流感疫苗能够在第1个Ⅲ期疗效研究中诱导强烈的抗体和细胞反应，目前正由加拿大卫生部进行最后确定。同样的方法，制备了冠状病毒VLPs候选疫苗，正在进行一期试验。据报道，截至2021年底，这种方法可以生产大约1亿剂植物基新冠肺炎疫苗[44]。

4.5 哺乳动物细胞表达系统动物细胞表达系统仍然是有价值和有吸引力的平台，可用于生产非包膜和包膜VLPs的多结构蛋白。动物细胞表达平台是最有效的重组蛋白生产系统，因为它们能够产生对蛋白质正确折叠至关重要的复杂而精确的PTMs。几种动物细胞系，包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、幼仓鼠肾-21(BHK-21)、人胚胎肾293(HEK293)、来源于人羊膜细胞的CAP-T细胞系、Vero9和东兰辛细胞系-0(ELL-0)，被广泛用于生产重组VLPs[31]。CHO是最常用的细胞系，与其他细胞系相比，它的优点在于它不是来源于人类细胞，因此它被人类病毒污染的风险较低[31]。使用CHO细胞系进行HBsAg VLPs的细胞内装配是非常成功的表达系统的一个例子，DFV VLPs和汉坦病毒VLPs也已经在CHO细胞中产生[45]。HEK293细胞系已被用于生产用于抗HIV、AIV和RABV的VLPs，并且CAP-T细胞系也被证明是用于HIV VLPs生产的高效表达系统[46]。然而，低蛋白产量、高生产成本、长表达时间和细胞系携带哺乳动物病原体感染的可能性被认为是哺乳动物细胞表达系统于临床使用存在的主要潜在缺点。

4.6 无细胞系统无细胞蛋白质合成(CFPS)系统，在某种情况下，无包膜单衣壳VLPs的衣壳蛋白可以在无细胞环境中组装以形成均质VLPs或在完全无细胞的体外环境中合成和组装[47]。CFPS系统通常由用于合成病毒衣壳蛋白的细菌或酵母细胞组成。与基于细胞的蛋白质表达平台相比，CFPS系统具有许多优点，包括生产周期短、高蛋白质产量和较低的细胞污染物[45]。CFPS系统已经广泛地应用于疫苗生产，采用该系统生产的Inflexal流感VLPs疫苗和Epaxal甲型肝炎VLPs疫苗已经商品化生产。其他病毒例如诺如病毒和乙型肝炎VLPs也已经通过使用体外表达系统有效表达[45]。但是CFPS系统具有高生产成本和有限可扩展性的局限性，限制了CFPS系统的商业应用潜能。

5 蛋白定量及纯化

纯度检测主要是确定VLPs结构蛋白的纯度、VLPs宿主的组装率、DNA和蛋白的残余、蛋白核酸复合物的多少等。主要的方法有ELISA法、SDS/PAGE法、质谱法、琼脂糖凝胶电泳迟滞试验、透射电镜检测法等。李军[48]研究的H5 VLPs疫苗，用配有Ultracel-50滤膜的Amicon Ultra-15离心式过滤器对H5 VLPs进行浓缩，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。此外，双抗夹心ELISA方法可精准定量VLPs各组分含量，尤其适用于昆虫杆状病毒表达系统等制备的无法完全清除杂蛋白的VLPs。例如利用双抗夹心ELISA定量兔出血症VLPs疫苗[49]和猪圆环病毒2型VLPs[50]等。

近年来，VLPs的制备工艺已进入产业化阶段，其纯化手段已发展成熟。纯化VLPs首先需利用超声破碎或去污剂等手段裂解表达细胞；其次是粗纯化，低速离心或沉淀法去除裂解液中的细胞碎片和较大聚集物；之后是目标物的浓缩处理；最后是精制，通过超速离心等方法彻底清除目标物里的残留物质或是小分子杂质等。靳野[51]研究的Asia I型口蹄疫VLPs，采用亲和层析(Ni2+-NTA层析柱)方法对VP0/VP1/VP2蛋白进行纯化。邓均华等[52]研究的RHDV VLPs疫苗，采用蔗糖密度梯度离心实验(SDGC)对VP60蛋白进行纯化。例如NAUPU等[53]研究的HPV VLPs疫苗，采用蔗糖密度梯度离心试验(SDGC)对L1蛋白进行纯化，并应用OptiprepTM进行精纯。ETO等[54]研究的嵌合HPV-HIV VLPs疫苗，通过细胞破碎，采用KTA pure分子筛色谱法在HiTrap Capto Core 700GE(Health care,Chicago,IL,USA)柱上阴离子交换纯化VLPs蛋白，再运用25%和75%蔗糖垫VLPs进一步纯化。YILMAZ等[55]研究的SARS-CoV-2VLPs疫苗采用KTA-GO快速蛋白质液相色谱系统在Hi-Screen Capto Core 400(Cytiva)柱上纯化VLPs。特殊的层析过程是否能够替代超速离心主要依赖于VLPs性质特点、粒子大小、排斥作用等，离子交换和亲和层析常用于VLPs精纯，纯化前需二价金属氧化物处理提取液，以便获得理想型疫苗级别的VLPs。

6 免疫原性评价及优化

VLPs具有与天然病毒粒子相似的结构和抗原表位，可以被抗原呈递细胞(APC)有效识别，并产生与灭活病毒疫苗相似的保护性免疫反应。VLPs免疫原性及免疫效率可以通过体液免疫检测、细胞免疫、黏膜免疫、体内排毒、体外病毒载量检测来有效评估。例如吉林大学丁壮教授团队研发的ND VLPs疫苗，在小鼠模型及本属动物(SPF鸡)中评价了疫苗的保护效果及免疫机理[28]。应用血凝抑制试验和间接ELISA方法进行体液免疫效力检测，结果表明ND VLPs可诱导产生较高的血凝抑制抗体效价和特异性IgG抗体水平，攻毒后的体内病毒载量与体外排毒时间均优于传统弱毒疫苗[17]；应用流式细胞术进行细胞免疫检测，结果表明VLPs可诱导脾T细胞活化并向效应T细胞分化，能激活更多的特异性Th1细胞(CD4+IFN-γ+细胞)和Tc细胞(CD8+IFN-γ+细胞)[56]。刘新生[57]研发的FMDV嵌合VLPs疫苗，通过鼠细胞因子抗体芯片CYT.1和豚鼠淋巴细胞增殖试验评估了嵌合VLPs疫苗免疫豚鼠后诱导的细胞免疫，结果显示嵌合VLPs疫苗可刺激机体产生较高水平的IFN-γ和IL-6，MTT染色法测定淋巴细胞增殖情况结果显示嵌合VLPs疫苗免疫组针对FMDV抗原刺激后可激活T淋巴细胞特异性增殖。此外，VLPs疫苗相较于传统疫苗的另外一个优势是可区分疫苗免疫血清和野毒感染血清。FMDV灭活疫苗对FMDV疫病防控做出了重大贡献，但通过传统的ELISA很难区分自然感染和疫苗免疫的动物，这给口蹄疫的临床检测和预防带来了困难。FMDV的VLPs无核酸、非传染性，只含有结构蛋白，只有动物才能在免疫后被诱导产生针对结构蛋白的抗体，通过检测非结构蛋白抗体，可以很容易地区分免疫动物和自然感染的动物。因此FMDV VLPs被认为是最有可能取代灭活病毒疫苗的候选疫苗[51]。目前在兽用的VLPs疫苗中，国内注册的VLPs疫苗为PCV-2 VLPs疫苗，在猪的PCV免疫应用中取得了很好的效果。

为提高VLPs疫苗的免疫原性，通常采用添加免疫相关细胞因子或与佐剂联合使用。将疫苗抗原特异性的靶向树突状细胞(dendritic cell,DC)可改善疫苗的免疫原性。DC-SIGN(DC-specific ICAM-grabbing non-integrin)是树突状细胞膜表面的一种C型凝集素受体，利用化学交联或基因工程方法将抗原与DC-SIGN配体联合，将抗原特异性的靶向DC，可显著促进疫苗的递呈及免疫效果[57]。VLPs疫苗的递送系统，对提高VLPs疫苗的免疫原性也十分重要，例如采用MPL/DDA佐剂递送FMDV VLPs疫苗，MPL/DDA VLPs疫苗可以诱导高水平的特异性抗体滴度和强大的细胞免疫反应。不仅可以诱导特定IFN-γ+CD4+(Th1)、IL-17A+CD4+(Th17)和IFN-γ+CD8+T细胞，还可以诱导特异性多功能CD4+和CD8+记忆T细胞共同表达IFN-γ、TNF-α和IL-2[58]。与之相似，FMDV VLPs和AuNC的联合使用增加了细胞VLPs的摄取，并促进了RAW264.7细胞和DC中细胞因子的分泌，诱导产生高水平的特异性抗体和FMDV的中和抗体[59]。此外，合理的免疫程序也是提高VLPs免疫效率的重要因素。防疫人员可以根据疫病的流行特点，可一次多病原一针免疫，优化应用疫苗带来的反复加强免疫，省时省本。

7 结语

随着科技的发展，科研人员的奉献专研，动物疫苗在不断地迭代，尤其近年来亚单位疫苗、DNA疫苗、VLPs疫苗等新型疫苗的接连问世，解决了防疫人员的盲区。VLPs具有稳定、安全、绿色以及独特的结构等特点，利用VLPs开发新型疫苗逐渐发展为一门学科，它整合了病毒学、微生物学、免疫学和疫苗学的相关知识，已经成为生产疫苗的优势选择。相关研究显示，VLPs自身具有佐剂分子的功能效应，不需要与佐剂混合乳化就可诱导机体产生有效的免疫刺激[60-61]。VLPs安全性高、细胞摄取效率高，具有良好的溶解度与生物相容性及靶向给药和载药能力[62]，还可通过与天然病毒感染相似的途径呈递给树突状细胞，继而有效地诱导动物机体产生体液与细胞免疫，因此，VLPs被认为是一种理想的生物载体。当代的研究中，VLPs已经不仅仅作为疫苗而使用，更成为疫苗研究以及更多新型纳米材料的载体，VLPs稳定性高、无毒副作用、组织穿透性强、免疫效果好，是未来很有前景的疫苗研发热点。