鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的研制及亚细胞定位

提金凤,李志杰*,王海燕,李 舫,刁有祥 （.山东畜牧兽医职业学院,山东 潍坊 606；.寿光市纪台镇畜牧兽医工作站,山东 寿光 67；.山东农业大学 动物科技学院,山东 泰安 708）

鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus,DTMUV）感染是2010年我国南方地区最早出现的一种病毒性传染病,该病以水禽感染为主,传播速度快,波及范围广,短时间内蔓延至全国[1-2]。雏鸭、育成鸭感染后以病毒性脑炎为特征,表现瘫痪、站立不稳、倒地震颤等症状；产蛋鸭感染后表现产蛋率下降、卵泡出血、破裂,形成卵黄性腹膜炎等,给养禽业带来了巨大的经济损失[3]。DTMUV属于黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群中的蚊媒类病毒,基因组主要编码3种结构蛋白（C、pr M和E）和7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）[4-5]。其中,NS1蛋白是一种与细胞膜功能密切相关的糖蛋白,在细胞融合及免疫应答中发挥重要作用,可能参与DTMUV早期的复制、装配和释放[6-7]。NS1蛋白含有多个保护性抗原表位,可以诱导机体产生非中和性的保护性抗体,这种抗体不会引起病毒的抗体依赖性感染增强作用[8],这意味着NS1蛋白在新型疫苗研制、蛋白功能研究及检测方法建立等方面有潜在应用价值。

本试验以DTMUV NS1原核表达蛋白作为免疫原,采用间接ELISA方法筛选到2株针对NS1蛋白的单克隆抗体,明确了NS1蛋白的亚细胞定位,为进一步揭示NS1蛋白的功能和病毒的致病机制提供了有效工具,奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1细胞、病毒、菌株及实验动物DTMUVSDSG（KJ740747.1）由山东农业大学动物科技学院禽病研究室保存；BHK21细胞、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14购自中国典型培养物保藏中心；大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）购自宝生物工程（大连）有限公司；SPF鸡胚购自山东省农业科学院SPF鸡场；BALB/c小鼠、昆明鼠购自山东大学医学院。

1.2主要试剂过氧化物酶（HRP）标记山羊抗鼠IgG购自北京索莱宝科技有限公司；PEG4000、氨基喋呤（A）、HT、TRIzol、RNA酶抑制剂购自Sigma公司；FITC标记山羊抗小鼠IgG（H＋L）购自上海碧云天生物技术有限公司；高糖型DMEM购自海克隆；反转录试剂盒、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒购自宝生物工程（大连）限公司；小牛血清购自北京全式金生物公司；单抗亚类鉴定试剂盒、EcoRⅠ、HindⅢ购自Thermo Scientific公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3试验器材凝胶成像系统（美国BIORAD）；电泳仪和转印仪（北京市六一生物科技有限公司）；荧光倒置显微镜（日本尼康Nikon TE2000）；酶标仪（美国,BIORAD）；激光共聚焦显微镜（德国莱卡）；CO2培养细胞培养箱（力康公司,Heal Force）。

1.4DTMUV NS1蛋白单克隆抗体的研制

1.4.1单克隆抗体免疫抗原和筛选抗原的制备将DTMUV-SDSG毒株通过尿囊腔途径接种SPF鸡胚进行病毒扩增,收集24～72 h之间死亡鸡胚的尿囊液,—20℃保存,作为制备单克隆BALB/c小鼠的免疫抗原。检测该病毒的鸡胚半数致死量为104.8ELD50/0.2 m L。构建 表达DTMUV NS1蛋白的原核重组质粒p ET-28-NS1,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达并鉴定,具体方法参考文献[9]。含重组质粒p ET-28-NS1的阳性菌液扩大培养后超声波裂解,沉淀用0.5,1.0,3.0 mo L/L尿素溶液12 000 r/min离心洗涤5 min,洗涤后的沉淀用8 mo L/L的尿素溶液溶解,SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果,BCA蛋白测定试剂盒测定纯化后的蛋白浓度,纯化的NS1蛋白作为单克隆抗体的筛选抗原。

1.4.2单克隆抗体的制备 据报道,DTMUV能通过脑内途径感染BALB/c小鼠和昆明鼠,本试验采用新扩增的DTMUV尿囊液作为免疫原,通过脑内注射方式免疫4周龄SPF级BALB/c小鼠,剂量为50μL/只,每隔2周免疫1次,第3次免疫后1周,加强免疫1次（免疫剂量加倍）,3 d后细胞融合。细胞融合参照文献[10-11]方法进行。无菌取免疫小鼠的脾淋巴细胞,以PEG-4000为融合剂,与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0以3∶1的比例融合,HAT培养基选择培养至10 d,用HT培养基将HAT培养基换掉,继续培养。采用间接ELISA法进行检测变黄的细胞上清,具体方法参考文献[9]。以免疫小鼠血清为阳性对照,未免疫小鼠血清和骨髓瘤细胞上清为阴性对照。阳性杂交瘤细胞按照有限稀释法进行亚克隆,至所有亚克隆细胞孔的阳性率均为100%,扩大培养,及时冻存。

1.4.3腹水的制备 灭菌石蜡腹腔注射10周龄SPF级BALB/c小鼠,每只小鼠0.5 m L,制备腹水。10 d后,腹腔注射阳性杂交瘤细胞（150万/只）。待小鼠腹部明显隆起时,从腹腔采集腹水,1 000 r/min离心10 min,吸出脂肪组织,置于—20℃保存备用。

1.4.4Western blot鉴定 分别诱导含重组质粒p ET-28-NS1和空载体p ET-28a（＋）的大肠杆菌BL21（DE3）菌液,将诱导后的菌液进行SDS-PAGE电泳。采用湿式转印仪将凝胶上的蛋白条带转印到硝酸纤维素（NC）膜上,采用5%脱脂乳37℃封闭2 h或4℃封闭过夜。加入杂交瘤细胞株上清,37℃作用1 h,TBST洗涤3次,每次5 min。加入HRP标记山羊抗鼠IgG（1∶5 000稀释）,37℃作用1 h,TBST洗涤3次,每次5 min。DAB避光显色,流水终止反应。

1.4.5单克隆抗体亚类鉴定 采用亚类鉴定胶体金试剂条,在加样孔中加入待检测的单克隆抗体,室温作用5～10 min,观察结果。具体方法参照试剂盒说明书。

1.5DTMUV NS1蛋白亚细胞的定位

1.5.1DTMUV NS1蛋白亚细胞定位的预测 利用softberry在线预测软件中的ProtComp/Predict the sub-cellular localization for Animal/Fungi proteins预测功能,输入DTMUV NS1蛋白的氨基酸序列,在线软件根据输入的序列特征预测DTMUV NS1蛋白的亚细胞定位。

1.5.2细胞爬片的处理及制备 盖玻片先用浓硫酸浸泡过夜,流水冲洗干净后用75%乙醇浸泡2～3 d,超纯水清洗干净后高压灭菌,烘干后备用。将处理好的盖玻片轻轻放在12孔细胞培养板中,然后将处于对数生长期的BHK21细胞分装至细胞板中,待细胞密度达到85%～90%时即可。

1.5.3IFA及DAPI染色 在放有细胞爬片的细胞培养板中加入适量DTMUV液,病毒液以盖过细胞为宜,37℃病毒吸附作用1 h。弃掉病毒,无菌PBS洗涤2～3次,加入含2%小牛血清的DMEM培养基,37℃、CO2培养箱培养。待出现大约50%细胞病变时,采用甲醇和丙酮（1∶1）混合液进行细胞固定,—20℃作用15 min。PBS洗涤细胞3次,每次5 min。加入NS1单克隆抗体的腹水稀释液作为一抗,37℃作用1 h后,PBS洗涤细胞3次,每次5 min。加入FITC标记的羊抗鼠荧光二抗,37℃避光作用1 h后,PBS洗涤细胞3次,每次5 min。

IFA结束后,加入DAPI染色液进行细胞核染色,轻晃细胞培养板使染色液均匀盖过细胞层表面,避光染色5 min,PBS洗涤3～5次,每次5 min。缓慢取出细胞爬片,铺有细胞的一面平放于载玻片上,中性树脂封片,避光保存。激光共聚焦显微镜观察目的蛋白的亚细胞定位情况。

2 结果

2.1DTMUV NS1蛋白单克隆抗体的研制

2.1.1单克隆抗体免疫抗原的制备 原核表达蛋白NS1经不同浓度尿素洗涤纯化,SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果,结果显示只在45 k Da左右的位置上出现了条带,表明获得了纯度较高的表达蛋白（图1）。定量纯化后的NS1蛋白,质量浓度为4.16 g/L。

图1 NS1蛋白纯化后的SDS-PAGE鉴定

2.1.2杂交瘤细胞株的建立及生物学特性 采用间接ELISA法筛选到2株针对DTMUV NS1蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2H4和3G2。将获得的杂交瘤细胞株传代培养后,依然能稳定分泌单克隆抗体。对2株杂交瘤细胞株的细胞上清及腹水采用间接ELISA法测定抗体效价。结果显示,2株杂交瘤细胞株能持续分泌效价较高的特异性抗体,两者分泌的单抗属于不同免疫球蛋白亚类（表1）。

表1 2株杂交瘤细胞的部分生物学特性

2.1.3Western blot鉴定 将重组质粒p ET-28-NS1诱导表达的NS1蛋白转印到NC膜上,与2株杂交瘤细胞株2H4、3G2细胞上清进行Western blot反应。结果显示,2株杂交瘤细胞上清均与p ET-28-NS1诱导表达的NS1蛋白反应,在45 k Da左右的位置出现了特异性条带,而在诱导表达空载体p ET-28a（＋）（阴性对照）的位置上没有出现任何条带（图2）。

图2 2株单抗的Western blot鉴定

2.2DTMUV NS1蛋白的亚细胞定位

2.2.1DTMUV NS1蛋白亚细胞定位的预测 选择softberry在线预测软件的ProtComp/Predict the sub-cellular localization for Animal/Fungi proteins的预测功能,预测DTMUV NS1蛋白的亚细胞定位。软件对蛋白可能存在的亚细胞位置打分,分值越高,蛋白质定位的可能性越大。结果显示,细胞质的分值最高,表明DTMUV NS1蛋白可能定位于细胞质中（图3）。

图3 DTMUV NS1蛋白亚细胞定位预测结果

2.2.2TMUV NS1蛋白亚细胞定位的观察 IFA反应结束后采用DAPI进行细胞核染色,染色后的细胞爬片通过激光共聚焦显微镜观察蛋白的亚细胞定位。结果显示,DTMUV感染BHK-21细胞后产生的NS1蛋白与NS1蛋白的单抗发生了反应,在蓝色细胞核的外周出现了特异性的绿色荧光,也就是细胞质（图4）。可见,DTMUV NS1蛋白主定位于细胞质,这与软件的预测结果是一致的。

图4 DTMUV NS1蛋白在BHK21细胞中的定位

3 讨论

TMUV与登革病毒（DENV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）、西尼罗病毒（WNV）等同属于黄病毒科、黄病毒属中的蚊媒类病毒,蚊蝇在该病毒的传播中发挥着重要的媒介作用[12]。TMUV开放阅读框只编码一种多聚蛋白,NS1蛋白能在感染早期诱导机体产生抗体,在TMUV感染[13]的早期检测和诊断中意义重大。

顾香雪等[14]利用纯化的DTMUV NS1原核蛋白作为免疫原和筛选抗原制备针对NS1蛋白的单克隆抗体,由于免疫原和筛选抗原都是原核表达蛋白,这样容易筛选到针对杂蛋白的单抗,增加了单抗筛选难度。获得的单抗有可能不与DTMUV感染过程中产生的NS1蛋白（真核蛋白）反应,应用范围小。据报道[15-17],DTMUV活毒能通过脑内接种方式感染BALB/c小鼠和昆明鼠,严重者甚至导致小鼠发病死亡,小鼠体内产生针对DTMUV的抗体,但由于TMUV只感染了1次,抗体效价不高。本研究选择DTMUV活毒作为BALB/c小鼠的免疫原,并实施多次免疫,以获得高水平抗体；原核表达TMUV NS1蛋白作为筛选抗原,进行单克隆抗体的筛选,通过选择不同的免疫原和筛选抗原,会更容易筛选出针对NS1蛋白的特异性单抗,而且筛选到的单抗既能与原核蛋白反应,也能与病毒自然感染过程中产生的NS1蛋白结合。

本试验中研制的单抗效价为1.2×105以上,远高于顾香雪等[14]研制的单抗效价（1.28×104）,这可能与本研究选择了DTMUV活毒作为免疫原,且实施多次免疫关系密切。IFA、Western blot鉴定单抗具有较高特异性,而且能有效识别天然病毒DTMUV NS1蛋白,这为水禽DTMUV感染早期病毒或抗体检测提供重要的试剂或工具。

蛋白质在细胞中的位置与其在生物体中发挥的功能和作用密切相关,只有当其处于特定亚细胞位置时才能行使功能、发挥作用[18]。目前,蛋白质亚细胞定位方法较多,如可以选择带有绿色荧光蛋白GFP基因的真核表达载体PEGFP-N1或PEGFPC1,构建目的蛋白的真核重组表达载体,使目的蛋白与GFP绿色荧光蛋白融合表达,通过观察GFP蛋白绿色荧光的位置确定目的蛋白的定位[19]。虽然该方法操作简单,不受基因类型干扰,但有时GFP蛋白会对细胞造成干扰和毒性,导致试验失败。本研究直接将TMUV感染细胞,病毒感染后产生的NS1蛋白会被运输到细胞的特定位置执行功能,用NS1蛋白的单抗能准确鉴定NS1蛋白的位置。病毒感染细胞过程中产生的NS1蛋白不受融合蛋白影响,与在实际生产中病毒感染动物机体的作用机制一致,因此这种方式进行NS1蛋白亚细胞定位于DTMUV感染动物机体后NS1蛋白在细胞中的定位是一致的。

总之,DTMUV NS1蛋白单克隆抗体的研制为建立DTMUV早期感染的诊断方法,研究蛋白的致病机制及相互作用提供了重要的手段和工具,而且本研究还利用获得的NS1蛋白的单抗准确的进行了NS1蛋白亚细胞定位,为进一步理解和揭示该蛋白的结构与功能奠定了基础。