检测猫杯状病毒RT-qPCR方法的优化与应用

刘 迪,郑亚婷,许鑫燕,董丽丽,康洪涛,姜 骞,杨鸣发,刘家森*,曲连东* （.中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 50069；.东北农业大学 动物医学学院,黑龙江 哈尔滨 50030）

猫杯状病毒（feline calicivirus,FCV）是引起猫呼吸系统疾病的高度流行病原体,常感染1岁以下的幼猫,猫感染FCV后通常会引起的临床表现为口腔溃疡、发热、打喷嚏、鼻炎、结膜炎[1],非典型症状可引起跛行、腹泻或致死性全身性疾病（virulent systemic disease,VSD）[2]。临床病猫康复后以及无症状携带者仍可长期排毒,有利于FCV在猫群中的扩散,是重要的传染源[3],更有甚者会危及到老虎、猎豹等珍稀野生动物,当其饲养密度过大时,容易暴发FCV,一旦暴发将很难控制,此种报道屡见不鲜[4-6]。自FCV首次被分离至今,其宿主谱在不断的扩大,严重威胁猫犬及珍稀野生动物的生命健康,FCV暴发对宠物及野生动物行业带来严重的经济损失[7-10]。FCV无囊膜,属杯状病毒科（Calicivirdae）,水泡疹病毒属（Vesivirus）[11]。病毒的基因组为线性单股正链RNA,不分节段,基因组全长含7 690个核苷酸,分为3个阅读框（ORFs）。病毒的RNA基因组极易发生变异,经Meg Align软件比对,ORF1基因的同源性为85.68%,ORF2基因的同源性为80.00%,ORF3基因的同源性为33.34%。近几年越来越多的FCV变异株在国内外被分离给FCV的防控带来了严重的困难。虽然FCV感染通常不会危及生命,但高毒力的FCV暴发导致高病死率（40%～60%）[12]。

随着变异毒株的增多,原有的核酸检测方法不太适宜新的检测要求,需要针对更为保守的序列片段,开发新的检测引物和方法。本试验拟建立的灵敏、特异、通用且重复性良好的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,为FCV的诊断及预防提供更为有效的技术手段。

1 材料与方法

1.1病毒、主要试剂与仪器FCV、猫细小病毒（feline parvovirus,FPV）、猫疱疹病毒（feline herpesvirus,FHV）、猫传染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus,FIPV）由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自然疫源性人兽共患病创新团队实验室保存；Fine Quick快速病毒DNA/RNA柱式提取试剂盒为济凡生物科技有限公司产品；HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（＋gDNA wiper）、Cham Q Universal SYBR qPCR MAster Mix、2×PCR Star Mix均为诺唯赞生物科技有限公司产品；p MD18-T载体、DNA Marker为TaKaRa公司产品；Top10感受态细胞为天根生化科技有限公司产品；AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit为AXYGEN公司产品；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒为上海生工有限公司产品；PCR仪、电泳仪均为BIO-RAD公司产品；超微量分光光度计（P330）；荧光定量PCR仪（ABI公司）；微型离心机及倒置荧光显微镜（Life公司）

1.2引物设计与合成通过对NCBI上登录的所有FCV的全基因组序列分析和比较,选取FCVORF1的基因序列保守区域,设计1对特异性引物,FCV-F:5′-25TCAAACTCTGAGCTTCGTGC44-3′,FCV-R:5′-198CAGTCAGGACAAACGTCATAAC177-3′,扩增目的片段长度为174 bp。引物由吉林库美生物科技有限公司合成。

1.3标准品质粒的制备按照提取试剂盒的说明,提取实验室保存的FCV（TIG-Ⅰ毒株）病毒RNA,以此RNA为模板进行cDNA的合成。PCR反应体系:2×PCR Star Mix 12.5μL,FCV-F和FCV-R各1μL,cDNA 2μL,dd H2O补充至25μL。反应条件如下:95℃5 min；30个循环（94℃30 s,57℃30 s,72℃30 s）；72℃10 min；4℃保存。反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,切胶回收纯化目的片段。将目的片段与p MD18-T载体连接,然后将连接产物转化至Top10感受态细胞中获得重组质粒。将测序正确的重组质粒作为荧光定量RT-PCR的标准品,使用超微量分光光度计对重组质粒标准品进行浓度和纯度的测定,并进一步换算为拷贝数[13]。

1.4SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

1.4.1标准曲线的建立 重组质粒做10倍比稀释,设计7个稀释梯度（4.93×108～4.93×102拷贝/μL）作为模板进行荧光定量RT-PCR。反应体系:2×Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL,FCV-F（10μmol/L）0.2μL,FCV-R（10μmol/L）0.2μL,模板2μL,RNase-free H2O补充至20μL。反应条件如下:95℃30 s；40个循环（95℃10 s,57℃30 s）95℃15 s,60℃1 min,95℃15 s。不同浓度的模板分别做3个重复孔,同时设置阴性对照。利用GraphPad 8.0.2对试验结果进行分析,绘制标准曲线,计算相关系数。

1.4.2敏感性试验 以8个不同稀释度的重组质粒（4.93×107～4.93×100拷贝/μL）为模板,用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法进行检测（同1.4.1）,计算出该方法所能检测出的最低模板拷贝数,同时设置阴性对照。用普通RT-PCR方法进行验证（同1.3）并比较2种方法的灵敏性。

1.4.3特异性试验 应用本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR的方法对FCV、FHV、FPV、FIPV的DNA或cDNA进行特异性试验,并设置阴性对照。

1.4.4重复性试验 取3个不同浓度梯度（4.93×105,4.93×104,4.93×103拷贝/μL）的质粒标准品为模板,每个浓度做3个重复孔,进行组内重复试验；同时每个浓度分别做3次独立的重复性检测作为组间重复试验。统计组内和组间每个稀释度样品的平均Ct值、标准差、变异系数（%）,以评价该方法的重复性和稳定性。

1.5FCV实时荧光定量RT-PCR方法的通用性分析根据NCBI上登录的所有FCV毒株序列,用Meg Align软件分析所设计的引物FCV-F和FCVR靶位点的变异情况,如图1所示。合成5段（176 bp）核酸序列并构建到p MD18-T载体,此5个重组质粒,涵盖了下游引物FCV-R靶位点的所有碱基的突变情况,序列见表1。对本实验室保存的不同FCV毒株,取同等含量的病毒（1 000TCID50）提取病毒RNA,进行反转录,合成cDNA。采用本试验建立的实时荧光定量RT-PCR方法分别检测5个重组质粒和不同的FCV毒株,并设置阴性对照,以评估其对FCV检测的通用性。

图1 引物FCV-F和FCV-R靶向结合区域在已知FCV毒株中变异情况

表1 重组质粒中引物结合区域序列情况

1.6临床样本的检测以及病毒的分离与鉴定应用本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RTPCR方法对23份疑似患FCV病猫的口腔拭子进行检测,计算其阳性检出率。然后对阳性病料盲传5代后进行病毒分离,观察细胞病变情况,若病变,对细胞病变产物进行普通RT-PCR扩增并测序。

2 结果

2.1重组质粒标准品的鉴定提取FCV TIG-Ⅰ毒株RNA,通过普通RT-PCR反应,扩增出174 bp片段,与预期结果相符,如图2所示。将目的片段连接入p MD18-T载体,并测序,同源性为100%,表明质粒标准品构建成功,可作为阳性模板用于后续试验。

图2 RT-PCR扩增的目的基因

2.2标准曲线和熔解曲线的绘制以4.93×108～4.93×102拷贝/μL的重组质粒为模板,进行荧光定量RT-PCR,得到标准曲线,相关系数R2＝0.994 8,表明起始模板浓度与Ct值呈现良好的线性关系,质粒标准品合格；熔解曲线呈单一波峰,熔解温度为84℃,说明该方法的特异性良好（图3,4）。

图3 FCV实时荧光定量RT-PCR方法的标准曲线

2.3敏感性试验以4.93×107～4.93×100拷贝/μL的质粒标准品稀释液为模板,分别进行实时荧光定量RT-PCR和普通RT-PCR检测。结果显示,实时荧光定量RT-PCR检测方法可以检测到FCV的最低拷贝数为4.93×101拷贝/μL,而普通RT-PCR方法检测的最低拷贝数为4.93×103拷贝/μL。实时荧光定量RT-PCR检测方法的敏感性比普通RT-PCR检测方法高100倍（图5,6）。

图4 FCV实时定量RT-PCR检测方法的熔解曲线

图5 实时荧光定量RT-PCR敏感性试验扩增曲线

图6 普通RT-PCR敏感性试验结果

2.4特异性试验采用本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法分别对FHV、FPV、FCV及FIPV的DNA或cDNA进行特异性试验。结果显示,FCV有明显的扩增曲线,其他病毒无扩增曲线（图7）。试验结果表明,该方法具有良好的特异性。

图7 荧光定量RT-PCR特异性试验结果

2.5重复性试验取3个不同浓度的质粒标准品分别进行组内和组间重复性试验,结果显示,组内重复的变异系数（CV）为0.09%～0.71%（表2）,组间重复的变异系数（CV）为0.05%～0.82%（表3）,两者变异系数均小于1%,说明该方法具有良好的重复性,SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR扩增效率比较稳定。

表2 组内重复性试验结果

表3 组间重复性试验结果

2.6实时荧光定量RT-PCR方法的通用性分析对本实验室保存的不同FCV毒株进行测序,其针对引物FCV-F和FCV-R结合区域的碱基突变情况（图8）。将这些FCV毒株调整到相同的TCID50,用本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法分别对相同浓度的不同FCV毒株和相同浓度的5个重组质粒进行检测,结果显示,以FCV的cDNA为模板和以质粒为模板均有相应的扩增曲线（图9,10）,表明该引物的通用性较好。

图8 10株FCV毒株碱基突变情况

图9 荧光定量RT-PCR方法检测质粒

2.7临床样品检测以及病毒的分离与鉴定用本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法对23份疑似患FCV的猫口腔拭子进行检测,结果显示,实时荧光定量RT-PCR共检出14份阳性样品,阳性率为60.9%。然后对阳性病料进行病毒分离,盲传5代后进行普通RT-PCR扩增后测序,结果显示,接毒后第5代的CRFK细胞开始出现圆缩,葡萄串样,部分细胞发生脱落,如图11所示；且RT-PCR扩增后测序,结果证实为FCV。由此说明,本试验建立的实时荧光定量RT-PCR方法可以灵敏地检测出阳性样品,结果准确率较高。

图10 荧光定量RT-PVR方法检测不同FCV毒株

图11 FCV分离鉴定结果

3 讨论

RNA病毒的突变率远远高于DNA病毒。例如,2019年底暴发的SARS-Co V-2病毒,已知103个全基因组序列中突变位点达到149个[14],变异后的SARS-Co V-2毒株需要设计不同的特异性引物对其进行检测[15]；又如流感病毒的基因容易发生变异[16],这给其核酸检测的准确性造成了困难。再者与FCV同为杯状病毒科的诺如病毒,由于其基因的高变异性需要设计多对引物对疑似样品进行确诊[17]。而FCV也属于RNA病毒,各毒株基因同源性之间差异显著,已经报道的众多实时荧光定量RT-PCR方法[18-20],不适宜变异毒株的检测要求,容易导致检测结果不准确。因此对于FCV的防控,需要一种通用可行的检测方法。

本试验通过比对NCBI上已登录的所有FCV全基因组序列,并对上、下游引物的突变位点进行对比,找出所有突变情况并合成相应的核酸序列后构建重组质粒。利用本方法分别对相同重组质粒和本实验室保存不同FCV毒株进行检测,结果表明本方法具有良好的通用性:随着某些碱基位点发生变异,检测不同FCV毒株的Ct值差异不显著,而检测质粒Ct值不尽相同,说明上、下游引物结合区域的碱基突变位置或突变个数的不同会导致扩增效率不一,但仍均有相应的扩增曲线,因此本方法能够更好地检测不同序列的FCV,这对FCV的检测具有重要意义。普通RT-PCR是比较常见的核酸检测技术,但敏感性不显著,而本研究除了具有良好的通用性外,检测灵敏度也较高,可达49.3拷贝/μL,比普通RT-PCR检测下限高100倍,而且只能检测出FCV,未能检测出其他猫相关病毒,可见本方法特异性良好。同时组内和组间重复性试验的变异系数均小于1%,说明本试验的重复性及稳定性较好。

本试验采用该方法对哈尔滨市某猫舍23份疑似患FCV的猫口腔拭子进行检测,阳性检出率为60.9%,且后期的病毒分离鉴定结果也显示检测出的阳性病料均能分离出FCV,同时结果也表明,虽然某些猫临床症状不明显,但仍能检测出FCV,说明哈尔滨地区猫患FCV的感染率较高,结合中国其他地区该病的流行情况来看不容乐观,应当加强对FCV的流行调查和防控[21]。总之,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法有利于FCV的早期诊断,这为防控FCV的流行具有重要意义。