山东省养鸡场大肠杆菌多黏菌素耐药基因mcr-1的流行情况

张 印,苑晓萌,李璐璐,张 庆,胡 明,齐 静,骆延波,赵效南,刘玉庆 （山东省农业科学院 畜牧兽医研究所,山东 济南 250100）

抗生素耐药性是一个持续存在并严重影响公共安全和动物健康的问题[1]。此问题不仅出现在病原菌中,而且也存在于非病原菌中。多重耐药细菌（MDR）在过去10年中呈逐年增加的趋势,并引起了全世界的广泛关注[2]。在动物饲料中添加大量的抗生素亚治疗剂量是耐药菌迅速传播的一个非常重要的原因[3]。多黏菌素主要用来治疗食品性动物,并已被认为是治疗多重耐药革兰阴性菌,特别是耐碳青霉烯类肠杆菌科感染的“最后一道防线”[4-5]。然而,多黏菌素在动物和人类中的应用促进了mcr-1耐药菌株传播[6]。自从mcr-1在我国华南地区的食物、动物和人类的细菌中被发现后,随后世界各国陆续报道[7-8]。据报道,mcr-1主要局限于肠杆菌科,包括大肠杆菌[9]。大肠杆菌是脊椎动物肠道和温血动物的常见寄居者[10]。此外,禽源大肠杆菌具有能够引起人类感染的人畜共患病潜力[11]。

对禽源大肠杆菌的流行病学调查显示,我国的mcr-1携带率从2009年的5.2%上升到2014年的30.0%[12]。山东省为第一养鸡大省,每年出口肉鸡的数量居全国首位。发展和完善对耐药菌的监测工作是预防和控制耐药菌传播和疾病暴发的重要基础。然而,近年来有关山东省养鸡场大肠杆菌mcr-1的研究相对缺乏。因此,本研究旨在调查2017—2018年间山东省养鸡场大肠杆菌mcr-1的流行情况,以预防和控制耐药菌的传播。

1 材料与方法

1.1试验菌株来源大肠杆菌分离株679株,分离自山东省8个大型集约化养鸡场新鲜粪便样品。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922购自中国普通微生物菌种保管中心。

1.2试验试剂及药物普通肉汤、伊红美兰培养基、麦康凯培养基、胰蛋白酶大豆肉汤均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。阿莫西林（含量95%）/克拉维酸（含量95%）、阿莫西林（含量95%）、氨 苄西林（含量96%）、头孢噻 呋（含 量100%）、恩 诺 沙 星（含 量100%）、新 霉 素（含 量32.5%）、强力霉素（含量99%）、氟苯尼考（含量99%）、庆大霉素（含量50%）和多黏菌素（含量100%）等药物标准品均购自中国兽医药品监察所。

1.3样品采集2017年8月至2018年5月,选择山东省潍坊、德州、烟台、青岛和聊城地区的8个大型集约化养鸡场（场1～场8）作为采样点。我们选择养鸡场的规模均超过15万只,品种为AA肉鸡,在25～30日龄之间。每个养鸡场采集90份新鲜粪便样品,共720份样品,在低温条件下送实验室进行细菌分离鉴定。

1.4细菌分离培养取0.2 g粪便样品,加入含有5 m L肉汤培养基的试管中,在需氧条件下,37℃过夜培养12 h。用接种环将过夜培养的培养液接种到伊红美兰培养基中,37℃培养18～24 h。选择具有金属光泽的典型菌落接种到麦康凯培养基中,37℃培养18～24 h。挑选红色单菌落进一步利用API 20E系统进行生化鉴定。所有阳性菌株—20℃、20%胰蛋白酶大豆肉汤甘油保存。

1.5mcr-1耐药基因的检测用胰蛋白酶大豆肉汤复苏所有大肠杆菌分离株。利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒根据说明书提取细菌DNA。通过PCR扩增mcr-1耐药基因,上游引物序列CLR5-F:5′-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-3′,下游引 物序列CLR5-R:5′-CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3′。反应运行参数为:94℃10 min；94℃30 s,52℃50 s,72℃1 min,32个循环；72℃5 min。PCR扩增产物送生工生物工程股份有限公司测序,测序结果与GenBank的数据库相比对,以确定mcr-1耐药基因。

1.6药物敏感试验通过临床和实验室标准协会推荐的琼脂稀释法对所有大肠杆菌分离株测定10种常用抗菌药物的敏感性,药物包括阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林、氨苄西林、头孢噻呋、恩诺沙星、新霉素、强力霉素、氟苯尼考、庆大霉素和多黏菌素等[13]。其中,多黏菌素的敏感性根据EUCAST指南（www.u EAST.org）进行判断。本试验以大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株。

1.7耐药基因检测利用文献[14]报道的引物和条件,通过PCR对携带mcr-1菌株扩增β-内酰胺酶基 因（ESBL）（blaTEM、blaCTX-M、blaOXA、blaSHV和blaPSE）和喹诺酮类耐药基因（PMQR）（aac（6'）-Ibcr、qnr A、qnrB、qnrC、qnrD、qep A、oqx A和oqx B）。利用1.5%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳,并通过图像采集系统（Tanon-2500,中国上海）采集图像。

1.8统计学分析采用Fisher精确检验或卡方检验对mcr-1阳性菌株和mcr-1阴性菌株的耐药性进行统计,并使用GraphPad INSTAT（GraphPad Software,Inc.,USA）软件进行分析。P＜0.01被认为差异显著。

2 结果

2.1细菌分离鉴定从720份样品中共分离到697株大肠杆菌。其中,养鸡场1分离到84株,养鸡场2分离到90株,养鸡场3分离到87株,养鸡场4分离到89株,养鸡场5分离到87株,养鸡场6分离到90株,养鸡场7分离到84株,养鸡场8分离到86株（表1）。

表1 大肠杆菌在养鸡场中的分离鉴定及mcr-1流行情况

2.2mcr-1耐药基因检测本试验共采集697株大肠杆菌,其中83株（11.9%）携带mcr-1基因（图1）。83株mcr-1阳性菌株分别来自养鸡场1（n＝2）、养鸡场2（n＝5）、养鸡场3（n＝2）、养鸡场4（n＝2）、养鸡场5（n＝31）、养鸡场6（n＝29）、养鸡场7（n＝7）和养鸡场8（n＝5）。mcr-1的携带率为11.9%（表1）。

图1 mcr-1耐药基因PCR扩增结果

2.3药敏试验83株mcr-1阳性菌株对氨苄西林的耐药率较高（82/83,98.8%）,其次是阿莫西林（81/83,97.6%）和氟苯尼 考（79/83,95.2%）,对阿莫西林/克拉维酸的耐药率较低（18/83,21.7%）。此外,本试验发现mcr-1阳性大肠杆菌对头孢噻呋、恩诺沙星、庆大霉素和多黏菌素的耐药性高于mcr-1阴性大肠杆菌（表2）。

表2 携带mcr-1大肠杆菌和非携带mcr-1大肠杆菌的药物敏感试验结果

2.4耐药基因检测在83株mcr-1阳性大肠杆菌中,共检测到5种ESBL基因,其中所有菌株均携带blaTEM（83/83,100%）,其 次 是blaCTX-M（67/83,80.7%）,blaPSE（18/83,21.7%）,blaOXA（13/83,15.7%）和blaSHV（2/83,2.4%）。检 测 到4种PMQR基因,其中aac（6'）-Ib-cr（34/83,40.9%）的检出率最高,其次为qnr A（9/83,10.8%）、qnrB（3/83,3.6%）和qnrC（1/83,0.1%）,未检 测 到其他PMQR基因,部分耐药基因PCR扩增结果见图2,3。

图2 bla TEM耐药基因PCR扩增结果

图3 aac（6'）-Ib-cr耐药基因PCR扩增结果

3 讨论

多黏菌素耐药基因mcr-1的出现,使得多黏菌素耐药性问题受到全世界广泛的关注[15]。由于抗菌治疗选择性压力的增加有助于mcr-1耐药基因的迅速传播[16]。本试验从697株大肠杆菌中检测到83株携带mcr-1基因,携带率为11.9%,明显低于张荣民[17]从肉鸡生产链中大肠杆菌mcr-1的检出率（36.4%）。据报道,2000—2014年日本从健康动物中分离出9 303株大肠杆菌,其中39株携带mcr-1基因（0.42%）[18]；在欧洲,2008—2014年从牛、猪和鸡中共分离出10 206株大肠杆菌,其中68株（0.7%）携带mcr-1基因[19]。不同地区mcr-1携带率的不同可能与养鸡场用药情况、采样时间和方式有关。此外,在本试验中,每个养鸡场mcr-1流行情况不同,可能与养鸡场的管理方式以及所处的地理位置有关。

在本试验中,我们注意到mcr-1阳性大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林和氟苯尼考的耐药率较高,与ZHUGE等[20]报道的结果一致。在本试验中,大多数mcr-1阳性大肠杆菌对阿莫西林/克拉维酸表现为敏感,这可能与该药物不经常在养鸡场中使用有关,并与其他报道相一致[21]。在本试验中,mcr-1阳性菌株对多黏菌素的耐药性明显高于mcr-1阴性菌株,这表明mcr-1阳性大肠杆菌的耐药表型与基因型之间存在着密切的正相关关系,并与之前的大量研究相符[12,20]。此外,本试验结果表明,mcr-1阳性菌株对头孢噻呋、恩诺沙星和庆大霉素的耐药性明显高于mcr-1阴性菌株,这一结果是否具有普遍性及其机制有待进一步研究。

ESBL和mcr-1磷酸乙醇胺转移酶分别被认为在第3代头孢菌素和多黏菌素耐药机制中所起作用主要是通过质粒介导来实现的,是目前医学和兽医界关注的主要问题。大量研究已经证明,从动物中分离的大肠杆菌mcr-1基因和ESBL基因可以共同存在于同一质粒上[22]。在本试验中,所有携带mcr-1菌株均携带blaTEM,这与98.8%的mcr-1阳性菌株对氨苄西林耐药的结果一致。据报道,携带blaCTX-M的肠杆菌在人类中广泛存在,但越来越多的研究证明在食品动物及其环境中也可以检测到blaCTX-M[21-23]。在本试验中,80.7%mcr-1阳性菌株携带blaCTX-M,同时YANG等[24]也研究发现有1/2以上mcr-1阳性鸡源大肠杆菌可以同时检测到mcr-1和blaCTX-M基因。

喹诺酮类药物是治疗人类和动物大肠杆菌病的首选药物之一[25]。本研究发现,aac（6'）-Ib-cr广泛存在于mcr-1阳性菌株中,这与mcr-1阳性菌株对恩诺沙星和庆大霉素耐药表型结果呈正相关。然而,DOMINGUEZ等[21]研究发现,来自于家禽的mcr-1阳性大肠杆菌没有检测到aac（6'）-Ib-cr,检测到最多的PMQR基因为qnrS和qnrB。在本试验中,我们同时检测到了qnr A、qnrB和qnrC基因。本试验结果表明,禽源大肠杆菌不仅可以作为mcr-1储存库也可以作为PMQR和ESBL基因的储存库。

本试验结果表明,山东省养鸡场中大肠杆菌的耐药程度高,耐药范围广,mcr-1基因在养鸡场中普遍流行,家禽是其重要的储存库。禽源mcr-1阳性菌株对公共卫生至关重要,应继续加强对养鸡场中mcr-1耐药基因的监控。