应用Cephodex微载体悬浮培养DF-1细胞增殖水貂犬瘟热病毒

庄金秋,梅建国*,王玉茂,张 颖,王 艳,莫 玲 （.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东 滨州 256600；2.滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司,山东 滨州 256600）

犬瘟热（canine distemper）是由犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）引起的一种高度接触性传染病,传染性极强,病死率可达80%以上。目前,该病尚无特效治疗药物,采用质量可靠的疫苗接种仍是疫病防控的重要手段[1]。鸡胚成纤维细胞（CEF）、犬肾细胞（MDCK）为CDV敏感细胞株,适合该病毒增殖[2]。传统的转瓶培养效率低、批间差异大、稳定性差等诸多缺点,使得犬瘟热疫苗质量提升遇到瓶颈难题。生物反应器微载体悬浮培养技术能克服传统技术的众多弊端,有望促进疫苗产品质量的进一步提高[3]。本试验采用了一种新型Cephodex细胞微载体,进行高密度培养鸡胚成纤维传代DF-1细胞,并对水貂犬瘟病毒CDV3株增殖的技术条件进行初步探索,为未来高效水貂犬瘟热疫苗的大规模生产奠定重要的技术基础。

1 材料与方法

1.1细胞与病毒株DF-1传代细胞系、水貂犬瘟热弱毒CDV3株由山东省滨州畜牧兽医研究院生物制品研究室提供。

1.2主要试剂与仪器优级新生牛血清（FBS）为兰州民海生物公司产品；DMEM干粉为Invitrogen公司生产；细胞培养级葡萄糖为Sigma公司产品；Cephodex型细胞培养微载体为滨州贝尔凯瑞生物公司产品；Minitron CO2细胞培养摇床购自瑞士伊孚森生物公司；50 m L螺旋盖玻璃三角瓶为德国肖特公司产品。

细胞生长液为DMEM培养液加入6%的FBS；细胞维持液为DMEM培养液加入2%的FBS。

1.3DF-1细胞复苏与常规培养从液氮罐中取DF-1种子细胞1支,37℃水浴快速解冻,常温下1 000 r/min离心5 min,弃上清并用生长液重悬。将细胞悬液无菌转入T75方瓶中,用生长液定容至15 m L。将细胞放入37℃、5%CO2培养箱中培养。至72 h,细胞汇合度达80%以上,胰酶消化液作用后,按1∶3比率传代扩增。

1.4微载体准备分别称取0.05,0.10,0.15 g微载体Cephodex各2份,分别放入6只50 m L三角摇瓶。每瓶加入PBS 10 m L,并用玻璃棒搅拌使微载体分散混悬。将此6只微载体培养瓶用121℃灭菌30 min,之后待温度降至80℃充分摇匀混悬,以防载体结团。更换摇瓶中无菌PBS,并向瓶中添加一定量细胞生长液,37℃孵育24～72 h做无菌检验。

1.5细胞接种、扩增与微载体培养无菌检验合格后,弃检验液,留微载体,备用。将生长良好的T75瓶中DF-1细胞用胰酶-EDTA消化液消化、并吹打分散,无菌收集细胞。按每摇瓶3×106个细胞的量接种,并将细胞生长液定容至10 m L后,将细胞放入Minitron CO2培养摇床中培养。DF-1细胞接种后0～6 h为间歇振荡[4],间歇时间为30～60 min,振荡时间为1～2 min,摇床控制参数如表1。

表1 间歇振荡阶段时的摇床控制参数

另外,取2只T75方瓶DF-1细胞按1∶3的比率扩增至6只T75瓶,并将扩增后的T75瓶细胞置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。摇瓶间歇振荡培养6 h后,进入连续振荡阶段,细胞-载体复合物可以得到充分混悬,也阻止了细胞-载体成团。细胞培养摇床参数设定如表2。

表2 连续振荡阶段摇床控制参数

在细胞-载体生长阶段,同时用3只T75方瓶DF-1细胞做细胞生长状态研究。每24 h对方瓶取样,观察细胞状态,进行细胞计数。而摇瓶微载体培养的5,10,15 g/L各取1瓶也用于细胞生长研究。每24 h各取1摇瓶观察细胞生长状态,取样做细胞计数。

1.6CDV3接种、病毒增殖与滴度测定待培养至72 h,细胞长成完好单层,取1只T75方瓶DF-1细胞和5,10,15 g/L微载摇体浓度的摇瓶DF-1细胞各1瓶。将各瓶更换细胞生长液为细胞维持液,并按2%接种CDV3悬液,另1只T75方瓶作对照。每24 h观察病毒致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,并在80%以上细胞病变时进行病毒收获,同时取样采用Reed-Muench法[5]测CDV3滴度（TCID50）。

2 结果

2.1不同培养条件下DF-1细胞的生长状态DF-1细胞在方瓶中静置培养时,呈典型梭状结构,细胞轮廓鲜明透亮,表现出良好的生长性能。由于是静置培养,细胞贴壁时间较短,2 h基本达到80%的细胞贴壁生长。24 h后,细胞汇合度可达90%以上（图1A）。培养至48 h,细胞可完全铺满整个T75瓶底（图1B）。由于单层静置培养下,DF-1细胞生长较快,培养至72 h,整个培养瓶底可形成致密的细胞单层,细胞生长进入平台期。在不换液条件下,如果继续培养,部分细胞开始凋亡。主要表现为,细胞形态变圆,脱落（图1C）。

由于DF-1细胞具有良好的贴壁生长能力,因此在微载体悬浮培养前期,细胞也表现出很好的附球生长能力。细胞接种与载体混匀后,经过沉降-悬浮-沉降循环间歇振荡培养4 h后,60%以上的细胞可实现附球生长。而培养至6 h,细胞上球率则可达到80%以上,且DF-1细胞可在载体上铺展生长。在连续悬浮培养至24 h,DF-1细胞基本完成附球生长,并在载体上延展开来（图1D）。在悬浮培养48 h后,细胞在微载体上的汇合度达80%以上,且细胞形态良好,细胞生长能力强（图1E）。悬浮培养至72 h后,DF-1细胞在Cephodex微载体上形成致密细胞单层。如果不换培养液继续培养,由于过高的细胞密度引起营养物质过快消耗,代谢产物大量积累,细胞开始出现明显凋亡,主要表现为DF-1细胞圆缩并从微载体上脱落（图1F）。

图1 不同培养条件下DF-1细胞的生长状态

2.2细胞密度与微载体质量浓度优化

2.2.1细胞密度 在细胞生长过程中采用台盼兰活细胞计数法,通过每24 h对细胞进行取样计数,测定细胞生长密度,从而比较了单层静置培养和微载体悬浮培养2种培养系统中DF-1细胞在各个培养系统中的生长能力。从图2可以看出,2种培养模式下,DF-1细胞有着相似的生长曲线。在培养初期的24 h内,细胞生长较为缓慢。而在24～48 h,细胞呈快速生长。之后,细胞生长逐渐放缓。至72 h,细胞密度达到最大。

2.2.2培养方法 从培养方法来看,微载体培养与单层培养比较,DF-1细胞密度有了很大的提高。即使采用本试验最小5 g/L的微载体质量浓度,整个培养过程的细胞生长密度均较单层培养时约提高了1倍,而10,15 g/L微载体质量浓度条件下的细胞密度更是达到单层培养时的3～4倍以上（图2）。

2.2.3微载体质量浓度 随着微载体质量浓度的增加,细胞密度也有不同程度的提高（图2）。在微载体质量浓度小于10 g/L时,通过增加载体质量浓度可以显著提高DF-1细胞密度。微载体质量浓度增至10 g/L时,最大细胞密度可达2.5×106/m L,约为5 g/L条件下细胞密度的2倍。然而当微载体质量浓度高于10 g/L,再通过增加载体质量浓度来提高细胞密度,似乎效果并不明显。当微载体质量浓度为15 g/L时,最大细胞密度为2.8×106/m L,较10 g/L时略提高了12%（表3）。由此可见,细胞密度的提高与微载体质量浓度的增加并不总保持线性关系。

表3 DF-1细胞在不同培养条件下的细胞密度×105/m L

2.3细胞病变(CPE)与TCID50测定T75瓶中的DF-1细胞,静置培养72 h形成完好细胞单层后进行CDV3接种。继续培养48 h后,多个DF-1细胞相互融合,形成合胞体,产生明显的CPE现象（图3B）。在CDV3接种72 h后,显微镜下观察到,培养物中产生大量CDV3引起的特征性合胞体,同时DF-1细胞也大量死亡崩解（图3C）。而相应的对照组T75瓶DF-1细胞,细胞单层完整,细胞状态正常（图3A）。

微载体悬浮培养至72 h时,DF-1细胞在微载体上形成致密单层,此时接种CDV3。在病毒接种后48 h,微载体培养物因产生CPE,DF-1细胞相互融合,微载体发生聚集成团（图3E箭头所指）。然而,随着细胞培养和病毒增殖的延续至72 h,大量细胞从载体上脱落崩解,微载体聚团也逐渐消散。然而,图3F箭头指出CDV3引起的DF-1细胞特征性合胞体仍然存在。同时图3D表明,未感染CDV3的对照组DF-1细胞仍在Cephodex上保持了正常贴壁生长状态。

图3 2种不同培养方法下的DF-1细胞的特征性病变

微载体悬浮培养条件下,CDV3增殖72 h,80%以上的DF-1细胞从载体上脱落,并形成大量合胞体。因此,结合单层静置培养CDV3增殖72 h的收毒时间,亦选择此时进行病毒收获,并取样测病毒滴度。不同培养条件下,CDV3收液的TCID50如表4。从表4可以看出,采用微载体悬浮培养技术,收获的CDV3滴度整体都较单层静置培养条件下收获的病毒滴度略有提高。而当微载体质量浓度达到10 g/L以上时,收获的CDV3滴度为104.5TCID50/0.1 m L,较 单 层 静 置 培 养 时 提 高100.5TCID50/0.1 m L,也较5 g/L时提高100.3TCID50/0.1 m L。尽管如此,当微载体质量浓度从10 g/L增加至15 g/L时,CDV3滴度并没有明显提高。

表4 不同培养条件下的CDV3滴度

3 讨论

对于贴壁依赖性动物细胞而言,微载体悬浮培养技术是一种极具优势的动物细胞3D培养技术,可以很好地克服单层静置培养法（2D培养法）的各种弊端。特别是在一些动物病毒大规模增殖过程中,这一技术的应用可以使病毒培养物均一性更好、病毒滴度明显提高、病毒生物学特性更优等,从而大大提高生产效率和产品质量[6]。本试验应用新型Cephodex细胞微载体及其悬浮培养技术,实现了DF-1细胞的高密度生长和CDV3的高效增殖。通过与传统2D培养法的比较分析,结果显示Cephodex微载体悬浮培养法不仅能使DF-1细胞密度提高3倍以上,而且收获的CDV3滴度每0.1 m L也能提高100.5TCID50单位。尤其在DF-1细胞培养和CDV3增殖等过程中,在培养物取样观察、病毒滴度测定等关键技术环节上,表现出明显优于传统2D培养法的稳定性和均一性。这些生产技术环节的有效监控,必然对技术产品质量保证起到至关重要的作用[7]。

采用新型Cephodex微载体悬浮培养技术增殖CDV3过程中,控制条件的不同,也可以产生明显不同的技术效果。本试验考察了不同细胞微载体浓度对DF-1细胞密度、CDV3滴度以及其他各项指标的影响。本试验结果表明,Cephodex微载体质量浓度从5 g/L增加至10 g/L时,最大细胞密度可以提高约2倍,收获的CDV3滴度能提高100.3TCID50/0.1 m L。然而,当微载体质量浓度从10 g/L进一步增加至15 g/L时,细胞密度仅提高12%,并不明显。而且,收获的CDV3滴度也基本没有提高。可见,在微载体培养过程中,培养物产量并非总能与微载体用量成正比。当微载体浓度达到一定水平时,进一步增加微载体浓度并不能增加培养物产量,且由于微载体浓度的增加,使得微载体有效利用率反而有所下降[8]。由于微载体成本是该技术成本的重要组成部分,过多的微载体用量如果不能相应地增加培养物产量,会导致生产成本的明显增加和浪费,这是工业化生产不允许的。因此,研究并得出最佳微载体用量对微载体悬浮培养技术有着十分重要的意义[9]。本试验通过比较不同微载体浓度下的DF-1细胞密度、CDV3滴度等重要指标,可以初步确定10 g/L Cephodex微载体质量浓度对本技术工艺而言,应是较为合理的微载体用量。

本试验在摇瓶培养条件下对新型Cephodex微载体悬浮培养技术进行初步探索,与大型细胞生物反应器条件下的微载体悬浮培养技术工艺相比,无论是技术环节还是条件监控,仍存在较大差距。因此,采用生物反应器技术与微载体悬浮培养技术相结合[10],并对培养温度控制、液体混合方式与速率、气体混合与通气速率、病毒接种与收获过程等众多技术条件进行工艺优化,才能使微载体悬浮技术在实际生产中的技术优势得以更好地发挥。