肠炎沙门菌sef 14基因缺失株生物学功能

顾宣强,侯千禧,刘家奇,李雅倩,夏芃芃,段强德,朱国强 （扬州大学 兽医学院 江苏省重要动物传染病与人兽共患病协同创新中心,江苏 扬州 225009）

肠炎沙门菌表面具有多种菌毛,其中SEF14主要表达于肠炎沙门菌等D群沙门菌中[1]。SEF14菌毛的结构纤细,直径小于3 nm,由大小为14.3 k Da的蛋白亚单位组成[2],没有凝集红细胞的能力[3]。

sef基因位于肠炎沙门菌染色体上一个较小的毒力岛上。完整的sef基因操纵子包括sefA、sef B、sef C、sef D、sef R等5个基因。sef A编码SEF14菌毛主要亚单位Sef A；sef B编码伴侣蛋白,是一种转运蛋白,可以避免Sef A主要亚单位蛋白的非活性聚集及其组装前的酶降解；sef C编码推进蛋白,推进蛋白位于外膜中,负责组织和装配菌毛亚单位并使其穿过外膜蛋白,以活性蛋白的形式表达于细菌的表面；sef D编码SEF14菌毛的顶端结构,为一种假定黏附素；sef R基因是与sefD相连的反向调节基因,其编码的AraC样调节蛋白能够激活sef操纵子基因的转录[4]。

SEF14的菌毛组装分泌方式为典型的伴侣-推进蛋白途径[5],首先,Sef A蛋白和Sef D蛋白在沙门菌细胞质中合成,在细胞质中,辅助因子Sec A可以捕获菌毛前蛋白或接收伴侣蛋白SecB转运的前蛋白；之后,前蛋白通过Sec YEG转运进入周质,这也意味着SEF14蛋白的分泌还需要SecDF/YajC内膜蛋白,这些蛋白需要Sec A催化ATP的水解来为转运提供能量。在细胞周质中,伴侣蛋白SefB与菌毛亚单位Sef A互补结合,然后Sef B将Sef A与Sef D蛋白通过细菌外膜的孔道SefC运送并组装到细菌外膜上[6]。

沙门菌引起的各种动物疾病称为沙门菌病,其主要污染禽蛋肉产品而危害公共卫生安全,其中肠炎沙门菌是引起沙门菌病和食物中毒的主要原因之一[7]。而肠炎沙门菌表面的SEF14菌毛对其生物学功能的影响不得而知。由此,我们选用肠炎沙门菌标准株SE50336缺失sef14菌毛操纵子亚单位sef A基因,以探究肠炎沙门菌SEF14菌毛的生物学功能,以期对肠炎沙门菌的防控提供基础。

1 材料与方法

1.1细胞、菌株与质粒及实验动物人结肠腺癌细胞Caco-2为本实验室保存；肠炎沙门菌SE50336由扬州大学焦新安教授惠赠；p KD46、p KD3和p CP20均由美国宾夕法尼亚大学兽医学院惠赠；p BR322质粒为本实验室保存；6周龄SPF BALB/c小鼠（雌、雄各半）购自扬州大学比较医学中心。

1.2主要试剂胰蛋白胨、酵母提取物均购自Oxoid公司；氨苄青霉素（Amp）、氯霉素（Cm）、四环素（Tc）和Triton X-100均购自上海生工公司；Green taq mix和质粒小提试剂盒、2×AceQ®qPCR SYBR®Green Master Mix（Low ROX Premixed）试剂盒均购自南京诺唯赞公司；DNA Marker Trans 2k购自全式金生物科技有限公司；DNA胶回收试剂盒购自北京天根公司；DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）培养基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）和0.25%胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；考马斯亮蓝R-250购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）购自Ta Ka-Ra公司；其余常规试剂为国产分析纯试剂。

1.3主要仪器超净工作台购自苏州净化设备有限公司；台式冷冻离心机和移液器购自Eppendorf公司；PCR仪、荧光定量PCR仪购自ABI公司；MicroPulser电转化仪和DNA凝胶成像仪均购自Bio-Rad公司；全波长全自动多功能酶标仪购自美国Bio Tek公司；电热干燥培养箱购自南京实验仪器厂；CO2细胞培养箱和Nanodrop 2000分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.4缺失株(SE50336Δsef A)的构建参照文献[8]构建肠炎沙门菌SE50336Δsef A基因缺失株（SE50336Δsef A）。

1.4.1引物设计 根据NCBI上发布的肠炎沙门菌SE50336的全基因测序中sef A的序列,利用引物设计软件oligo7分别设计sef A上、下游引物序列（表1）。其中,P1/P2为sef A基因鉴定引物,P3/P4为缺失引物,缺失引物中下划线所示为氯霉素抗性基因cat两侧的互补序列。上述引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 用于构建sef A基因缺失株的引物序列

1.4.2一次重组和p KD46质粒的消除 采用煮沸法制备p KD3模板,以P3、P4为引物扩增sef A和cat基因融合产物,产物用胶回收试剂盒进行回收。根据参考文献[8]制备SE50336感受态细胞,将p KD46电转入感受态细胞中,获得阳性克隆后,制备阳性克隆的感受态细胞,并转化含cat基因同源臂的PCR产物。阳性克隆接种于含Amp和Cm的液体培养基中培养,取1 m L进行保种,剩余菌液按照上述方法制备模板,以P1、P2为引物进行一次重组菌株的PCR鉴定并送测序,结果正确后,将阳性克隆在42℃培养箱中连续传代5次,筛选对Amp敏感而对Cm不敏感的阳性菌株,将阳性菌株命名为SE50336Δsef A::Cat。

1.4.3二次重组和pCP20质粒的消除 与前述方法相同,制备感受态细胞,并将p CP20质粒电转入感受态细胞中,筛选阳性克隆后在42℃培养箱中连续传代5次；使用P1、P2进行二次重组菌株的PCR鉴定。二次重组菌命名为SE50336Δsef A。

1.5生长试验培养SE50336、SE50336Δsef A至D600＝1.0后,1∶100转接至50 m L LB培养基中,37℃、230 r/min培养。之后每1 h取1次样,连续记录至D600值相对稳定。重复3次试验。

1.6生物被膜形成检测

1.6.1生物被膜形成定性检测试验 分别转接SE50336、SE50336Δsef A至4 m L生物被膜诱导液[9]中30℃震荡培养10 h后测D600处的吸光度,调节菌液至D600＝1.0后以1 100 r/min接至4 m L新鲜的生物被膜诱导液中培养24 h。然后用蒸馏水轻柔洗去菌液,并用1%的结晶紫染液染色20 min后观察。

1.6.2生物被膜形成定量检测试验 将上述调节至D600＝1.0的菌液稀释100倍后以每孔150μL菌液加入96孔板中,每组设10个平行对照,30℃静置培养24 h。次日弃掉菌液,用蒸馏水温柔洗去菌液,然后用1%的结晶紫染液染色20 min,用蒸馏水温柔清洗至冲洗液变为无色后加入95%的乙醇溶液将结晶紫溶解,用全波长酶标仪于D600处检测吸光度。

1.7刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基菌落表型试验根据文献[10]配置刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基（1 g蛋白胨；0.5 g酵母浸出物；4 mg刚果红和2 mg考马斯亮蓝R-250加入100 m L水中）,细菌在该培养基生长时可通过Curli菌毛和纤维素表达量的不同而出现不同的菌落表型。具体方法为:转接SE50336、SE50336Δsef A至新鲜LB中,生长至D600＝1.0,取2.5μL滴加于刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基上,在37℃培养48 h后观察菌落形态。

1.8生物被膜形成主要基因csg A、bcsA、pgaC、fimA的转录量测定

1.8.1RT-qPCR引物设计 RT-qPCR引物序列见表2,其中gyr A为内参基因。

表2 RT-qPCR引物序列

1.8.2cDNA制备 使用TRIzol法提取RNA。简言之,取SE50336、SE50336Δsef A过夜培养菌液,12 000 r/min离心10 min；弃去上清后加入300μL含1%溶菌酶的PBS,室温裂解5 min；再加入1 m L TRIzol Universal试剂,孵育3 min；加入300μL氯仿孵育3 min,4℃12 000 r/min离心15 min；取上层水样液体到新离心管,加入2倍体积异丙醇,—20℃沉淀20 min；4℃12 000 r/min离心10 min；弃上清,用75%乙醇洗涤沉淀；4℃12 000 r/min离心5 min；弃上清置室温中自然干燥,用30μL无RNA酶水溶解。使用Ta KaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒进行反转录,制备cDNA。

1.8.3RT-qPCR反应 目标基因表达分析用DNA结合染料（SYBR Green）,RT-qPCR反应体系见表3,上机后反应程序参照南京诺唯赞生物技术有限公司2×AceQ®qPCR SYBR®Green Master Mix（Low ROX Premixed）试剂盒要求,将退火温度时间修改为34 s,其余参数为ABI7500 software默认。反应结束后分析溶解曲线以确保引物扩增特异性,数据分析采用相对定量方法（2—ΔΔCt）。整个试验重复3次以减少误差,利用Graphpad Prism8软件进行单因素方差分析（One Way ANOVA）,并作图。

表3 荧光定量PCR反应体系

1.9细胞黏附试验人结肠腺癌细胞（Caco-2）培养于含12%FBS的DMEM中。2 d左右用250μL 0.25%胰蛋白酶消化传代1次,培养条件为37℃、含5%CO2的培养箱中。前1 d晚上将Caco-2细胞消化并转移至96孔板每孔100μL,可在次日铺满孔底。然后分别转接SE50336、SE50336Δsef A至新鲜LB中培养至D600＝1.0,用PBS清洗菌液2次。菌液按MOI＝100∶1的比例加入细胞孔,每组8个重复,37℃共孵育1 h。除去未黏附的细菌,裂解细胞30 min,通过10倍稀释涂布于麦康凯平板进行细菌计数。

1.10小鼠体内致病性试验将36只小鼠随机分为3大组,每个大组再随机分成3个小组（即4只/小组）,分组及攻毒剂量如表4所示。各组小鼠在相同条件下隔离饲养7 d。将p BR322质粒分别电转入SE50336、SE50336Δsef A中,利用含氨苄青霉素及四环素的平板进行细菌计数,并制成生理盐水细菌悬液；3个小组分别腹腔注射10,102,103CFU/200μL的细菌；攻毒后,每隔12 h观察1次小鼠状态,连续观察7 d,记录小鼠发病的症状,并用Karber法计算LD50；然后对小鼠进行解剖,肉眼观察其病理变化；采集死亡实验动物的肝、肾、脾、肺、盲肠、小肠进行细菌分离。

表4 小鼠分组情况及攻毒剂量 只

1.11数据统计分析用Microsoft Excel软件统计数据后用Graphpad Prism对数据进行P＜0.0500水平的显著性方差分析。其中*代表显著差异为0.010 0＜P＜0.050 0；**代表显著差异为0.005 0＜P＜0.010 0；***代表显著差异为0.001 0＜P＜0.005 0；****代表显著差异为0.000 5＜P＜0.001 0。

2 结果

2.1sef A基因缺失株的构建肠炎沙门菌SE50336Δsef A菌株的PCR产物核酸电泳鉴定结果如图1所示。野生株sef A扩增产物为498 bp；一次重组菌株SE50336Δsef A::cat扩增产物为1 115 bp；以SE50336Δsef A::Cat基因组为模板,用鉴定引物进行Sanger测序,利用DNA star软件比对,证明SE50336菌株上的sef A基因已被cat取代；二次重组菌SE50336Δsef A扩增产物为306 bp。

图1 sef A基因缺失株核酸电泳图

2.2生长曲线绘制将SE50336、SE50336Δsef A的生长情况绘制成生长曲线（取各组D600数据的对数值）,如图2所示。SE50336、SE50336Δsef A在迟缓期、对数生长期、平台期的生长情况均无明显差异,排除了生长情况不同而对后续研究造成影响的可能,使试验结果更具有说服力。

图2 SE50336、SE50336Δsef A的细菌生长曲线

2.3生物被膜形成检测SE50336、SE50336Δsef A生物被膜形成的定性和定量检测试验结果一致（图3,4）。与SE50336相比,SE50336Δsef A的生物被膜形成能力显著降低（P＜0.05）。

图3 SE50336、SE50336Δsef A生物被膜定性检测

图4 SE50336、SE50336Δsef A生物被膜定量检测

2.4刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基菌落表型鉴定在37℃培养情况下,SE50336、SE50336Δsef A在刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基上的菌落表型如图5所示。SE50336野生株表现出典型的rdar表型,而sef A缺失株表现出saw表型,暗示其Curli菌毛和纤维素表达量下降。

图5 SE50336、SE50336Δsef A在刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基上的菌落表型

2.5生物被膜合成相关基因csg A、bcsA、pgaC、fimA的转录量测定缺失株SE50336Δsef A中csg A、bcsA、pgaC、fim A基因表达水平较野生株显著降低,再次验证了缺失株SE50336Δsef A形成生物被膜能力降低（图6）。

图6 SE50336、SE50336Δsef A对Caco-2细胞的黏附情况

图6 RT-qPCR检测csg A、bcsA、pgaC、fimA的表达量

2.6细胞黏附试验SE50336、SE50336Δsef A对人结肠腺癌细胞Caco-2的体外黏附情况如图7所示。与野生株相比,基因缺失株Δsef A对Caco-2细胞的黏附虽然无统计学差异（P＝0.41）,但是黏附Caco-2细胞的比例由100%降至69.7%。

2.7小鼠体内致病性试验细菌攻毒后,试验小鼠（除对照组外）均于24 h后陆续出现食欲、饮欲减退,扎堆、被毛逆乱、腹泻等临床症状,死亡多发于96 h后。以Karber法计算半数致死量,LD50＝lg—1[XM-I（∑P-0.5）],式中XM为最大剂量的对数,P为各组动物的病死率,以小数表示；∑P为各组动物病死率之和,I为相邻2组剂量对数之差。各细菌引起动物的病死情况及其LD50见表5。

表5 各组小鼠死亡数及LD50

剖检结果发现,所有病死小鼠的肝、肾、脾、肠道充血肿大,肝脏表面具有明显的黄色坏死灶,肺脏无明显变化,部分小鼠肠道内充满气体和液体,肠系膜部分水肿。

随机采集各组死亡小鼠的肝脏、肾、脾、肺、盲肠、小肠置于亚硒酸盐胱氨酸液体增菌培养基中,培养24 h后划线于含有氨苄青霉素及四环素的木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂上,平板上均出现黑色菌落,对照组不产生任何菌落,表明实验动物死亡是由于攻毒实验菌株而造成,且人工感染后,肠炎沙门菌在脏器中分布广泛,形成菌血症。

3 讨论

细菌可以通过形成生物被膜增加对环境的抵抗力,是细菌持续感染与反复感染的重要原因,但是尚未见SEF14菌毛对肠炎沙门菌生物被膜形成影响的相关研究报道。纤维素和Curli菌毛是生物被膜形成过程中重要的组成部分[11],细菌在刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基上生长的表型能够反映纤维素和Curli菌毛生成量。本试验结果吧表明,sef A基因缺失使得在刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基上表型为rdar的SE50336表现出saw表型,提示SEF14菌毛与纤维素和Curli菌毛表达成正相关。另一方面csg A、bcsA、pgaC、fim A的表达量影响了生物被膜的形成[12],因此本研究对缺失株上述基因的转录量进行了RT-qPCR测定,再次验证缺失株生物被膜形成能力降低。

菌毛能够介导细菌对宿主细胞黏附侵袭毒力作用[13],但目前SEF14菌毛在肠炎沙门菌致病过程中的作用存在很大的争议。THORNS等[14]报道,SEF14菌毛突变株较野生株更易被人中性粒细胞吞噬。EDWARDS等[15]构建了关于sef A和sefD的相关突变株研究SEF14菌毛的作用,结果表明sef D是SEF14菌毛毒力的必要单位,并且SEF14菌毛能够有效地帮助肠炎沙门菌在巨噬细胞中存活,有利于其长期隐性感染。本试验结果表明,野生株与Δsef A缺失株在黏附Caco-2细胞能力上无统计学差异,这与本实验室之前对肠炎沙门菌野生株以及SEF14菌毛缺失株对猪小肠上皮细胞以及Caco-2细胞的黏附测定结果相吻合[16],表明SEF14菌毛可能并不是肠炎沙门菌的主要黏附因子。然而,COLLIGHAN等[17]报道,SEF14菌毛能够介导肠炎沙门菌特异性黏附于家禽的生殖道。也有人指出,SEF14菌毛单因子并不能发挥主要毒力作用,而是与其他毒力因子一起发挥协同作用,抑或是感染宿主不同,产生的毒力作用也不尽相同[18]。本研究利用肠炎沙门菌参考株SE50336以及其亚单位基因缺失株

SE50336Δsef A探究SEF14菌毛对肠炎沙门菌致病力的影响,结果显示野生株的LD50低于突变株SE50336Δsef A,这一差异说明SEF14菌毛与肠炎沙门菌致病力有关,且缺失SEF14菌毛主要亚单位编码基因sef A后,能够降低肠炎沙门菌的毒力。

本试验探索了SEF14菌毛对肠炎沙门菌生长、生物被膜形成以及对Caco-2细胞黏附能力的影响,并探究了缺失株对小鼠致病力的影响。目前,对SEF14菌毛的致病机制存在争议,其主要原因在于缺失该特定菌毛操纵子基因的体外克隆表达和功能性研究,以及相关基因缺失株的系统性功能性比较研究。我们实验室最近的研究发现,部分沙门菌血清型的sef14操纵子中确实存在假基因,这一发现也为进一步探索SEF14菌毛提供重要信息。因此关于SEF14菌毛的功能值得进一步探究。随着SEF14菌毛功能的解析,将有助于加速探寻防控肠炎沙门菌的有效方法。