尼帕病毒受体结合糖蛋白在哺乳动物细胞中的可溶性表达和纯化及小鼠抗血清制备

高子函,宋丽娜,许 汪,李乐天,郝鹏飞,伊立超,郝嘉翼,时小双,于成东,李 凯,徐 鹏,金宁一,李 昌 （军事科学院 军事医学研究院 军事兽医研究所 中国医学科学院人兽共患病毒病防控关键技术研究创新单元,吉林 长春 130122）

尼帕病毒病是一种由尼帕病毒（Nipah virus,NiV）引起的主要侵害中枢神经系统和呼吸系统的急性损伤,且高度致死的人兽共患传染病[1],该病首次于1998年暴发于马来西亚,由于该NiV在尼帕双溪（Sungai Nipah）地区被分离到,因此得名。NiV为单股负链RNA病毒,属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、亨尼帕病毒属（Henipavirus）成员,与另一个于1994年在澳大利亚布里斯班发现的享德拉病毒（Hendra virus,He V）同属。由于对人致死率高（40%～70%）,被列为生物安全4级病原[2]。该病毒的主要自然宿主为狐蝠科（Pteropid）的果蝠（fruit bat）[3],猪、牛、马、山羊、猫、犬、鼠、兔、狐狸、掠鸟、八哥等也是NiV的天然宿主。果蝠活动范围较广,NiV有可能在一定区域内的果蝠中相互传播,因此,相同种类蝙蝠分布的国家和地区会面临病毒突变、疫病暴发流行的危险。自1998年首次发现Ni V以来,Ni V的流行主要分布在东南亚地区和西太平洋地区。但近几年,西太平洋地区NiV暴发的频率逐渐降低,而东南亚地区国家,尤其是孟加拉国地区Ni V暴发非常频繁[4],更加引起了全世界的关注,NiV在此类周边国家的流行态势对我国造成了潜在威胁。我国目前尚未检出NiV,但我国东南沿海地区和云南地区具有适合NiV流行的生态环境和宿主动物,且已发现NiV的自然宿主,在蝙蝠体内存在NiV抗体,提示我国存在Ni V或者类似病毒的自然疫源地。因此,开展针对Ni V综合防控关键技术的相关研究,具有重要的现实意义。

Ni V粒子具有多形性,有囊膜,病毒颗粒大多数呈现不规则的球状,直径大多数为150～200 nm,少数病毒颗粒呈现丝状体,长度可达10 000 nm[5]。NiV主要有2个遗传谱系,NiV马来西亚株（NiV Malaysia,NiV-MY）和NiV孟加拉株（NiV Bangladesh,Ni V-BD）。其中,Ni V-MY株基因组18 246个核苷酸,而NiV-BD株基因组18 252个核苷酸。目前流行毒株主要是马来西亚株,比同属He V多12个碱基[6],编码N（核蛋白）、P（磷蛋白）、M（基质蛋白）、F（融合蛋白）、G（受体结合蛋白）、L（聚合酶）等 至少6种蛋白,其中N蛋白、P蛋白、L聚合酶一起称为复制复合体,结合在病毒RNA上,与病毒基因组的转录和复制有关,M蛋白参与维持病毒囊膜形态,F蛋白、G蛋白参与蛋白的融合和吸附,与病毒入侵有关[7]。Ni V在其包膜内包含2种膜锚定糖蛋白（G蛋白和F蛋白）,其中G蛋白与宿主细胞膜蛋白ephrin-B2、ephrin-B3结合[8],而此2种蛋白在宿主细胞表面高度保守[9],所以目前F、G为抗病毒与疫苗研究的主要靶点,Ni V G蛋白全长共602个氨基酸,属于Ⅱ型跨膜糖蛋白,N末端位于膜内,膜内部分极短,疏水的跨膜结构域靠近N端,C末端位于膜外,由一个“球型”头部区域和较长的“外茎”区域组成[10]。故本研究拟以Ni V受体结合糖蛋白（sG）为研究对象,利用哺乳动物细胞对其进行可溶性表达、纯化并通过免疫小鼠制备特异性血清,以期为后续开展NiV的蛋白结构、入侵机制、诊断、疫苗及中和抗体等相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1细胞、菌株、质粒以及实验动物Expi293F细胞购自Invitrogen；感受态细胞Trans1-T1购自全氏金生物科技；真核表达载体pcDNA-3.1（＋）由本实验室保存；6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。

1.2主要试剂抗Strep（HRP）抗体购自Merck Millipore公司；Goat Anti-Mouse IgG H&L（HRP）购自碧云天生物技术有限公司；DL5000 DNA Marker购自大连Ta KaRa公司；T4DNA Ligase购自NEB公司；胶回收试剂盒购自BioFlu X公司；限制性内切酶、Expi293细胞培养基及转染试剂购自Thermo Fisher Scientific公司；质粒提取试剂盒购自Corning公司；Strep-Tactin XT亲和层析柱购自IBA公司；ELISA终止液、TMB单组分显色液均购自南京索莱宝有限公司。

1.3NiV G蛋白序列分析、设计以及合成根据NCBI上NiV的28个全基因组序列,将G蛋白的基因序列进行对比,绘制进化树,并分析G蛋白的氨基酸同源性。通过线上疏水性分析工具、抗原决定簇预测工具（http://www.detaibio.com/tools/）进行分析,得到NiV代表毒株（NCBI登录号:AF212302.2）的G蛋白序列,删除细胞质尾部区、跨膜疏水区以及部分茎区,仅保留胞外球形头部区（命名为sG）。N端添加人组织纤溶酶原激活物信号肽（tPA）序列、Strep标签,两端分别添加酶切位点HindⅢ和Bam HⅠ,序列设计完成后由上海生工有限公司进行密码子优化并合成,得到含有目的基因质粒（p UC57-NiV-sG）的甘油菌。

1.4重组质粒的构建将合成的含有目的基因质粒（p UC57-NiV-sG）的10μL甘油菌接种于5 mL带有氨苄霉素抗性的液体LB培养基,37℃震荡培养12 h,进行质粒的小量提取制备。HindⅢ和Bam HⅠ双酶切后连接至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,得到真核表达质粒pcDNA-sG,将重组质粒采用热激法转化感受态细胞Trans1-T1,经氨苄抗性筛选,挑取阳性菌落,提取质粒,双酶切鉴定,将鉴定正确的质粒送至上海生工生物工程有限公司测序,序列比对确认无误后,大量制备与纯化,测定质粒浓度,用于细胞转染。

1.5细胞转染转染前1 d,Expi293F细胞在8%CO2、37℃、125 r/min条 件 下 悬 浮 培 养,将60 m L体系的293F细胞培养物测定存活率以及活细胞密度,活细胞生长至4.2×106/m L,存活率为97%,将细胞培养物稀释为2.1×106/m L,转染当天,细胞密度为3×106/m L,将60μg真核表达质粒pcDNA-sG与3 m L Opti-MEMTMⅠReduced Serum Medium混匀,160μL ExpiFectamineTM293 Reagent与2.8 m L Opti-MEMTMⅠReduced Serum Medium混匀,室温孵育5 min后将两者混匀继续室温下孵育20 min。然后将溶液缓慢转移到的细胞培养物摇瓶中,在加入过程中轻轻旋转摇瓶。

1.6目的蛋白Western blot检测转染后12 h,加入300μL转染增强剂1和3 m L转染增强剂2,继续培养96 h,将培养物以800×g离心10 min,分别收集培养基上清与细胞沉淀,培养基上清命名为sG-MS,细胞沉淀用IP裂解液重悬后冰上裂解10 min,使用超声细胞破碎机破碎10 min,离心收集上清命名为sG-DS。蛋白样品进行12%PAGE凝胶电泳,将分离的蛋白电转移至NC（0.45μm）膜上,5%脱脂乳封闭1 h后,鼠源抗Strep（HRP）一抗室温孵育2 h,TBST洗涤3次每次10 min,再与Goat Anti-Mouse IgG H&L（HRP）二抗室温孵育1 h,TBST漂洗3次每次10 min,用显影仪显影。

1.7目的蛋白的纯化将sG-MS蛋白样品与Strep-Tactin XT亲和层析柱置于垂直混合器混合30 min后使样品流穿层析柱,收集流穿液（FT）,再用Wash Buffer洗涤5次,分别收集5次的洗涤液命名为W1～W5,然后用Buffer BXT洗脱目的蛋白3次,第1次3 m L,第2次8 m L,第3次4 m L,分别命名为1号管（E1）、2号管（E2）和3号管（E3）。

1.8纯化后目的蛋白SDS-PAGE鉴定以及纯度检测分别将E1、E2、E3、FT、W1～W5进行12%SDS-PAGE凝胶电泳,将凝胶用考马斯亮蓝染色后,脱色12 h后进行薄层色谱分析法测蛋白纯度。为进一步确定纯化效率,将E2与未纯化蛋白样品sG-MS进行12%SDS-PAGE凝胶电泳,薄层色谱分析蛋白纯度,BCA法对洗脱峰蛋白（E2）样品进行定量。

1.9小鼠免疫将纯化得到的sG蛋白与弗氏佐剂均匀混合,每只小鼠腹腔注射50μg,阴性对照小鼠腹腔注射100μL PBS,在0,14,28 d分别免疫,共免疫3次；42 d时小鼠眼眶后静脉丛采血,37℃2 h后,3 500 r/min离心10 min分离血清。

1.10间接ELISA法检测特异性抗体试验组与阴性对照组每孔包被5μg纯化后的sG蛋白,空白对照组不包被蛋白,4℃孵育过夜,PBST震荡洗涤3次,每次2 min,将试验组以及阴性对照小鼠血清梯度稀释为1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶6 400和1∶12 800,37℃孵育1 h,PBST震荡洗涤3次,每次2 min,使用1∶5 000稀释的Goat Anti-Mouse IgG H&L（HRP）二抗37℃孵育1 h,PBST震荡洗涤6次,每次2 min,避光加入TMB显色液（100μL/孔）,37℃/RT避光孵育15 min后加入ELISA终止液,使用多功能酶标仪读取D450nm/D630nm值。

2 结果

2.1NiV G蛋白遗传进化及氨基酸同源性分析根据文献[5]选择代表性毒株（NCBI登录号:AF212302.2）,并下载NCBI上Ni V 28个基因型全序列,单独截取G蛋白序列,利用DNAStar软件绘制进化树（图1）,将所选择毒株的G蛋白序列与其他基因型序列进行了氨基酸同源性分析,结果显示NiV G蛋白在各基因型中高度保守,且所选择毒株的G蛋白与其他毒株氨基酸同源性介于95%～100%之间（图2）。

图1 NiV进化树分析

图2 NiV G蛋白同源性分析

2.2目的基因的设计与合成以Ni V代表毒株（NCBI ID:AF212302.2）G蛋白为基础,利用表位预测工具进行预测,发现在氨基酸残基183～185aa、417aa、447aa、570aa位置构成了不连续的主要表位,结合文献[10],保留氨基酸残基172～602aa位置,即球形头部结构域（图3A）,删除细胞质尾部区、跨膜疏水区以及部分外茎区,命名为sG。同时,N段添加人组织纤溶酶原激活物信号肽（tPA）序列、Strep标签以及可切除标签的TEV蛋白酶酶切序列,两端分别添加酶切位点HindⅢ和Bam HⅠ（图3B）。

图3 NiV完整G蛋白结构示意图（A）与可溶性G蛋白结构示意图（B）

2.3含有sG蛋白真核表达质粒的构建与鉴定HindⅢ/Bam HⅠ双酶切含有目的基因的质粒p UCNiV-sG与真核表达载体pcDNA3.1（＋）,将目的基因连接到表达载体中得到重组质粒pCDNA-sG（图4）,进行酶切鉴定,可见约5 500 bp的载体片段和约1 600 bp的目的片段（sG）（图5）,与理伦值相符。对目的基因进行测序,结果与所设计的原序列一致,无碱基突变或缺失,表明成功构建了含有sG蛋白的真核表达质粒。

图4 pcDNA-sG真核表达质粒图谱

图5 重组质粒pcDNA-sG酶切鉴定结果

2.4sG蛋白的表达、鉴定、纯化以及定量sG蛋白的相对分子质量约为60 k Da,将培养基上清蛋白样品sG-MS以及细胞破碎产物上清蛋白样品sG-DS分别进行SDS-PAGE和Western blot印迹分析（图6）,结果显示表达蛋白与预期相符,大小正确且分泌在细胞培养基上清中。分别将纯化后的蛋白1号管（E1）、2号管（E2）、3号管（E3）以及流穿液（FT）、W1-5进行12%SDS-PAGE凝胶电泳,将凝胶用考马斯亮蓝染色后,脱色12 h后,对E2进行薄层色谱分析法测蛋白纯度（图7,8）,纯化后蛋白大小正确,约为60 k Da,流穿液中为未吸附在层析柱而滤掉的杂蛋白,且洗涤液中未见条带,蛋白纯度检测结果显示纯度为99.9%。为直观评价纯化效率,将纯化后样品（E2）与未纯化蛋白样品（sG-MS）进行12%SDS-PAGE凝胶电泳,同样进行薄层色谱分析法测定蛋白纯度（图9,10,11）,结果显示未纯化蛋白纯度为80.19%,纯化后蛋白纯度为99.51%,纯化前后蛋白纯度提升接近10%,将E2进行BCA定量,蛋白质量浓度约为1.13 g/L。结果表明,成功制备了尼帕病毒可溶性受体结合蛋白（sG）。

图6 未纯化蛋白SDS-PAGE分析（A）和Western blot鉴定（B）

图7 纯化后蛋白的SDS-PAGE分析结果

图9 E2和sG-MS的SDS-PAGE分析

2.5NiV sG蛋白特异性血清制备与验证通过免疫小鼠进行血清制备,从首免后每周采血,最终通过间接ELISA确定初免后42 d血清D值读数最高,利用间接ELISA测定小鼠血清中抗G蛋白的特异性抗体效价（图12）,读取D450nm/D630nm数值,绘制折线图,结果显示小鼠血清中特异性抗G蛋白抗体的效价在1∶12 800以上,表明重组表达的可溶性G蛋白有效地激发了小鼠体液免疫反应,所制备的血清结合活性良好,可用于后续研究。

图12 D值读数及特异性抗体效价

图8 E2薄层色谱分析法测蛋白纯度

图10 未纯化蛋白样品sG-MS薄层扫描结果

图11 纯化后蛋白样品E2薄层扫描结果

3 讨论

Ni V作为一种新出现的人兽共患副黏病毒,能引起人类严重且致命的呼吸道和神经系统疾病。这种病毒是在马来西亚和新加坡的养猪户暴发脑炎后首次发现,随后孟加拉国或印度几乎每年都存在NiV感染病例报告[11]。由于NiV的高致病性、潜在的大流行性以及缺乏许可的疫苗或治疗方法,需要研究和开发高度敏感和特定的诊断工具以及抗病毒药物和疫苗,以帮助预防和控制未来的疫情。就疫苗而言,几乎所有中和抗体都针对的是主要的病毒包膜糖蛋白,在另外2种副黏病毒科成员流行性腮腺炎病毒和麻疹病毒[12-13]中,中和抗体是疫苗诱导的主要保护机制,受体结合蛋白（G蛋白）通常是主要的靶标[14]。

本研究以哺乳动物细胞真核表达系统表达NiV的受体结合蛋白（G蛋白）,有学者使用大肠杆菌原核表达系统并选择p ET-28a（＋）作为表达载体表达Ni V N蛋白[15],相较于原核表达系统,虽然表达蛋白量接近,但哺乳动物细胞可以更准确地完成许多翻译后加工功能,例如糖基化,磷酸化和蛋白水解,因此表达的产物在分子结构,物理和化学性质以及生物学功能方面更接近天然蛋白质[16]。BOSSART等[17]采用构建的带有NiV sG蛋白表达序列以及SGS-tag标签的重组痘苗病毒感染HeLa细胞制备NiV可溶性G蛋白,并通过S蛋白纯化系统纯化目的蛋白,而本次试验选用的293F细胞悬浮培养系统,对比于HeLa细胞此类贴壁培养细胞,其培养体系更大,产生目的蛋白量以及浓度更高,能短时间内获得大量目的蛋白。本试验在G蛋白上引入了组织纤溶酶原激活物信号肽[18],使其作为分泌型蛋白产出至培养基内,相较于前人的研究[17]通过破碎细胞得到目的蛋白,分泌表达可以使目的蛋白减少因胞内蛋白酶的降解而提高表达量[19]且操作更为便利,只需要收集培养基上清即可,同时也有利于对目的蛋白的纯化,结果证明了可以有效的减小蛋白纯化的难度。另外,加入了可切除信号肽的TEV蛋白酶酶切位点,能够对标签进行切除,保证了其在后期作为亚单位疫苗使用的安全性。设计截短的重组G蛋白既能实现可溶性表达又保留了良好的免疫原性,并通过免疫小鼠制得具有良好特异性抗体效价的血清,为今后疫苗评价,病毒入侵机制研究奠定了基础。