检测F种肠道病毒双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

王浴光,常晓冉,胡俊英,刘 叙,蔡梦露,章 凡,胡卉琪,王新平,2* （.吉林大学 动物医学学院,吉林 长春 30062；2.吉林大学 教育部人兽共患病研究重点实验室,吉林 长春 30062）

肠道病毒（enterovirus,EV）是一种引起人类和动物消化系统、呼吸系统和神经系统疾病的病原体,属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员。依据最新的病毒分类,肠道病毒属目前共包含有12个肠道病毒种（A～L）和3个鼻病毒种（A～C）。同种EV又可以进一步分为多种血清型/基因型。其中A～D主要感染人类,能够引起脊髓灰质炎、柯萨奇病毒感染和小儿手足口病等疾病。EV-E、EV-F主要感染牛,EV-G种则主要感染猪,引起猪出现一些消化系统症状[1-7]。

牛肠道病毒感染于20世纪50年代后期由MOLL等[8]首次报道后,很多国家也先后报道有本病的发生与流行。本病在国内为新近报道的传染病,LI等[9]于2011年首次从内蒙某奶牛场发病牛体内分离到F种EV；邢泽黎等[10]于2012年首次从国内牛群分离鉴定出首株E种肠道病毒HY12毒株,进而确定国内牛群也存在EV-E病毒感染。根据血清型及病毒基因组序列的差异,牛肠道病毒目前包括EV-E和EV-F 2个种,它们在血清学上不存在交叉反应。目前,检测与诊断牛EV感染的方法主要有病毒分离、RT-PCR方法和实时定量PCR方法,但这些方法或多或少存在一些缺陷。病毒分离方法虽然准确可靠,但该方法耗时费力,且病毒分离成功率较低。RT-PCR和实时定量PCR方法虽然敏感,但由于提取的RNA极易降解,也很容易造成假阴性结果。同时,由于EV-E和EV-F分别属于不同种的肠道病毒,两者在血清学上不存在交叉反应,因而,应用检测EV-E或EV-F的方法难以确定肠道病毒感染的种类。为了提供精确检测牛EV感染的方法,本研究在前期建立的检测EV-E的基础上,进一步建立了检测EV-F的双抗体夹心ELISA方法,并对方法进行了特异性、敏感性及重复性确定,同时应用该方法对山东河南两地部分样品进行了检测。结果表明,建立的方法具有良好的特异性和敏感性,且快速简便,利于基层推广,适用于EVF的临床诊断和大规模流行病学调查。

1 材料与方法

1.1病毒、菌株、细胞及载体SD-S67毒株属于EV-F,分离于山东省某养羊场的腹泻山羊的粪便样品[11]；HY12毒株为EV-E,分离于吉林省某发生严重腹泻和呼吸道症状的牛群,由本实验室保存。BVDV-SD15毒株为本实验室分离于山东省某发生牛病毒性腹泻的牛群,由本实验室保存。2种病毒分别使用Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）和MDBK（牛肾细胞）进行细胞培养。细胞培养液为含10%胎牛血清的DMEM,维持液为含2%胎牛血清的DMEM。原核表达载体p GEX-4T-1、细菌菌株Top10菌株和BL21菌株均由本实验室保存。EVF病毒感染粪便样品、EV-E病毒感染粪便样品和BVDV感染粪便样品分别采自山东省和吉林省发生腹泻的羊场和牛场,样品处理参照文献[12]介绍的方法进行。

1.2SD-S67重组蛋白VP1的表达和纯化SD-S67病毒感染Vero细胞出现50%细胞病变时,应用InvitrogenTMRNA提取试剂盒提取样品总RNA,然后以Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒（Ta KaRa）合成病毒cDNA,并以合成的cDNA为模板和SD-S67病毒的特异性引物扩增VP1基因。扩增VP1基因的引物如下:SD-S67-VP1-F 5′-CGCGGATCCGTTAAGGACTCAATCAAGGGGGCAG-3′；SD-S67-VP1-R 5′-CCGGAATTCAGTGGTGATGGAGCTGCGGTTT-3′。扩增出的VP1基因片段经序列鉴定后,克隆到载体p GEX-4T-1的Bam HⅠ/EcoRⅠ位点,通过酶切验证及序列测定正确后,将构建的重组质粒p GEX-4T-1-VP1转化到表达菌BL21中,过夜培养后,挑取单个菌落,接种于200 m L LB液体培养基,37℃摇菌至菌液D600值为0.6～0.8时,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,并于室温条件下进行诱导表达3 h。10 000 r/min离心5 min收集沉淀细菌菌液。以超声破碎菌体30 min,然后10 000 r/min离心10 min,收集沉淀,并用p H8.5、1.5 mol/L尿素洗涤3次。离心沉淀经过8 mol/L尿素溶解后获得高纯度VP1重组蛋白,于—80℃保存备用。

1.3抗VP1多克隆抗体制备及效价测定将纯化的蛋白参照文献方法与Sigma-Aldrich公司弗氏完全佐剂按照1∶1的比例完全混合,充分乳化后,按照2 mg/只于家兔皮下多点注射,共免疫3次,每次免疫间隔14 d,第3次免疫后7 d耳静脉采血,收集血液分离血清,以间接ELISA的方法测定血清的抗体效价。当抗体效价达到10 000×时,进行加强免疫并于3 d内采集血液分离血清,并将分离血清于—80℃中保存备用。

1.4制备抗体的鉴定采用Western blot和免疫过氧化物酶单层细胞试验（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）对制备的高免血清的反应原性进行鉴定。Western blot参照文献[13]的方法进行,检测样品为SD-S67病毒感染Vero细胞的总蛋白,阴性对照为正常Vero细胞的总蛋白。

IPMA方法鉴定制备的抗体按照本实验室建立的方法进行。将SD-S67病毒感染的Vero细胞经过甲醇于—20℃中固定20 min后,以5%脱脂奶粉封闭1 h,加入600×稀释的高免血清37℃孵育1 h后,与1 000×稀释的商品化HRP标记抗兔IgG抗体37℃孵育45 min,然后以AEC显色15～30 min,以0.5‰PBS-T充分洗涤、干燥后于显微镜下观察。阴性对照采用生长良好的Vero细胞。

1.5多克隆抗体的纯化和HRP抗体标记应用饱和硫酸铵法提纯IgG抗体,并以高碘酸法对抗体进行HRP标记[14],标记抗体经过鉴定后于—80℃保存备用。

1.6捕获抗体最佳包被浓度和酶标抗体最佳稀释浓度的确定应用方阵滴定法确定。将多克隆抗体稀释后,按照每孔100,200,400,800 ng的量加入到酶标板,4℃过夜包被后,以含有0.5‰PBS-T洗涤酶标板3次,应用5%脱脂奶粉于37℃封闭1 h。然后加入预处理过阳性样品,于37℃温箱中感作1 h后,以洗液洗涤3次后,分别加入200×、400×、800×和1 600×的酶标抗体,37℃温箱中孵育45 min,应用OPD（邻苯二胺）显色底物室温避光显色15 min后,以2 mmol/L H2SO4终止反应,测定D490值。

1.7双抗体的夹心ELISA检测方法标准确定用建立的ELISA方法检测30份阴性样品,确定出平均值和 标 准 差（s）。按 照 公 式D490（样品）≥进行标准的确定。

1.8双抗体夹心ELISA阻断性试验将4份阳性样品分别与制备的抗VP1血清、纯化的抗VP1抗体、阴性血清混合后于37℃温箱中孵育1 h,然后以建立的夹心ELISA方法对其进行检测,确定方法的特异性。

1.9交叉反应试验以建立的方法检测BVDV（牛病毒性腹泻病毒）,EV-E阳性样品,同时以EV-F阳性样品作为阳性对照,确定建立的双抗体夹心ELISA方法的特异性。

1.10重复性试验以建立的ELISA方法对EV-F的3份阳性样品和3份阴性样品同时进行检测。每份样品设立3个重复,确定试验方法的组内变异系数；重复进行3次试验,确定组间变异系数。

1.11敏感性试验分别应用建立的ELISA方法对10×倍比稀释EV-F阳性和阴性粪便样品进行检测,确定检测样品的最大稀释倍数。同时与RTPCR方法进行比对检测20份样品,确定2种方法的符合率。

1.12不同地区EV-F感染的初步调查以建立的检测EV-F病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法检测来自山东和河南的100份样品,确定不同地区EV-F感染情况。

2 结果

2.1SD-S67VP1基因的扩增及重组质粒的鉴定PCR扩增出SD-S67的VP1基因片段大小为825 bp,与预期的结果相符（图1A）。扩增VP1基因片段克隆到pGEX-4T-1原核表达载体后,以Bam HⅠ/EcoRⅠ酶切鉴定（图1B）,重组质粒酶切后,获得预期大小的片段。序列测定与分析结果显示,插入片段与GST序列位于同一阅读框,无碱基突变。

图1 SD-S67 VP 1基因扩增及重组质粒酶切验证

2.2VP1重组蛋白的表达与纯化构建的重组质粒p GEX-4T-1-VP1通过热激法转化至感受态菌BL21中,以1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。与IPTG未诱导细菌对照相比,VP1重组蛋白在IPTG诱导后,均获得表达,且与预期的大小相符。表达蛋白用1.5 mol/L尿素纯化后,SDS-PAGE电泳显示获得单一条带,说明纯化效果良好（图2）。

图2 重组蛋白的表达及纯化

2.3高免血清的鉴定应用IPMA的方法对制备的高免血清进行鉴定,结果如图3A所示。与正常细胞对照相比较（图3B）,SD-S67病毒感染细胞的胞浆内呈现红染现象,表明制备的抗体具有良好的反应原性。进一步应用Western blot对血清进一步鉴定,结果如图3C。病毒感染细胞出现预期大小的清晰蛋白条带,而正常细胞对照则无条带,进一步表明制备的高免血清具有良好反应原性和特异性。

图3 高免血清反应原性鉴定结果

2.4双抗体夹心ELISA检测方法最佳条件及判定标准的确定结果方阵滴定法确定捕获抗体的最佳包被量为400 ng/孔,酶标抗体的最佳稀释浓度为1∶400。以建立的双抗体夹心ELISA对30份阴性粪便样品进行检测,结果样品D490的均值＝0.133,标准方差双抗体夹心ELISA阳性判定值为即检测样品的D490值大于0.217时判定为阳性,低于0.217时为阴性。

2.5阻断试验结果4份EV-F阳性样品与高免血清、纯化抗体和阴性血清阻断结果见表1。高免血清和纯化IgG处理过的阳性样品的D490值下降50%以上,而阴性血清对EV-F病毒抗原的D490无明显影响,表明建立的方法具有良好的特异性。

表1 阻断试验结果（D值）

2.6双抗体夹心ELISA检测方法特异性结果以建立的双抗体夹心ELISA方法对EV-E和BVDV阳性样品进行检测,结果显示与阳性对照EV-F相比,EV-E和BVDV样品检测结果均为阴性,表明建立的方法具有良好的特异性（表2）。

表2 交叉反应结果

2.7双抗体夹心ELISA检测方法的重复性结果阳性样品和阴性样品的组内变异系数为1.05%～9.24%,组间变异系数为1.39%～6.78%,说明该方法具有良好的重复性（表3）。

表3 重复性试验结果%

2.8双抗体夹心ELISA敏感性检测结果将20份样品分别用建立的ELISA方法和RT-PCR方法进行比对检测,结果显示2种方法检测结果相同,阳性均为3例,阴性均为17例,2种方法的符合率为100%（表4）。同时,将阳性样品稀释1 000倍后,以ELISA对其检测,结果仍为阳性,表明该检测方法具有良好的敏感性。

表4 双抗体夹心ELISA和RT-PCR检测方法的比较

2.9不同地区牛群EV-F感染情况以建立的双抗体夹心ELISA对采自山东省和河南省不同养殖场的100份粪便样品进行检测,2个省区均存在不同程度的EV-F的感染,其中山东阳性率为12%,河南阳性率为8%（表5）。

表5 山东省和河南省地区牛群EV-F感染的ELISA检测结果 份

3 讨论

牛肠道病毒感染自20世纪50年代后期首次被报道以来,许多国家和地区也报道有本病的发生与流行。2011—2012年前后,国内牛群也先后被确定存在牛肠道病毒感染。LI等[9]于2011年首次从内蒙某奶牛场发病牛体内分离到F种肠道病毒；邢泽黎等[10]于2012年首次从国内牛群分离鉴定出首株E种肠道病毒HY12毒株。感染牛群通常呈现消化道、呼吸道及繁殖障碍等症状,给养牛业造成较大的经济损失。牛EV包含2个不同肠道病毒种,即EV-E和EV-F,它们之间核苷酸序列差异很大,在血清学上无交叉反应,因而,应用检测单一肠道病毒种（EV-E或EV-F）的血清学方法难以确定肠道病毒感染的种类。目前,确定牛肠道病毒感染的方法主要有病毒分离、ELISA、RT-PCR方法和实时定量PCR方法。病毒分离方法虽然可靠,但耗时费力,且分离成功率较低。RT-PCR和实时定量PCR方法虽然敏感,但由于提取的RNA极易降解,也很容易造成假阴性结果。本实验室依据分离的国内首株EV-E HY12毒株,建立的检测E种肠道病毒（EVE）的夹心ELISA方法。为了精确确定牛群中肠道病毒感染的种类,本研究在前期建立检测EV-E方法的基础上,进一步建立了检测EV-F的双抗体夹心ELISA方法,试验结果表明,建立的方法具有良好的特异性和敏感性,且快速简便,可用于EV-F的临床诊断和大规模流行学调查。

本方法在建立的过程中,选择了多克隆抗体,主要是考虑多克隆抗体制备成本低,周期短,且敏感性高于单克隆抗体等因素。同时,试验结果表明,应用表达纯化的病毒VP1蛋白制备的高免血清,具有良好的特异性,能够满足建立方法所需求的特异性与敏感性。同时与RT-PCR检测结果一致。该方法通过检测动物的排泄物,能够克服传统检测动物体内抗体方法的滞后性问题和RT-PCR检测的假阴性问题,可用于该病的早期诊断和流行病学调查。

对采自山东省和河南省的粪便样品进行了检测,EV-F感染率为8%～12%,低于前期检测出的相同牛群的EV-E感染率[15-16]。本试验同一群体先后检测出EV-E和EV-F,说明2个肠道病毒种可同时感染同一牛群。由于肠道病毒为单股正链RNA病毒,在与宿主对抗过程中极易发生变异和重组,因而,2个肠道病毒种同时感染同一群体可能为新的毒株产生提供基础,应该引起同行的注意。