马链球菌兽疫亚种PepO蛋白原核表达及其免疫保护试验

孙 莹,尚天甜,刘旭明,韩 莹,摆淑玲,彭 婕 （甘肃农业大学 动物医学院,甘肃 兰州 730070）

马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equisubsp.zooepidemicus,SEZ）为C群链球菌,是引起猪链球菌病的主要病原之一,可通过多种途径感染多种动物,主要引起脑膜炎、心内膜炎等[1]。近年来,相关疫情在全球范围内频繁暴发[2]。该病原菌可通过多种途径感染多种动物,脑膜炎是人和动物感染SEZ的普遍症状[3]。

SEZ突破血脑屏障（blood-brain-barrier,BBB）是其导致脑膜炎的前提条件。已有文献报道了与SEZ黏附和免疫逃避有关的毒力因子[4],但是SEZ破坏BBB的机制尚不十分明确。前期研究采用SILAC联合LC-MS/MS技术筛选了SEZ能够黏附或侵入小鼠脑微血管内皮细胞（mBMEC）的分泌蛋白,显示Pep O蛋白能够显著黏附或侵入mBMEC细胞,提示该蛋白可能与SEZ突破血脑屏障引起脑膜炎密切相关[5]。本研究拟通过原核表达并纯化SEZ-Pep O重组蛋白,制备兔多克隆抗体,并检测多抗在细菌黏附m BMEC时的免疫保护作用。同时,用纯化后的蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,检测该蛋白对SEZ感染小鼠的免疫保护作用,为研究SEZ感染后引发脑膜炎的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1菌株及主要试剂SEZ ATCC35246菌株由南京农业大学兽医微生物学与免疫学实验室馈赠。表达质粒pCold-SUMO（pSCH）、SUMO标签酶ULP表达质粒ULP-28a及其宿主菌E.coliDH5α和E.coliBL21均由本实验室保存。各种限制性内切酶和PrimeSTAR Max premix（2×）购自TaKaRa；细菌基因自提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega；CloneExpressTMⅡOne Step Cloning Kit购自诺唯赞。BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo Fisher。胎牛血清（FBS）和DMEM购自Gibco。MTT检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。酶标二抗（HRP）标记的山羊抗家兔IgG和HRP标记的山羊抗小鼠IgG为北京索莱宝科技有限公司产品。

1.2pSCH-pepO原核表达质粒构建与鉴定根据NCBI已公布的的Pep O蛋白基因（pep O）序列设计引物,在基因扩增引物的5′端分别添加载体同源重组序列。按照细菌基因组提取试剂盒说明方法提取SEZ ATCC35246株细菌基因组,以该基因组为模板,用PrimeSTAR Max premix（2×）及pep O基因扩增引物（表1）进行巢氏PCR,扩增SEZpep O基因。扩增反应结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,切取目的条带大小所在位置胶条,按胶回收试剂盒说明回收目的片段。pSCH质粒使用SacⅠ和HindⅢ进行双酶切后,用DNA回收试剂盒回收线性化质粒。目的片段用One Step Cloning Kit试剂盒进行同源重组连接至目的载体pSCH,连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞。挑取单克隆,进行PCR及测序鉴定重组质粒,从而获得pSCH-pepO重组质粒。

表1 pepO基因扩增引物

1.3PepO蛋白表达与纯化提取上述测序鉴定阳性的重组质粒,转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞。经37℃、180 r/min震荡培养至D600nm值为0.8～1.0,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L。16℃180 r/min连续诱导24 h,用于后续切除载体SUMO标签蛋白p ET 28a-ULP以相同的方式进行诱导表达。诱导后,检测蛋白表达情况。将连接Pep O-pSCH菌液与p ET 28a-ULP菌液按4∶1比例混合后离心收集菌体。用PBS洗涤3次,加入原菌液1/10体积的上清Tris-binding buffer重悬,超声波破碎菌体。4℃静置过夜,使ULP切除融合表达蛋白的SUMO标签。离心,分别收集上清和沉淀,检测可溶性蛋白与包涵体蛋白表达量,选择可溶性蛋白进行纯化。将超声破碎离心后的上清液经0.45μm的滤膜过滤后,用His TrapTMHP蛋白纯化柱对重组蛋白进行纯化,获得只含有His标签的重组蛋白r Pep O,纯化蛋白使用BCA法检测蛋白浓度。将诱导前、后菌体超声破碎后的上清和沉淀及纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE检测。

1.4rPepO兔多克隆抗体的制备将纯化蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混合制备油包水免疫乳剂,经背部皮下多点注射免疫60日龄新西兰长耳兔。每次每只200μg,免疫间隔时间为10 d,每次免疫后7 d经耳缘静脉采血,分离血清用以检测特异性抗体效价。在第4次免疫7 d后心脏采血,分离血清。用纯化的重组蛋白rPep O包被96孔酶标板,每孔10μg。以分离的血清为一抗,HRP标记的山羊抗兔IgG为酶标二抗,进行间接ELISA检测抗体效价[6]。

1.5mBMECs细胞的被动抗体保护试验用兔抗r Pep O多抗血清和m BMECs进行细胞的被动抗体保护试验。为验证Pep O多抗血清对SEZ分泌蛋白细胞毒性的影响,将r Pep O抗体与SEZ培养上清液以1∶10的比例混合后于37℃共孵育30 min,获得含有10%兔抗rPep O血清的混合物。用含有10%兔抗rPep O血清的混合物、未处理的SEZ上清液和THB培养基分别处理m BMECs,于不同时间点使用MTT法测定mBMEC细胞活力,以检测不同样品的细胞毒性。为验证Pep O多抗血清对SEZ黏附侵袭mBMEC细胞能力的影响,将含有r Pep O抗体的兔血清以1∶10的比例加入到m BMECs细胞培养液中,以相同处理方式的阴性兔血清作为对照,每孔加入106CFU/m L SEZ-ATCC35246菌液500μL,37℃、5%CO2温箱孵育60 min。弃去细胞上清,HBSS洗涤细胞3次,洗去未黏附的细菌,每孔加500μL无菌蒸馏水,移液器吹打使细胞裂解,随后进行10倍比稀释。取原液、10—2、10—4稀释度进行涂板,37℃倒置培养。平板计数,计算结果。每个处理组设置3个生物学重复。

1.6小鼠免疫保护试验试验小鼠为8周龄雌性BALB/c小鼠,购自中国农业科学院兰州兽医研究所,共计30只,随机均分为3组。将纯化蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混合制备为油包水免疫乳剂。第1组小鼠腹腔注射50μg的r Pep O蛋白、第2组小鼠注射等体积PBS与佐剂混合物、第3组小鼠用作空白对照（未免疫）。每间隔10 d免疫1次,共免疫3次。于首次免疫后每间隔7 d经眼眶采血分离血清,用以检测血清抗体效价。第3次免疫7 d后所有小鼠腹腔注射5×104CFU SEZ ATCC35246株（5×LD50）。每天记录小鼠的存活情况,连续观察7 d。

2 结果

2.1pSCH-pepO原核表达质粒构建与鉴定结果以SEZ-ATCC35246基因组为模板,经PCR扩增获得的pep O基因编码序列产物大小为1.9 kb（图1A）。pep O基因连接pSCH质粒后,以pSCH的多克隆位点两侧通用测序引物进行PCR及测序验证（图1B）。结果显示,重组质粒中插入序列与载体骨架连接正确,插入序列无突变,表明重组质粒pSCH-pepO构建成功。

图1 pepO基因及重组质粒PCR结果

2.2PepO蛋白表达与纯化的鉴定已成功构建的pSCH-pepO质粒转化至E.coliBL21感受态细胞,获得Pep O原核表达工程菌株pSCH-pepO/BL21,16℃诱导24 h后SDS-PAGE检测Pep O表达情况。结果显示,与诱导表达前相比,菌体全蛋白中出现约为84 ku的SUMO-Pep O融合蛋白条带（图2,泳道2）。SUMO-Pep O融合蛋白在菌体裂解上清中含量较多（图2,泳道3）,无需以包涵体样品制备其天然构象蛋白溶液。SUMO-Pep O融合蛋白与ULP孵育后,融合蛋白N′-端的SUMO标签被切除。利用融合蛋白C′-端的His标签,对r Pep O蛋白进行纯化。纯化后r Pep O蛋白经SDS-PAGE检测。结果显示样品条带单一,相对分子质量约为72 ku（图2,泳道5）。经Quality ONE软件分析,r Pep O蛋白产物纯度约为87.9%。BAC定量测得纯化蛋白质量浓度为1 g/L。

图2 SEZ-Pep O重组蛋白的SDS-PAGE分析

2.3r Pep O兔多克隆抗体的制备与效价的检测以r Pep O蛋白制备的免疫乳剂免疫新西兰长耳兔,共免疫4次。首免后每间隔7 d经耳缘静脉采血,分离血清,采用间接ELISA检测血清中特异性抗体效价。结果显示,首免后7 d即可在血清中检测到Pep O抗体,表明Pep O重组蛋白具有良好的免疫原性（图3）。抗体可以中和SEZ上清液中的Pep O,降低了SEZ细菌培养上清的细胞毒性。细菌黏附细胞是细菌感染的首要步骤,本研究将兔抗rPep O血清与SEZ菌液混合后加入mBMECs,检测Pep O抗体对细菌黏附侵袭mBMEC细胞能力的影响,结果显示加入Pep O多抗血清处理组的细菌黏附侵袭量较阴性血清处理组下降87%,两者相比差异极显著（图4B）,表明抗r Pep O抗体可以阻碍SEZ黏附m BMECs,降低了细菌的侵袭力。

图3 兔Pep O血清抗体滴度的测定

2.4mBMEC细胞的被动抗体保护试验在测定SEZ分泌蛋白对mBMEC细胞活力的影响时,将Pep O抗体加入到SEZ上清液中,结果显示每个时间点上清液细胞毒性显着降低（图4A）,表明Pep O

图4 Pep O多克隆抗体降低SEZ对mBMEC的细胞毒性

2.5小鼠免疫保护试验将纯化蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混合制备的油包水免疫乳剂腹腔免疫BALB/c小鼠3次,首免后每间隔7 d经眼眶采血分离血清,间接ELISA检测血清中抗Pep O抗体效价,结果显示,首免7 d后在小鼠血清中检测到抗Pep O抗体,28 d后效价为103（图5）。由此说明该蛋白具有良好的免疫原性,能够有效刺激小鼠产生体液免疫反应。免疫后小鼠经腹腔注射5×104CFU SEZ-ATCC35246株（5×LD50）,同时免疫PBS组和未免疫以相同的注射途径及剂量攻毒作为对照。连续观察7 d。结果显示在r Pep O免疫保护组中,仅3只小鼠在免疫后2～4 d死亡,其他7只小鼠均存活7 d以上。PBS处理组和空白组的所有小鼠在攻毒后2～4 d全部死亡（图6）。本试验结果表明,重组蛋白r Pep O可以对部分小鼠提供免疫保护力。

图5 BALB/c小鼠Pep O血清抗体滴度的测定

图6 Pep O蛋白的免疫保护检测

3 讨论

Pep O是一种锌金属内肽酶,最初在乳酸菌中被发现,其能够内切若干种来源于酪蛋白的多肽链。Pep O曾被命名为中性热溶素样寡内肽酶（NOP）,现名为寡内肽酶（Pep O）[7]。近年来,因Pep O对多种毒力相关表型的影响而在链球菌属中受到越来越多的关注[8]。有研究表明,化脓性链球菌的Pep O受Cov RS调控,可以通过降解群体感应信号肽,调控化脓性链球菌在病理环境中的毒力相关行为[9]。在肺炎链球菌中,细菌表面暴露的Pep O可以通过结合补体C1q蛋白,进而促进与宿主细胞的黏附[10],并可能通过切割补体蛋白C3b调控补体途径[11]。在猪链球菌中也报道了内肽酶在发病机制中的重要性,其中能够被分泌至胞外且具有免疫原性的Pep O被认为是潜在的候选疫苗[12]。同时,肺炎链球菌Pep O、Psa A联合免疫小鼠可以有效抵抗肺炎链球菌的感染[13]。

由于SEZ仍是我国猪链球菌病的主要病原之一,且目前已有的弱毒疫苗或灭活疫苗尚存在免疫保护力低或疫苗安全性不高等问题,制备亚单位疫苗可有效避免以上不足,为畜牧业提供安全有效的疫苗。本研究发现,SEZ-Pep O抗血清能降低SEZ分泌蛋白对m BMEC毒力,同时SEZ-Pep O抗血清能够显著降低SEZ对mBMEC细胞的的黏附力,表明Pep O蛋白与细菌黏附脑微血管内皮细胞密切相关,是SEZ致病的潜在的毒力因子,并且Pep O多抗血清能够在细菌黏附侵袭时对细胞形成有效保护。据报道,SEZ类M蛋白（SzP）和纤维结合素结合蛋白（FNZ）均为SEZ重要的毒力因子,可作为SEZ重要的保护性抗原,其免疫保护力分别为70%和62.5%[14],磷酸甘油酸酯激酶（PKG）可产生较高的免疫保护效力[15]。在本研究中,小鼠针对SEZ-Pep O产生的免疫反应可以在其后的攻毒过程中产生保护作用,免疫保护力为70%,高于FNZ所产生的免疫保护力,与SzP所产生免疫保护力水平基本一致。以上结果表明,Pep O蛋白可以作为亚单位疫苗的候选抗原。