LPS诱导的奶牛蹄真皮细胞基因表达谱变化分析

田梦悦,李 可,贾 丽,梁艳艳,侯铭源,马玉忠 （河北农业大学 动物医学学院,河北 保定 071001）

蹄叶炎作为奶牛最常见的疾病之一,可造成严重的经济损失[1]。目前,体内动物模型被广泛应用于奶牛蹄叶炎的研究中[2],但细胞模型的报道十分少见。蹄叶炎主要发生于奶牛蹄壁真皮层[3]。因此,探索和建立奶牛蹄真皮细胞炎症模型并研究其分子机制,具有广阔的应用前景。转录组测序是通过新一代高通量测序技术,对整个转录组文本进行的测序研究[4]。根据转录组测序结果,可以筛选差异表达基因,揭示特定状态下生物体的内在调控机制。近年来,该技术为探索疾病的发生机制、临床诊断和药物研发等提供了新的思路[5]。本试验通过LPS诱导原代奶牛蹄真皮细胞,建立细胞炎症模型,并利用转录组测序技术,获得奶牛蹄真皮细胞的转录基因表达谱,筛选差异表达基因,通过生物信息学分析,探讨在LPS诱导下奶牛蹄真皮细胞的反应机制与生物学变化。

1 材料与方法

1.1主要试剂DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青有限公司；LPS购自Sigma公司；CCK-8试剂盒购自Solarbio公司；牛TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒购自北京冬歌博业生物科技公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自康为世纪公司。

1.2试验动物组织样本奶牛健康蹄部皮肤组织样本取自河北保定莲池区回族区屠宰场。

1.3奶牛蹄真皮细胞的原代培养无菌条件下取奶牛蹄部皮肤组织,组织块培养法获取奶牛蹄真皮细胞[6]。将获取的真皮细胞用含15%FBS的DMEM悬浮,置于CO2培养箱中培养。

1.4LPS诱导奶牛蹄真皮细胞炎症模型的建立

1.4.1细胞活力检测 将奶牛蹄真皮细胞以1.0×105/孔的密度接种于96孔板中,37℃、5%CO2条件下培养过夜。将细胞分为6组,用0,1,5,10,50,100 mg/L LPS处理后,37℃、5%CO2条件下培养6,12,24,48 h,每孔加入10μL CCK-8溶液。37℃孵育1 h后,测定各孔450 nm处的D值,计算细胞活力。

1.4.2ELISA检测上清液中的炎性因子含量 以2.5×105/孔的密度接种蹄真皮细胞于24孔细胞板中,分为6组,用0,1,5,10,50,100 mg/L LPS处理后,CO2培养箱中培养24,48 h后,收集上清液,ELISA法检测TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的含量。

1.5LPS诱导的奶牛蹄真皮细胞基因表达谱变化分析

1.5.1细胞总RNA提取 将奶牛蹄真皮细胞以1.2×106/孔的密度均匀接种于6孔细胞板中,对照组加入DMEM基础培养基2.5 m L/孔,处理组加入10 mg/L LPS 2.5 m L/孔,继续培养24 h后,利用TRIzol法提取蹄真皮细胞中的总RNA。

1.5.2RNA质量检测、转录组测序及差异表达基因筛选 将总RNA样本通过NanoDrop 2000、Agilent 2100生物分析仪以及琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。委托苏州金唯智生物科技有限公司进行高通量转录组测序。差异基因筛选标准为:差异基因表达变化2倍以上且qvalue≤0.05。

1.5.3差异表达基因生物信息学分析 （1）GO富集分析:利用Gene Ontology数据库对差异表达基因从3个角度进行功能注释和富集分析。（2）KEGG富集分析:利用KEGG数据库中的pathway注释信息,分析筛选得到的差异基因主要参与的信号转导途径和代谢通路。

1.5.4RT-PCR验证转录组测序结果 随机选取10个差异表达基因,采用荧光定量RT-PCR法验证其m RNA的变化趋势,对高通量转录组测序结果进行验证。选择GAPDH作为内参基因。所用引物经由Primier 5软件设计,由上海生工生物有限公司合成,引物序列见表1。实时荧光定量PCR反应体系为15μL:2×Fast Super EvaGreen®qPCR Mastermix 7.5μL,上、下游引物（10μmol/L）各0.3μL,cDNA 1.5μL,dd H2O 5.4μL。反应条件为:95℃预变性2 min:95℃变性5 s,56℃退火5 s,72℃延伸25 s,45个循环。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.6数据分析SPSS 21.0软件中的单因素方差分析（one-way AVONA）进行组间数据分析,试验数据以平均数±标准差±s）表示,*示P＜0.05表示差异显著,**示P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1LPS对奶牛蹄真皮细胞活力的影响如图1所示,LPS处理6 h对细胞活力无显著影响（P＞0.05）；10,50,100 mg/L LPS处理12 h后,细胞活力显著（P＜0.05）或极显著下降（P＜0.01）；LPS处理24 h后,除1 mg/L组外,其余质量浓度LPS均可极显著降低细胞活力（P＜0.01）；LPS处理48 h后,所有质量浓度均可使细胞活力极显著下降（P＜0.01）。

图1 LPS对奶牛蹄真皮细胞活力的影响

2.2LPS对奶牛蹄真皮细胞TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量的影响ELISA结果显示,与对照组相比,1,5,10,50,100 mg/L LPS刺激奶牛蹄真皮细胞24,48 h,均可使TNF-ɑ含量显著（P＜0.05）或极显著升高（P＜0.01）；均可使IL-1β含量极显著升高（P＜0.01）；除1 mg/L LPS作用48 h外,LPS均可使IL-6含量极显著升高（P＜0.01）（图2）。

图2 LPS对奶牛蹄真皮细胞TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量的影响

2.3细胞总RNA质量检测对照组与LPS处理组细胞所提取的总RNA经质量检测,发现各组样品浓度、质量可满足测序需求,D260/D280均大于1.8（表2）,电泳图条带清晰、完整、无杂带,RIN值均大于8（图3）,表明样品合格。

图3 样品总RNA电泳图

表2 样品总RNA质检

2.4差异表达基因筛选以log2FoldChange＞2倍且qvalue≤0.05作为标准,对高通量转录组测序结果进行分析,共筛选到差异表达基因2 194个,其中上调基因1 138个,下调基因1 056个（图4）。

图4 差异表达基因火山图

2.5GO富集分析筛选得到的差异表达基因共富集到435个GO term中,图5展示了富集最显著的30个GO term。结果显示,差异表达基因主要具备细胞因子活性、生长因子活性、趋化因子活性等分子功能,定位于细胞质、细胞外间隙、细胞外基质等细胞组分,参与免疫反应、细胞黏附、炎症反应等生物过程。

图5 差异表达基因GO富集分析

2.6KEGG富集分析经KEGG富集分析,差异基因涉及到的pathway共321个,图6展示了富集最显著的30个pathway条目。结果显示,差异表达基因主要涉及趋化因子信号通路、NOD样受体信号通路、IL-17信号通路等生物体系统,与谷胱甘肽代谢、果糖和甘露糖代谢、类固醇生物合成等新陈代谢过程相关,参与PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、Rap1信号通路等环境信息加工,涉及细胞衰老、细胞凋亡等细胞过程。图7为KEGG富集通路的气泡图,显示PI3K-Akt信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、MAPK信号通路富集的差异基因数量较多,TNF信号通路、类固醇生物合成、果糖和甘露糖代谢通路差异基因数量富集程度较大。

图6 KEGG富集分析柱状图

图7 KEGG富集分析气泡图

2.7荧光定量PCR验证转录组测序结果为验证转录组测序结果的可信性,随机挑选10个差异表达基因,采用qRT-PCR验证其m RNA表达情况（表3）。因检测方法不同,RNA-Seq结果与qRT-PCR结果在数值上略有出入,但表达趋势基本一致,证实转录组测序结果可信。

表3 qRT-PCR验证差异基因表达水平

3 讨论

LPS作为引发炎症的最为关键的细胞毒性因子之一,可用于诱导并建立多种损伤模型[7]。本试验通过CCK-8法,发现LPS可显著抑制奶牛蹄真皮细胞的细胞活力,抑制作用呈现时间及剂量依赖性。据报道,使细胞活力抑制率≤10%的LPS质量浓度,为炎症模型的最佳造模质量浓度[8],因此,初步选定10 mg/L LPS用于诱导炎症模型。

细胞因子的过度产生与炎症损伤密切相关[9]。TNF-α、IL-1β和IL-6是典型的促炎细胞因子,在炎症反应的发病过程中发挥着极为关键的作用[10]。本试验为了进一步评估LPS炎症模型,通过ELISA法检测炎症因子的分泌量,发现不同质量浓度的LPS处理奶牛蹄真皮细胞24,48 h后,均可导致TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量升高,且呈现一定程度的剂量依赖性；与对照组相比,10 mg/L LPS刺激均可导致TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含 量 极 显 著 升 高（P＜0.01）,结合细胞活力检测结果,选定10 mg/L LPS为最佳造模质量浓度。

本试验通过RNA-Seq技术对LPS刺激的奶牛蹄真皮细胞的基因表达谱进行分析,共筛选到差异表达基因2 194个,并对其进行生物信息学分析。GO分析显示,差异表达基因主要参与免疫反应、细胞黏附、炎症反应等生物过程,说明LPS诱导奶牛蹄真皮细胞产生了免疫应答反应,且对细胞的生理功能及新陈代谢产生了影响。

KEGG分析进一步揭示了差异表达基因所涉及到的信号通路的变化,结果显示LPS诱导的奶牛蹄真皮细胞相关免疫及炎症通路出现了不同程度的变化,例如,MAPK信号通路、TNF信号通路、Rap1信号通路、PI3K-Akt信号通路、NOD样受体信号通路等,这些信号通路以多种方式相互联系,来调节下游细胞黏附分子、细胞因子、趋化因子等生物活性物质的产生。TNF是炎症反应的关键调节剂,可与2种不同的细胞表面结合受体TNFRI和TNFR2相互作用。TNF信号通路可介导MAPK、NF-κB信号通路的激活,这3条信号通路之间相互联系,通过各种调节机制,引发白细胞黏附,血栓形成等一系列炎性反应[11]。Rap1可通过激活下游p38和JNK信号通路,抑制细胞分化,促进细胞的迁移以及细胞黏附,从而改变细胞的迁移与侵袭[12]。PI3K-Akt与MAPK信号通路之间的关系错综复杂,既能相互激活,也能相互抑制,从而确保细胞信号以较高的保真度向下游传递[13]。

碳水化合物代谢紊乱可导致瘤胃酸中毒,乳酸、组胺、内毒素等物质大量产生并作用于蹄部,从而继发蹄叶炎[14-15]。多项研究证明,奶牛患有蹄叶炎时机体内脂代谢出现紊乱[16-17]。血液中高浓度的氨或尿素会损伤蹄层状组织及蹄真皮[18],可见新陈代谢紊乱与蹄叶炎的发生有着极为密切的关系。本试验KEGG结果表明,LPS刺激奶牛蹄真皮细胞的变化与类固醇生物合成、果糖和甘露糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、氮代谢等新陈代谢过程相关,与前人研究相符,但具体机制还有待研究。