枣多糖提取物对环磷酰胺所致的蛋雏鸡肠黏膜免疫屏障功能下降的缓解作用

郭林霞,马可为,冯志华,刘彦慈,刘观忠,李清艳,弓素梅,李树鹏*,赵国先* （.河北农业大学动物科技学院,河北 保定 07000；.保定职业技术学院,河北 保定 07000；.河北农业大学 动物医学院,河北 保定 07000）

近年来,动物免疫抑制严重阻碍了畜牧业的可持续发展[1]。为了消除或缓解免疫抑制,增强动物免疫力,免疫增强剂得以广泛运用。肠道是体内最大的淋巴组织,肠道免疫作用主要是通过肠黏膜屏障（机械、化学、生物和免疫屏障）功能来实现的,其中免疫屏障通过产生大量的免疫因子进而起到免疫清除肠道有害微生物或抗原的作用,以分泌型免疫球蛋白（SIg）A介导的体液免疫为主。研究表明,免疫抑制会导致畜禽肠黏膜免疫屏障受损,SIg A的分泌量降低[2-3],而植物多糖则可以有效缓解[4-5],但是目前就枣多糖提取物（JPE）对蛋雏鸡肠黏膜SIg A的影响及其机理探究还鲜见报道。因此本试验旨在通过探究JPE对环磷酰胺（Cy）所致的蛋雏鸡肠黏膜免疫屏障功能下降的缓解作用,为其作为免疫增强剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与主要试剂1日龄京红1号蛋雏鸡,由河北环山农牧有限公司提供；JPE,前期实验室提取；Cy纯度为98%,购自上海迈瑞尔化学技术有限公司。

1.2试验设计本试验采用单因子完全随机试验设计,另设空白对照（BC）组。选取体质量相近且健康的1日龄京红1号蛋鸡750只,适应饲养6 d后,随机均分为5组,每组6个重复,每个重复25只鸡,组间体质量差异不显著。Ⅰ组为BC组,在8～10日龄时皮下注射0.35 m L生理盐水,饲喂基础饲粮。Ⅱ～Ⅴ组在8～10日龄皮下注射Cy 100 mg/kg,每天1次,诱导肠黏膜免疫屏障损伤,并从11日龄开始,分别饲喂含有0,400,800,1 600 mg/kg JPE的饲粮。试验期为5周。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础） %

1.3饲养管理进雏前对鸡舍进行全面冲洗及消毒。试验过程按养鸡场的常规管理程序进行免疫、驱虫、采光和通风。采食方式、饮水方式和鸡群密度按鸡场程序调整。各组均匀分布于3层阶梯式鸡笼,消除位置引起的误差。试验期内每天8:00和15:00各喂1次料,自由采食和饮水。每天观察鸡群健康状况,记录死鸡和病鸡数量。

1.4测定指标及方法

1.4.1空肠分泌因子含量 于试验的最后1 d从每个重复中选取1只与平均体质量相近的鸡,颈部放血致死,剖开腹腔,迅速截取空肠3 cm左右,用生理盐水冲洗干净,放入冻存管中,—80℃保存。根据ELISA试剂盒说明书进行IL-（2,4,5,6和10）、TGF-β、IFN-γ、Ig A、SIg A含量的测定。

1.4.2空肠TLR4 m RNA表达量 按1.4.1方法采集样品,利用TRIzol法提取总RNA,电泳检测质量,使用Nanodrop 2000超微量分光光度计测定RNA浓度及纯度后,进行逆转录获得cDNA的一条链,再以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）,每组3个重复。参考GenBank鸡TLR4基因m RNA序列,利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计,以GAPDH为内参基因。引物由武汉塞维尔生物科技有限公司合成。引物信息见表2。

表2 引物信息

1.4.3空肠荆豆凝集素1的蛋白表达量 M细胞为一种特殊的上皮细胞,荆豆凝集素1（UEA1）可特异的与M细胞结合,故利用标记的UEA1可以作为鉴别M细胞的依据[6-7]。UEA1的蛋白质表达量如下:样品采集如1.4.1。将空肠组织切块剪碎充分研磨后,加入10倍体积的RIPA裂解液在冰上裂解组织,4℃、12 000 r/min离心10 min,收集上清,即为总蛋白溶液。按照试剂盒说明书抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白,按常规进行热变性,依次进行SDSPAGE电泳、转膜及封闭,加入一抗（UEA1抗体）,4℃孵育摇床过夜,加入二抗（HRP标记山羊抗兔）,室温下孵育30 min,加入ECL发光液处理,并进行压胶片、显影、定影。利用蛋白质凝胶成像分析系统观察个组蛋白质的相对表达量[8]。

1.5数据统计分析试验数据经Excel处理,用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析,并用Duncan’s法进行多重比较,P＞0.05表示差异不显著,P＜0.05表示差异显著,P＜0.01表示差异极显著。结果以“平均值±标准误”的形式表示。

2 结果

2.1JPE对蛋雏鸡空肠IgA和SIgA的影响

2.1.1Ig A 与Ⅰ组比,Ⅲ～Ⅴ组Ig A升高（P＜0.01）,Ⅱ组Ig A有下降趋势（P＝0.09）；与Ⅱ组比,Ⅲ～Ⅴ组Ig A升高（P＜0.01）；Ⅳ组Ig A比Ⅲ、Ⅴ组高（P＜0.01）（表3）。

2.1.2SIg A 与Ⅰ组比,Ⅱ组SIg A降低（P＜0.05）,Ⅲ～Ⅴ组SIg A升高（P＜0.01）；与Ⅱ组比,Ⅲ～Ⅴ组SIg A升高（P＜0.01）；Ⅳ组SIg A比Ⅲ、Ⅴ组高（P＜0.01）。其他组间差异不显著（P＞0.05）（表3）。

表3 JPE对蛋雏鸡空肠Ig A和SIg A的影响

2.2JPE对蛋雏鸡空肠TLR4 mRNA表达量的影响与Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组比,Ⅳ和Ⅴ组TLR4升高（P＜0.01）；其他组间差异不显著（P＞0.05）（表4）。

表4 JPE对蛋雏鸡空肠TLR4 m RNA表达量的影响

2.3JPE对蛋雏鸡空肠UEA1蛋白质表达量的影响与Ⅰ组和Ⅱ组比,Ⅲ～Ⅴ组UEA1升高,其中Ⅲ组差异显著（P＜0.05）,其他差异极显著（P＜0.01）；Ⅴ组较Ⅲ组和Ⅳ组高（P＜0.01）；其他组间差异不显著（P＞0.05）（表5,图1）。

图1 JPE对UEA1表达量的影响

表5 JPE对蛋雏鸡空肠UEA1蛋白质表达量的影响

2.4JPE对蛋雏鸡空肠白介素分泌量的影响

2.4.1IL-2 与Ⅰ组和Ⅱ组比,Ⅲ～Ⅴ组升高（P＜0.01）；Ⅲ组和Ⅳ组比Ⅴ组高（P＜0.01）（表6）。

2.4.2IL-4 与Ⅰ组比,Ⅱ～Ⅴ组升高,其中Ⅱ组差异显著（P＜0.05）,其他差异极显著（P＜0.01）；与Ⅱ组比,Ⅲ～Ⅴ组升高（P＜0.01）；Ⅲ组和Ⅳ组IL-4比Ⅴ组高（P＜0.01）（表6）。

2.4.3IL-5 与Ⅰ组比,Ⅱ～Ⅴ组降低（P＜0.01）；与Ⅱ组比,Ⅲ～Ⅴ组升高（P＜0.01）（表6）。

2.4.4IL-6 与Ⅰ组比,Ⅱ～Ⅴ组降低,其中Ⅳ组差异显著（P＜0.05）,其他差异极显著（P＜0.01）；与Ⅱ组比,Ⅳ组和Ⅴ组升高（P＜0.01）；Ⅳ组（P＜0.01）和Ⅴ组（P＜0.05）比Ⅲ组高（表6）。

2.4.5IL-10 与Ⅰ组比,Ⅱ～Ⅴ组升高（P＜0.01）；与Ⅱ组比,Ⅲ～Ⅴ组升高（P＜0.01）；Ⅳ组比Ⅲ、Ⅴ组高（P＜0.01）,Ⅲ组比Ⅴ组高（P＜0.01）（表6）。

表6 JPE对蛋雏鸡空肠白介素分泌量的影响 ng/g

2.5JPE对蛋雏鸡空肠TGF-β和IFN-γ分泌量的影响

2.5.1TGF-β 与Ⅰ组和Ⅱ组比,Ⅲ～Ⅴ组升高（P＜0.01）；Ⅳ组比Ⅲ组（P＜0.05）和Ⅴ组（P＜0.01）高（表7）。

2.5.2IFN-γ 与Ⅰ组比,Ⅱ组（P＜0.01）、Ⅲ组（P＜0.05）和Ⅴ组（P＜0.01）降低；与Ⅱ组比,Ⅲ组和Ⅳ组升高（P＜0.01）；Ⅲ组和Ⅳ组比Ⅴ组高（P＜0.01）。其他组间差异不显著（P＞0.05）（表7）。

表7 JPE对蛋雏鸡空肠TGF-β和IFN-γ分泌量的影响 ng/g

3 讨论

肠黏膜免疫屏障是动物体最重要的屏障之一,以SIg A介导的体液免疫为主[9]。研究表明,Cy可以显著降低小肠中SIg A的含量[3,10],本试验结果与此一致,说明空肠免疫屏障受损。研究表明,党参多糖[4]和淫羊藿多糖[5]均可以显著增加雏鸡肠道中SIg A的含量。本试验结果显示,与Cy组比,JPE组中SIg A均显著增加,均达到了BC组水平,说明JPE可以显著缓解Cy导致的SIg A降低,进而缓解免疫屏障功能损伤。

Ig A是SIg A的重要组成部分,为了探究JPE促进SIg A产生的机理,本试验对Ig A的含量进行到了测定。研究表明,Cy可以降低小鼠[11]和雏鸡[2]肠道中Ig A的表达量或含量,本试验结果表明,Cy可以使Ig A的含量下降,但未达到显著水平,可能与作用时间和剂量有关。研究表明,鱿鱼墨多糖[11]和淫羊藿多糖[5]均可以显著促进肠道中Ig A的分泌,本试验结果与其一致,且JPE组达到了BC组水平。且Ig A含量随着JPE浓度的增加先增加后减少,即存在最适添加量（800 mg/kg）,与SIg A变化一致,说明JPE通过提高Ig A促进SIg A的分泌。

为了探究JPE对Ig A分泌过程的具体影响,本试验对各个阶段的影响因子进行了测定。

3.1JPE对B细胞激活过程的影响为了探究JPE激活B细胞的途径,本试验测定了肠道TLR4 m RNA以及肠道黏膜免疫的前哨细胞-M细胞的含量（UEA1的表达量）。

免疫细胞只有通过免疫识别受体后才能介导Ig A的产生,并进一步分泌到肠腔,发挥获得性免疫作用,TLR4则是一种重要的免疫细胞表面的识别受体[12]。研究表明,Cy可以降低小鼠小肠中TLR4 m RNA的表达量[13-14]。本试验结果显示,Cy对TLR4 mRNA表达量没有显著影响,可能与作用时间和试验动物有关。研究表明,灵芝多糖[14]和冬虫夏草多糖[15]均可以显著缓解Cy导致的TLR4 m RNA的表达下降。本试验结果表明,与Cy组相比,中高剂量JPE组TLR4 m RNA的表达量显著增加,由此说明TLR4是JPE的受体之一。各个剂量JPE组TLR4 m RNA的表达量均达到了BC组水平,且添加800～1 600 mg/kg效果较好。

M细胞是一种特化的肠上皮细胞,是肠道黏膜免疫的前哨细胞,主要分散于派氏结（PPs）相关上皮细胞中,它可以从肠腔中摄取抗原,并将其转运给抗原递呈细胞,经识别后转运到PPs,进而激活淋巴细胞,启动肠道黏膜免疫应答[16]。荆豆凝集素1（UEA1）可特异地与M细胞结合,标记的UEA1可以作为鉴别M细胞的依据[7]。研究表明,Cy可以显著降低小鼠肠道中M细胞的数量[17]。本试验结果显示,Cy对UEA1的表达量（即M细胞数量）没有显著影响,可能与Cy的剂量及试验动物有关,需要进一步验证。JIANG等[17]试验表明,香菇多糖可以促进小鼠肠上皮细胞分化M细胞,增强其抗原转移能力,进而改善免疫抑制小鼠肠黏膜的免疫状态。本试验结果显示,与Cy组比,JPE组的UEA1均显著升高,即M细胞的数量增加,说明JPE可以通过促进M细胞的表达来提高抗原递呈能力。JPE的各个剂量组的UEA1表达量均达到BC组水平,且以高剂量组效果最好。

3.2JPE对B细胞分化过程的影响B细胞分化过程中受到IFN-γ、TGF-β等细胞因子的调控。研究表明,Cy可以使雏鸡[18]和小鼠[15]肠道IFN-γ的分泌量降低,本试验结果与其一致,可能是因为Cy破坏了免疫细胞。左涛[12]和CHEN等[19]试验结果显示,小鼠和大鼠肠道IFN-γ的分泌不受Cy控制,可能与Cy的剂量和纯度有关。毕师诚等[2]试验中Cy显著下调了雏鸡十二指肠中TGF-β的含量；CHEN等[19]试验显示,Cy对大鼠小肠中TGF-β的含量没有显著影响,本试验中Cy对雏鸡空肠中的TGF-β也无显著影响,可能与Cy的作用时间长短及其作用部位有关。

研究表明,参芪多糖[18]和黄连多糖[19]分别显著促进雏鸡空肠黏膜和大鼠小肠黏膜中IFN-γ的分泌。本试验结果显示,与Cy组比,低中剂量JPE组的IFN-γ极显著增加,且中剂量JPE组的IFN-γ均达到BC组水平。而鱿鱼墨多糖[12]对小鼠肠道IFN-γ的分泌没有显著影响,可能与多糖的分子量、单糖组成以及多糖的糖苷键结构有关。玉屏风多糖和黄连多糖[19]均可以促进鼠小肠中TGF-β的分泌。在本试验中,与Cy组比,JPE的各剂量组的TGF-β均极显著升高,均达到了BC组水平,预示着JPE对免疫细胞功能具有改善作用。且TGF-β的含量随着JPE质量浓度的增加先增加后减少,即存在最适添加量（800 mg/kg）。

3.3JPE对B细胞的IgA类别转换过程的影响B

细胞的Ig A类别转换过程受IL-2、IL-4、IL-5和TGF-β的调控。IL-2可促进B淋巴细胞分泌抗体。研究表明,Cy可使小鼠十二指肠和回肠的IL-2降低[10,15]。本试验中Cy则对IL-2没有显著影响,可能与试验动物和作用部位有关。灵芝多糖[14]和冬虫小草多糖[15]可以显著促进小鼠肠道IL-2的分泌,本试验中各个剂量的JPE均可显著促进IL-2的分泌,并均恢复到BC组水平,且400～800 mg/kg效果较好。

IFN-γ和IL-4是调节SIg A分泌的主要细胞因子,分别是辅助性T细胞TH（1和2）的代表因子。研究表明,Cy可以使雏鸡空肠黏膜[20]和小鼠小肠[14]的IL-4含量显著下降。而本试验中Cy使IL-4含量显著升高,与上述结果不一致,可能是因为本试验中Cy导致IFN-γ含量降低,进而使得IFN-γ对IL-4拮抗作用减弱[21],造成IL-4/IFN-γ失调,以此导致TH1和TH2的平衡状态被破坏,使得TH2细胞占优势,引起异常的免疫反应。研究表明,参芪多糖[20]和猴头菇多糖[22]可分别使雏鸡空肠黏膜和雏鸭十二指肠中的IL-4升高。本试验结果显示,与Cy组比,JPE的各个剂量组中IL-4均极显著升高,与上述结果一致。由此说明,JPE通过促进IL-4和IFN-γ的增加促使TH1和TH2细胞趋于平衡,维持免疫系统正常运行。JPE的各个剂量组的IL-4均恢复到BC组水平,且添加400～800 mg/kg效果较好。

IL-5是B细胞生长因子[23],可以协同TGF-β促进B淋巴细胞增殖,促进Ig A的产生。本试验中,Cy使IL-5含量显著降低,而对TGF-β则没有显著影响,由此得出,Cy通过降低IL-5导致Ig A的产生受阻。研究表明,猴头菇多糖[24]和霍山石斛多糖[25]可分别促进番鸭十二指肠和小鼠空肠分泌IL-5。本试验结果显示,与Cy组比,JPE的各个剂量组中IL-5极显著升高,与上述结果一致。结合TGF-β的结果,得出JPE通过促进IL-5和TGF-β的分泌来促进B淋巴细胞增殖,进而促进Ig A的产生。且JPE的各个剂量组IL-5均未达到BC组水平,可能是添加量不够。

3.4JPE对B细胞终末分化过程的影响B细胞终末分化过程主要受IL-6和IL-10的调控[12]。IL-6促进浆细胞的终末分化,并可以将免疫球蛋白的产量提高6～8倍[11]。据报道,Cy可使雏鸡[2]和小鼠[12]肠道中IL-6的含量下降,本试验结果与此一致,说明Cy通过影响IL-6的分泌来影响B细胞的终末分化过程。研究表明,鱿鱼墨多糖[12]和太子参多糖[10]可以促进IL-6的表达。本试验结果显示,与Cy组比,中和高剂量JPE组显著升高,说明JPE可以显著缓解Cy导致的IL-6的减少,且存在剂量相关性。JPE各个剂量组IL-6均未达到BC组水平,可能是添加量不够。

IL-10可促进B细胞分化增殖[26]。研究表明,Cy可使小鼠肠道中IL-10的含量下降[15],而本试验中Cy组的IL-10较BC组显著升高,可能与TH1和TH2细胞因子失衡有关。枸杞多糖[27]促进鼠肠道中IL-10的分泌,本试验结果显示,与Cy组比,JPE的各个剂量组均极显著升高,均达到BC组水平,且IL-10随着JPE剂量的增加先增加后降低,即存在最适添加量（800 mg/kg）。