葛根素对饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡免疫器官抗氧化功能的影响

施 璇,余应梅,欧阳经鑫,郭帅鹏,陈 春,刘三凤,黎观红* （1.江西农业大学 江西省动物营养重点实验室,江西 南昌 330045；.江西农业大学 动物科学技术学院,江西 南昌 330045）

现代家禽养殖业中采用的玉米-豆粕型饲粮难以满足家禽生长过程中对能量的需求,因此在生产实践中常添加一定剂量的油脂用以提高饲粮能量水平。添加油脂的饲粮可以减少饲料粉尘,提升饲粮适口性,改善脂蛋白的水解和吸收[1],减缓饲粮通过胃肠道的速度,提高营养物质的的吸收利用率[2]。因此,油脂在肉鸡饲料上的应用越来越普遍。然而,高油脂饲料在加工、贮存、运输和饲喂过程中易发生氧化酸败。研究表明,饲粮中的氧化油脂可通过多种途径引起畜禽氧化应激,导致组织细胞膜结构受损,机体抗氧化功能和免疫力下降,造成生产性能和肉品质量的下降,死亡率增高[3-8]。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白（Keap1）/核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路是抗氧化应答反应中最重要的信号通路,可被内/外源性刺激诱导,对维持细胞内氧化还原平衡和降低细胞因氧化应激损伤导致的凋亡具有重要的调节作用[9-10]。在正常生理状态下,Nrf2以抑制状态与Keap1偶联形成二聚体,Keap1/Nrf2信号处于关闭状态[11]。在氧化应激状态下,Nrf2与Keap1发生解离或结合被阻断,游离的Nrf2进入到细胞核中与核内小分子蛋白肌腱膜纤维肉瘤（Maf）结合形成异二聚体,再与抗氧化反应元件（ARE）相关序列结合调节抗氧化酶的表达,抵御机体内氧化应激反应[12-14]。

葛根是我国历史悠久的药食同源性植物,含有多酚、多糖和黄酮类化合物等活性成分,主要以黄酮类为主,其中,葛根素（puerarin）是主要的黄酮类活性成分[15]。葛根素的化学名为8-β-D-葡萄吡喃糖-4′,7-二羟基异黄酮,结构与雌二醇相似,具有部分雌激素样作用[16]。研究表明,葛根素具有清除自由基、抑制脂质过氧化、抗氧化、抗炎等生物学功能[17-19]。目前,有关葛根素的研究主要集中于医学和保健食品方面,在畜禽生产中的应用鲜见报道[20-21]。免疫器官是机体免疫防御屏障重要的调控中心,对维持机体免疫稳态具有重要作用。为此,本次试验通过测定肉鸡免疫器官抗氧化酶的活力水平和Keap1/Nrf2信号通路及其下游信号分子m RNA的相对表达量,初步探讨氧化大豆油对黄羽肉鸡免疫器官抗氧化功能的影响及葛根素的调节作用,以期为葛根素在畜牧生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1氧化大豆油的制备参考文献[22]的方法制备氧化大豆油。新鲜大豆油为市售精炼一级食用大豆油。新鲜大豆油在沸水浴中连续加热10 h,并且持续通入空气。分别在加热第4,7,9,10小时测定大豆油的过氧化值（POV）和丙二醛（MDA）的含量。当POV≥90 meq/kg时,氧化大豆油制备结束。油脂POV用滴定法测定,MDA含量的测定方法参考GB 5009.181-2016。

1.2试验设计选取健康状况良好、体质量（34.3±0.6）g的1日龄雌性黄羽肉鸡360只,随机均分成4个处理组,每个处理6个重复,每个重复15只鸡。4个处理分别饲喂含新鲜大豆油的饲粮（Ⅰ组,对照组）、含新鲜大豆油且添加750 mg/kg葛根素的饲粮（Ⅱ组）、含氧化大豆油的饲粮（Ⅲ组）和含氧化大豆油且添加750 mg/kg葛根素的饲粮（Ⅳ组）。葛根素的添加量参考文献[18,23-25]确定。本试验所用的新鲜大豆油其POV和MDA分别为1.53 meq/kg和0.18 mg/kg,氧化大豆油POV和MDA分别为95 meq/kg和26.41 mg/kg。1～28日龄饲粮中大豆油添加量为2%,29～56日龄饲粮中大豆油添加量为3%。本试验所用的葛根素购自杨凌慈缘生物科技有限公司,纯度为98.31%,批次号为CY190320。

1.3试验饲粮与饲养管理本试验采用的基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮,根据我国NT/T 33—2004《鸡饲养标准》推荐的营养水平,按1～28,29～56日龄2个阶段进行配制。饲粮组成及营养水平见表1。试验鸡采用四层笼笼养。试验前对鸡舍进行充分冲洗和严格消毒,入雏前24 h将鸡舍升温至32～35℃,此后温度每周降低2～3℃,直至保持在22～24℃为止。采用连续光照、自然通风。试验期舍内光照、湿度和温度根据常规饲养管理要求进行控制,鸡只按正常免疫程序进行免疫。整个试验期鸡只自由采食和饮水。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础） %

1.4样品采集在28,56日龄时,黄羽肉鸡提前禁食12 h,期间自由饮水,每个重复随机选取1只鸡,断颈处死,取胸腺、脾脏和法氏囊用1×PBS和DEPC溶液冲洗干净并用吸水纸吸取残余液体后分装入冻存管中,迅速置于液氮中冷冻,最后置于—80℃冰箱保存待用。

1.5测定指标及方法

1.5.1免疫器官MDA含量和抗氧化指标 采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定胸腺、脾脏和法氏囊匀浆上清液MDA含量、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性,检测方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.2Keap1/Nrf2信号通路及其下游信号分子m RNA表达 将免疫器官分别与TransZol溶液按1∶9（g∶m L）比例混合用高速组织研磨仪制成10%的组织匀浆,然后提取组织匀浆中总RNA再反转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR（qPCR）技术测定Keap1、Nrf2、Maf、SOD、GSH-Px、HO-1、NQO1 m RNA表达水平。所用试剂购于北京全式金生物技术有限公司（北京,中国）,试验操作步骤严格按照说明书进行。相关引物序列见表2。试验结果以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内源性对照进行归一化,再根据2—△△Ct法计算相关m RNA的相对表达水平。

表2 qPCR引物序列

1.6统计分析采用Excel 2010对试验数据进行初步整理,用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）,用Duncan氏法进行多重比较检验,结果以“平均值±标准误”表示,P＜0.05为差异显著,P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1葛根素对饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡免疫器官抗氧化指标的影响由表3可知,与对照组相比,饲喂含氧化大豆油饲粮显著提高28日龄肉鸡肝脏和法氏囊以及56日龄脾脏中MDA含量（P＜0.01）,且显著提高28日龄肉鸡胸腺MDA含量（P＜0.05）。与对照组相比,饲喂含氧化大豆油饲粮显著降低28日龄肉鸡脾脏T-AOC以及28日龄肉鸡胸腺、脾脏和法氏囊SOD活力（P＜0.05）,且显著降低56日龄肉鸡胸腺和法氏囊T-AOC以及56日龄胸腺SOD活力（P＜0.01）。与对照组相比,饲喂含氧化大豆油饲粮显著提高28,56日龄脾脏、法氏囊以及56日龄胸腺GSH-Px活力（P＜0.01）。与对照组相比,饲粮中添加葛根素显著降低28日龄肉鸡法氏囊MDA含量（P＜0.05）,且显著降低56日龄肉鸡胸腺MDA以及28日龄胸腺和法氏囊GSHPx活力（P＜0.01）。与对照组相比,饲粮中添加葛根素显著提高28日龄肉鸡胸腺T-AOC（P＜0.01）,且显著提高28日龄胸腺和56日龄脾脏SOD活力以及28日龄脾脏GSH-Px活力（P＜0.05）。与饲喂氧化大豆油饲粮组相比,饲粮中添加葛根素显著降低28,56日龄肉鸡胸腺以及56日龄脾脏MDA含量（P＜0.01）,且显著提高28日龄肉鸡胸腺和脾脏以及56日龄肝脏和脾脏T-AOC（P＜0.01）。与饲喂氧化大豆油饲粮组相比,饲粮中添加葛根素显著提高28日龄和56日龄脾脏SOD活力（P＜0.05）,显著降低28日龄脾脏和法氏囊以及56日龄法氏囊GSH-Px活力（P＜0.01）,并且显著降低56日龄脾脏GSH-Px活力（P＜0.05）。

表3 葛根素对饲喂含氧化大豆油黄羽肉鸡免疫器官抗氧化指标的影响

2.2葛根素对饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡免疫器官Keap1/Nrf2信号通路的影响由图1可知,与对照组相比,饲喂含氧化大豆油饲粮显著降低28日龄肉鸡脾脏Nrf2和56日龄胸腺Nrf2、Kaep1以及56日龄脾脏Maf m RNA表达（P＜0.01）,且显著降低28,56日龄肉鸡法氏囊Nrf2以及28日龄胸腺和56日龄法氏囊Maf mRNA表达（P＜0.05）。与对照组相比,饲喂含氧化大豆油饲粮显著降低28日龄肉鸡胸腺SOD以及28,56日龄胸腺HO-1 m RNA表达（P＜0.05）,且显著降低28日龄肉鸡法氏囊SOD以及56日龄脾脏和28日龄法氏囊HO-1 m RNA表达（P＜0.01）。与对照组相比,饲喂含氧化大豆油饲粮显著降低28日龄肉鸡脾脏NQO1 m RNA表达（P＜0.01）,且显著降低28,56日龄法氏囊NQO1 m RNA表达（P＜0.05）。与对照组相比,添加葛根素显著提高56日龄肉鸡脾脏Nrf2以及28,56日龄法氏囊Keap1 m RNA表达（P＜0.05）,且显著提高28日龄和56日龄肉鸡胸腺以及56日龄脾脏Keap1 m RNA表达（P＜0.01）。与对照组相比,添加葛根素显著提高56日龄肉鸡胸腺Maf和56日龄胸腺HO-1以及2,56日龄法氏囊和56日龄胸腺NQO1 m RNA表达（P＜0.05）,且显著提高28日龄肉鸡脾脏Maf和28日龄胸腺NQO1 m RNA表达（P＜0.01）。与饲喂氧化大豆油饲粮组相比,饲粮中添加葛根素显著提高28日龄肉鸡胸腺Nrf2和28日龄脾脏Keap1以及28日龄胸腺Maf、NQO1 mRNA表达（P＜0.05）,且显著提高56日龄肉鸡胸腺和28日龄法氏囊Nrf2、NQO1以及56日龄脾脏和28日龄法氏囊Keap1 m RNA表达（P＜0.01）。与饲喂氧化大豆油饲粮组相比,饲粮中添加葛根素显著提高28日龄和56日龄肉鸡胸腺Keap1、HO-1以及28,56日龄法氏囊Maf、SOD m RNA表达（P＜0.01）,且显著提高56日龄肉鸡胸腺和脾脏Maf以及56日龄胸腺SOD和28日龄脾脏GSHPx m RNA表达（P＜0.01）。与饲喂氧化大豆油饲粮组相比,饲粮中添加葛根素显著降低28日龄肉鸡法氏囊GSH-Px m RNA表达（P＜0.05）,显著提高56日龄脾脏和28日龄法氏囊HO-1 m RNA表达量（P＜0.01）。

图1 葛根素对饲喂含氧化大豆油黄羽肉鸡免疫器官Keap1/Nrf2信号通路相关分子mRNA表达的影响

3 讨论

3.1葛根素对饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡免疫器官抗氧化指标的影响动物采食过量含过氧化物的氧化油脂会诱导机体产生氧化应激[26]。据报道,氧化应激的评判可以以一些应激指标的测定作为依据,例如SOD、CAT、GSH-Px活性以及GSH和MDA含量[27-28]。T-AOC作为衡量机体抗氧化系统功能状况的综合指标,T-AOC的降低表明机体自由基的产生和清除失衡,处于氧化还原失衡状态[22,29]。本试验结果发现,饲喂含氧化大豆油饲粮黄羽肉鸡免疫器官中MDA含量升高,SOD活力和T-AOC降低以及CAT低到未检测出,表明长期且大量采食含氧化大豆油的饲粮会增加黄羽肉鸡免疫器官中脂质过氧化物,免疫器官的抗氧化能力减弱,对机体造成氧化损伤,进而导致氧化应激。SOD和GSH-Px作为抗氧化防御第一道防线,在应激状态下其活力通常降低[30],但是也有研究表明应激状态下机体内GSH-Px活力水平升高[29]。另据报道,MDA能够有效破坏SOD的合成途径,降低机体内SOD活力[31]。本试验结果表明,饲喂含氧化大豆油饲粮的黄羽肉鸡免疫器官中GSH-Px活力升高,推测SOD、CAT和GSH-Px发挥抗氧化作用可能存在先后效应。首先,SOD清除自由基产生H2O2,再由CAT和GSH-Px清除[32-33]。由于CAT在机体内每秒可分解107mol的H2O2,非常高效。因而,CAT首先发挥清除作用,保护细胞免受H2O2的氧化损伤[34]。因此,在氧化大豆油刺激机体产生氧化应激时,大量的脂质过氧化物和自由基产生,SOD首先发挥催化作用将其转化为H2O2,再由CAT快速高效地分解。当机体内CAT含量过低时,GSHPx取而代之发挥清除效应,因而组织中GSH-Px活力不会显著降低。另有研究证明,在应激条件下机体可以额外合成SOD[35]。因此,在长期的氧化应激过程中也会有SOD持续生成,发挥抗氧化作用,并不会出现与CAT相同的结果。葛根素具有许多的药理作用,如抗氧化、降血压、预防心脏疾病和神经变性等[36-37]。目前,有关葛根素对家禽胸腺、脾脏和法氏囊的研究鲜见报道。饲粮中添加葛根素后胸腺、脾脏和法氏囊MDA含量呈现出降低的结果。花青素同属于黄酮类化合物,饲粮中添加花青素也会降低氧化应激状态下法氏囊中MDA含量,提高SOD活力[27]。异黄酮是黄酮类化合物的一个亚类,具有较强的抗氧化活性[38]。葛根素主要活性成分为8-β-D-葡萄吡喃糖-4′,7-二羟基异黄酮。MDA是过氧化脂质的主要降解产物,其化学结构中含有一个醛基,醛基性质活泼,容易发生缩合反应和加成反应。由葛根素和MDA化学结构式我们可以看出,葛根素中的羟基可以与MDA中的醛基发生缩合反应,从而达到清除MDA的效果。然而,羟基化学性质也较为活泼,与其相连的α-C可以发生氧化反应,因此葛根素也可以通过自身氧化,减少机体内脂质过氧化反应。因此,饲粮中添加葛根素可以降低免疫器官中脂质过氧化产物。

3.2葛根素对饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡免疫器官Keap1/Nrf2信号通路的影响Keap1/Nrf2信号通路是调节机体氧化还原反应的经典途径,可被内/外源性刺激诱导,对维持细胞内氧化还原平衡和降低细胞因氧化应激损伤导致的凋亡具有重要的调节作用[9-10]。Nrf2作为Keap1/Nrf2信号通路中重要的转录因子,在生理状态下与Keap1形成聚合物,Nrf2的功能被抑制[39-41]。本试验结果表明,Keap1/Nrf2信号通路受氧化大豆油影响,Keap1和Nrf2 mRNA表达量降低,添加葛根素后其m RNA表达量升高。有研究认为,Keap1是哺乳动物细胞内亲电剂和氧化剂的传感器,Keap1的半胱氨酸残基修饰或与亲电剂/氧化剂结合或蛋白质结构直接被破坏,减少或阻断了Keap1与Nrf2的结合,导致细胞质中Nrf2积累、向核内易位并激活Keap1/Nrf2信号通路及其下游信号分子[42]。当机体处于应激状态下时,Keap1与Nrf2结合能力减弱,释放出Nrf2和新生的Nrf2在细胞质中积聚,活化的Nrf2进入细胞核中与Maf结合,激活并启动ARE调节抗氧化酶的表达[13]。在氧化大豆油的作用下,Maf、SOD、HO-1和NQO1 m RNA表达量降低。SOD、GSH-Px、HO-1和NQO1均是Keap1/Nrf2信号通路下游的抗氧化酶。HO-1可催化血红素生成等摩尔的胆红素、CO和铁离子（Fe2＋）,且可与Nrf2共同发挥抗氧化、抗炎等作用,广泛参与心脏、肝脏、肾脏等组织细胞的抗氧化应激损伤[43-44]。有研究表明,Nrf2的激活伴随着HO-1 m RNA表达量升高[45],与本试验结果相一致。当机体处于应激状态下,Keap1/Nrf2信号通路被激活,该通路作用下产生的抗氧化活性物质处于一种持续消耗的状态,以抵御应激对机体造成的损伤。因此,在氧化应激状态下Keap1/Nrf2信号通路及其下游相关信号分子mRNA表达量降低,系统抗氧化能力逐渐减弱。葛根素具有抗氧化作用[17],在含氧化大豆油的饲粮中添加葛根素后,黄羽肉鸡免疫器官中Keap1/Nrf2信号通路及其下游信号分子m RNA表达量升高,系统抗氧化能力增强,因而发挥对机体的保护作用。根据Keap1/Nrf2信号通路相关信号分子m RNA表达结果推测,葛根素也可能作用于该通路中的某一信号分子,增强该通路中抗氧化物质的表达,提高机体抗氧化能力。但是,葛根素调节机体抗氧化能力的作用机制及其作用靶点尚不明晰,仍需深入研究。

饲喂氧化大豆油导致黄羽肉鸡免疫器官MDA含量升高,降低免疫器官T-AOC水平和SOD活性以及Keap1/Nrf2信号通路中相关分子的m RNA表达。饲粮中添加葛根素可降低饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡免疫器官MDA含量,提高免疫器官T-AOC水平和Keap1/Nrf2信号通路下游抗氧化酶的产生,从而提高免疫器官的抗氧化功能。