山羊Notch1基因的表达及细胞定位

王玉婷,张 成,柳 璇,高 娜,杨勇飞,李有文 （1.塔里木大学 动物科学学院 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技兵团重点实验室/新疆生产建设兵团南疆动物疫病诊断与防控工程实验室,新疆 阿拉尔 843300）

1919年,MOHR[1]发现Notch基因的缺失会导致果蝇翅膀的边缘有些缺刻（notches）,该基因被命名为“Notch”。1983年,ARTAVANIS-TSAKONAS等[2]成功克隆了Notch基因。该基因广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中,在进化上有高度保守性[3]。Notch信号转导通路通过“旁分泌”连接某个细胞与其邻近细胞,从而控制心血管系统、动物神经元、内皮细胞等分化、增殖和凋亡事件[4-6]。与果蝇只携带1个Notch受体不同,在脊椎动物中已经鉴定出4个Notch旁系（包括Notch1,Notch 2,Notch 3,Notch 4）和5个Notch配体（即JAG1、JAG2、DLL1、DLL3和DLL4）[7]。有研 究 发 现,Notch信号被激活的途径包括细菌和病毒感染[8]。1991年,在人类的T淋巴母细胞白血病中首次鉴定到Notch基因,提示Notch基因与肿瘤存在关系[9]。后续越来越多的研究表明,Notch基因异常与恶性肿瘤的发生密切相关,包括食管癌、胃癌、卵巢癌、结肠癌以及皮肤癌等有关[7],人类最早在染色体易位的T细胞急性淋巴白血病发现Notch1[10]。研究表明,Notch1基因与肿瘤发生有紧密的联系,Notch1基因在参与肿瘤的发生、发展和转移中起重要作用[7]。大部分研究指出这个基因在癌组织中主要位于胞浆或胞核中[11]。

本课题组前期在进行羊痘病毒毒力因子KLP1的互作蛋白研究中,用酵母双杂交的方法从羊皮肤细胞中筛选出与其互作蛋白之一是Notch1蛋白。KLP1是位于羊痘病毒基因组侧翼区域基因编码的蛋白,已有研究证实其是羊痘病毒的一个毒力因子。而Notch1蛋白是宿主细胞的一个跨膜蛋白,能够定位于胞浆或胞核中,有非常重要的生物活性功能,可能参与细胞对病原的防御作用。为了更进一步了解Notch1蛋白,同时为鉴定其与羊痘病毒KLP1互作的真实性和作用部位,本研究通过构建与GFP标签融合表达的真核表达载体以及和GST标签融合的原核表达载体,分别表达Notch1蛋白与GFP和GST标签的融合表达蛋白,同时用Western blot和细胞定位技术研究其表达情况和细胞定位情况,为进一步研究Notch1蛋白及其与羊痘病毒的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1细胞、菌株及质粒羊皮的c DNA酵母文库、大肠杆菌BL21、DH5α、BHK21细胞及pGEX-KG、p EGFP质粒均保存于塔里木畜牧科技兵团重点实验室。

1.2主要试剂PCR Mix酶购自庄盟生物科技公司；核酸染料Golden View购自博迈德生物公司；DNA MarkerⅢ、普通DNA产物纯化试剂盒购自北京天根生物工程技术服务有限公司；琼脂糖凝胶电泳DNA回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自OMEGA公司；HindⅢ、Bam HⅠ等限制性内切酶与d NTP、PCR试剂均购自赛默飞生物科技公司；T4连接酶及Buffer购自Promega公司；Tris base、SDS、甘氨酸、琼脂粉琼脂糖购自北京天根生物工程技术服务有限公司；30%丙烯酰胺购自LABTIDE公司；Protein Marker购自北京全式金公司；卡那霉素、氨苄青霉素购于索莱宝公司；抗GST标签的一抗（鼠源单抗）、二抗（羊抗鼠IgG）购于博士德生物公司。

1.3Notch1基因序列分析根据酵母双杂交筛选所得羊痘病毒KLP1的互作蛋白Notch1的基因序列（部分）GenBank中Blast得到不同动物的Notch1基因的序列19种（表1）,进行同源性比较和遗传进化分析。

表1 不同物种Notch1基因（部分）信息

1.4特异引物设计依据酵母双杂交筛选得到的Notch1基因的测序结果,用DNAMAN软件设计Notch1基因的特异性引物（表2）,为了后续构建方便,5′端分别加入HindⅢ、Bam HⅠ酶切位点,引物由上海生工公司合成。

表2 引物合成列表

1.52种表达载体的构建

1.5.1目的基因的PCR扩增 100μL PCR扩增体系:5×buffer 20μL,PFU酶1.2μL,d NTP 4μL,模板（筛选得到的Notch1的羊皮肤酵母cDNA文库）4.8μL,各自相对应的上、下游引物各2.4μL,dd H2O 65.2μL；扩增程序:95℃5 min；94℃30 s,52℃30 s,72℃60 s,35个循环；72℃10 min。PCR扩增的产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定并切胶回收目的基因。

1.5.2连接、转化 回收获得的目的片段与p GEXKG、p EGFP载体分别使用限制性内切酶HindⅢ、Bam HⅠ进行双酶切,然后用纯化试剂盒对载体和目的片段全部进行纯化回收。目的片段与相应的载体用T4连接酶连接,其产物分别转化DH5α感受态细胞,分别涂布含氨苄青霉素或卡那霉素（50 mg/L）的LB平板,37℃培养过夜后挑取单个菌落进行菌液PCR鉴定。

1.5.3质粒鉴定 菌液PCR鉴定正确的克隆,其菌液使用OMEGA公司的质粒小量提取试剂盒提取质粒,进行HindⅢ、Bam HⅠ双酶切鉴定,并送交上海生工测序公司进行序列测定,并于—20℃保存。

1.6原核表达及鉴定

1.6.1原核表达 经鉴定阳性的原核表达载体转化BL21感受态细胞,挑取单菌落培养,并用诱导剂1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,表达好的菌液离心去上清,沉淀加入100μL PBS悬浮,并加SDS缓冲液煮沸10 min,产物进行SDS-PAGE。

1.6.2Western blot鉴定 融合表达的Notch1-GST融合蛋白经SDS-PAGE,用湿转法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜,使用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h；再用1∶2 000的GST单抗孵育2 h；用TBST Buffer漂洗3次,15 min/次；再用二抗（羊抗鼠Ig G）孵育1 h；用TBST Buffer漂洗3次,15 min/次；用A/B显色液显色10 min,观察结果。

1.7真核表达及细胞定位用10%FBS的DMEM培养基,于37℃、5%CO2条件下培养BHK21细胞并传至6孔板中,待细胞长满85%左右,将构建的融合表达GFP的Notch1真核表达载体用脂质体转染BHK21细胞,转染方法参考文献[12],以GFP的空载体作为阴性对照。转染24 h后开始在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达,并确定Notch1蛋白是否表达及在BHK 21细胞中的定位情况。

2 结果

2.1Notch1基因序列分析酵母双杂交法筛选出的KLP1的互作蛋白Notch1的基因经测序序列为780 bp,只是Notch1的一小部分序列,用该序列在GenBank的Blast中与19种动物该部分序列相应的基因序列进行同源性比较,相互间同源性大于94.13%,说明该基因在种间非常保守。用DNAstar软件对其进行遗传进化关系分析,发现其呈3个分支,其中非洲果蝠为单独1支,牛羊猪等动物为1分支,人、猿、猩猩和水生动物为1支（图1）。

图1 19种动物Notch1基因（部分）遗传进化树分析

2.2Notch1基因PCR扩增使用2对引物分别进行PCR扩增,之后用1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示,在1号泳道的750～1 000 bp处有1条亮带,约为780 bp,与理论大小相符（图2）。

图2 Notch1基因PCR扩增结果

2.3重组表达质粒p GEX-KG-Notch1、p EGFPNotch1的鉴定 将2种重组载体构建好后,分别进行HindⅢ、Bam HⅠ双酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,1号泳道为重组质粒,2号泳道为重组质粒酶切后结果,在750～1 000 bp之间有1条带,与已知目的780 bp基因大小相符,可知载体构建成功（图3）。

图3 重组质粒酶切鉴定图

2.4Notch1基因的原核表达及鉴定构建原核载体后进行大肠杆菌的诱导表达,SDS-PAGE电泳检测,2号泳道中在55～70 k Da处有一表达量明显多于1号对照泳道的条带（图4）。对蛋白电泳的结果进行检测,在1号泳道56 k Da处可见1条与质粒对照不同表达量的条带,与蛋白电泳图的目的蛋白条带在同一位置（图5）。

图4 Notch1蛋白原核表达检测

图5 Notch1蛋白表达的Western blot鉴定

2.5Notch1蛋白的亚细胞定位GFP及提取的重组真核质粒转染到BHK21细胞中培养24～36 h,与阴性对照对比可发现转染GFP质粒的细胞有部分细胞有荧光反应,荧光物质大部位于细胞质,则GFP蛋白位于胞质部位的多,转染GFP-Notch1蛋白的部分细胞有荧光反应,荧光物质大部位于胞核,则重组质粒蛋白大部位于胞核,通过对比可知GFPNotch1蛋白主要位于胞核（图6）。

图6 Notch1蛋白的亚细胞定位（20×）

3 讨论

据报道,肿瘤的发生是癌基因激活和抑癌基因失活所致[7],也有研究观点认为,细胞癌变是由于信号转导途径异常,细胞接受了异常增殖、分化等信号所致[3]。Notch1信号通路作为一种进化保守的细胞间相互作用机制,在细胞的发育、增殖、分化、生存和凋亡中起着十分重要的作用[5],近年来成为多个领域的研究热点之一。

Notch蛋白是由其基因编码的单链跨膜受体蛋白,其基本结构分为胞外区、跨膜区和胞内区。脊椎动物中共发现了4个Notch同源体,分别编码4种Notch受体（Notch1～Notch4）。Notch受体胞内区含有RAM结构域、6个锚蛋白重复序列、2个核定位信号区、1个转录激活结构域以及1个PEST序列[6]。胞内区是Notch受体蛋白的活性形式,其中RAM结构域是C启动子结合因子-1/重组信号结合蛋白-Jκ的主要结合部位,CBF1是存在于人或哺乳动物中的Su（H）蛋白的同源蛋白,也能与锚蛋白重复序列结构域相互作用；ANK重复序列结构域是Deltex、Mastermind等的结合部位,这些蛋白对Notch信号通路有调节作用；PEST结构域则与Notch受体蛋白的降解有关。

本研究中Notch1是通过酵母双杂交方法从感染感染羊痘病毒的羊皮肤细胞中筛选出的羊痘病毒毒力因子KLP1的互作蛋白。从羊皮肤酵母文库只得到Notch1基因的部分序列,约780 bp,位于Notch1全基因的5 130～5 910位,编码1 710～1 940之间的氨基酸,刚好是Notch1基因跨膜区与胞内区的部分。据报道,Notch蛋白会被Kuzbanian酶在其异二聚体的胞外近膜区1 710位丙氨酸～1 711位缬氨酸残基之间的位点进行切割[13],Notch被裂解为2个片段,即胞外区（NECD）和跨膜区和胞内区（NTMIC）,N端裂解产物（NECD）被配体表达细胞吞噬,而C端裂解产物进一步在跨膜区接受其第2次切割。本次切割位点为1 743位甘氨酸残基～1 744位缬氨酸残基之间,酶切释放出Notch蛋白的活化形式-胞内区（NICD）[13]。NICD从细胞浆直接进入细胞核内,与DNA结合蛋白CSL结合,将原来的转录抑制因子CSL转变为转录激活因子,激活CSL下游靶基因的转录[3]。由此可见本次筛选得到的是Notch1基因的跨膜区和胞内区的N端部分。对得到的Notch基因进行同源性和遗传进化分析发现不同动物间该基因的同源性在95.13%以上,可见是一个非常保守的基因,也说明其在细胞分化代谢中的作用的重要性。从遗传进化关系上看,不同动物的该基因分为3个分支,分别为北非果蝠为1个分支,亲缘关系上较其他哺乳动物较远,牛、羊、猪、骆驼和白鲸等聚于1个分支；人及灵长类动物家猫、豹、大熊猫和海狗等聚于1个分支,亲缘关系相对较近。这一结果与目前认识的动物进化关系也较相符。

KLP1是位于羊痘病毒基因组侧翼区域的019基因编码的蛋白,已有研究证明缺失了KLP1的羊痘病毒的毒性大副降低,说明其确实是一个毒力因子。虽然这2个蛋白相互作用的机制及其生物学功能目前还不清楚,但作为病毒的一个毒力因子与宿主细胞的蛋白发生相互作用是非常有可能的。因为Notch1蛋白是一个跨膜蛋白,其膜内区是非常重要的活性区,且其上有2个细胞核定位区,而本次筛选得到的也只是Notch1蛋白的跨膜区和靠近膜的胞内区部分,根据本试验对其定位的结果推测,该片段正是Notch1基因的膜内区,且至少是一个核定位区,因为与绿色荧光蛋白GFP的空载体相比,Notch1与GFP融合表达的蛋白被明显的定位到细胞核中,这个结果也与卢沐[14]、薛亚军等[15]和鲁照明等[16]的研究结果一致:他们构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）-Notch1-GFP转染EC9706细胞之后,与食管癌有关的EC9706、Eca109细胞,于低倍镜下也可见大片视野激发绿色荧光的细胞,在胞核处可见更明亮的绿色激发光,高倍镜可见绿色荧光主要在胞核部分表达。

本研究还对Notch1基因做了与GST标签融合的原核表达,结果可见能较好地表达,这为进一步验证Notch1与KLP1蛋白相互作用和生物功能奠定了试验基础,也可以为羊痘预防等相关研究从分子水平提供理论依据。