基于网络药理学探究苦参止痢颗粒治疗湿热泄泻的有效成分及作用机制

金韦呈,张岳峰,刘艳艳,秦俊杰,王玉君,李艳华* （.东北农业大学 动物医学学院,黑龙江 哈尔滨 5006；2.内蒙古农业大学 兽医学院,内蒙古 呼和浩特 0008；.北京生泰尔科技股份有限公司,北京 00000；.哈尔滨品赫生物科技有限公司,黑龙江 哈尔滨 50000）

苦参止痢颗粒是北京生泰尔科技股份有限公司研发并注册成功的三类新兽药,在临床上主要用于清热燥湿、止痢,由苦参、白芍、木香等3味中药组成[1]。苦参为豆科植物苦参（Sophora flavescensAlt.）的干燥根[2],具有清热、除湿、杀虫、利尿、抗菌,治疗湿热泻痢的功效,为君药[3-4]。白芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactifloraPall.）的干燥根[5],具有平肝、止痛,阴涩、止汗,治疗腹痛、泻痢的功效,为臣药[6]。木香为菊科植物木香（Aucklandia lappaDecne.）的干燥根,具有疏肝行气、健脾利胃、治疗脾胃气滞、大肠气滞、肝胆气滞等功效,为佐使药[7]。湿热泄泻是因湿热之邪,相搏肠间,导致气机不畅,故泄泻腹痛[8]。

李梢等[9]报道了中医寒证生物分子网络和寒热方剂的网络调节效应,在国内率先提出网络药理学的学术思想。网络药理学整合了系统生物学、多向药理学、计算生物学、网络分析等多学科的技术和内容,进行疾病-表型-基因-药物多层次网络的构建,从整体的角度去探索药物和疾病间的关系,发现药物靶标和作用机制。目前,网络药理学已成为中医药研究领域的前沿和热点。近年来,人医已经有许多学者通过网络药理学预测如新型冠状病毒[10]、溃疡性结肠炎[11]、结肠癌[12]疾病在中药治疗过程中作用机制的研究,并且取得了一定的成果。在兽医领域也有学者针对马火热壅盛证[13]、猪腹泻[14]、牛气血两虚证[15]等疾病,运用网络药理学研究其在治疗过程中的作用机制。

苦参止痢颗粒通过清热祛湿,调节动物机体的脾胃功能,改善体内湿热所导致的脾胃机能障碍,发挥治疗泄泻的作用。虽然苦参止痢颗粒治疗猪泄泻效果显著,但其有效成分不明,作用机制不清。故本试验采用网络药理学的方法,对苦参止痢颗粒治疗泄泻进行有效成分的预测和靶点的挖掘,从蛋白互作、基因本体和信号通路的角度探讨苦参止痢颗粒对湿热泄泻的作用机制。

1 材料与方法

1.1苦参止痢颗粒中药有效成分及靶点的获取本研究是利用中药系统药理学分析平台TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）检索苦参止痢颗粒全方中各味药所含的化学成分。将各单味药的化合物口服利用度（OB）和类药性（DL）筛选阈值分别设置为口服生物利用度（oral bioavailability）≥30,类药性（drug-like）≥0.18获取其有效成分。在TCMSP平台内根据苦参止痢颗粒的有效成分预测得到对应的靶标蛋白,再将靶标蛋白导入到Uni-Prot数据库（https://www.uniprot.org/）,物种选择为“Sus scrofa”,获取每个靶蛋白所对应的靶基因,即苦参止痢颗粒的有效成分对应的作用靶点。

1.2构建苦参止痢颗粒“成分-靶点”关系网络图将筛选出来的苦参止痢颗粒的有效成分-靶点,利用cytoscape3.7.0软件构建化合物-靶点网络图,探究苦参止痢颗粒治疗湿热泄泻所可能涉及的关键化合物和其相关靶点。

1.3泄泻靶点的获取分别通过GeneCards数据库（https://www.genecards.org/My Genes）和人类孟德尔遗传OMIM数据库（https://omim.org/search/advanced/gene Map）对泄泻的靶标进行预测,将重复的数据进行去重后,得到泄泻相关的靶点。

1.4苦参止痢颗粒与泄泻的共同靶点基因的筛选及网络图的构建将疾病相关基因与药物相关基因进行比较,筛选出共同的靶点基因,然后再运用基迪奥生物网站（https://www.omicshare.com/tools/Home/Property/recharge）使其可视化,构建网络图。

1.5苦参止痢颗粒在猪体内蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络图的构建将药物与疾病相交的靶点蛋白上传至在线STRING 11.0软件（https://stringdb.org/cgi/input.pl）,物种选择为“Sus scrofa”,将最低要求互动分数设置高于0.7最高置信度,且勾选隐藏在网络中出现的断开节点。按照此条件构建由蛋白互作导出基因所组成的PPI网络图,并运用R语言软件（Rx64 4.0.0）对TSV文件中的每个基因邻接节点的个数即基因的关键程度进行统计并排序后,进行可视化,构建网络图。

1.6苦参止痢颗粒在猪体内GO富集及KEGG的分析及可视化将药物与疾病相交的靶点蛋白上传于DAVID数据库,物种选择为“Sus scrofa”,而后将得到的GO富集和KEGG通路数据错误率设置＜0.05,对得到的前20进行分析。随后运用基迪奥生物（https://www.omicshare.com/tools/Home/Property/recharge）进行可视化。

2 结果

2.1苦参止痢颗粒“成分-靶点”关系网络图分析通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）将苦参止痢颗粒中的3种单味药的304个化合物,按照OB≥30,DL≥0.18。筛选出符合条件的化合物,其中白芍有13个化合物、苦参有45个化合物、木香有6个化合物,总共得到64个符合条件的化合物,但并非所有化合物都是有效成分。为此,根据化合物对应靶点的有无再次进行筛选,筛选出37个化合物,去除单味药之间的重复化合物后得到35个活性化合物。利用这35个活性化合物和对应靶点的关系构建网络图,结果见图1。在图中共有139个节点（3个药物名称节点,31个单成分节点,2个共有成分节点,103个靶点节点）和344条边。其中淡黄色代表白芍有效成分,淡绿色代表苦参有效成分,淡蓝色代表木香有效成分,粉色和黄色分别代表木香和白芍共有的有效成分,红色代表有效成分的靶点。

在图1中,节点连接度表示与其相连的路线条数,这些度值越大的化合物或靶点在整个网络中起到枢纽的作用越大,则越可能是关键化合物或者关键靶点。因此,筛选出节点连接度大的节点进行分析。而在图1中存在着一个化合物与多个药物相互作用,一个靶点同时与多个化合物相互作用的情况,这充分体现了复方中药治疗疾病具有多靶标的特点。从化合物的角度进行分析,连接靶点次数排名前10的化合物如表1所示。依次是苦参中的槲皮素（quercetin）、苦参中的的木犀草素（luteolin）、白芍中的山奈酚（kaempferol）、木香中的豆甾醇（stigmasterol）、苦参中的芒柄花黄素（formononetin）、白芍中的β-谷固醇（beta-sitos terol）、苦参中的菜豆蛋白（phaseolin）、胺（inermine）、山槐素（inermin）、苦参碱（matrine）。而从靶点的角度进行分析,连接靶点次数排名前10的靶点如表2所示,分别是PT GS2（前列腺素内环氧化物合成酶2）、NCOA2（核受体共激活因子）、RXRA（维甲酸受体）、ESR1（雌激素受体）、PPARG（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）、ADRB2（Beta-2肾上腺素受体）、PGR（孕激素受体）、NOS2（诱导型一氧化氮合酶）、AR（雄激素受体）、TNF（肿瘤坏死因子）。

表1 苦参止痢颗粒排名前10的活性化合物信息

表2 苦参止痢颗粒排名前10的靶点信息

图1 苦参止痢颗粒化合物靶点网络

2.2苦参止痢颗粒与泄泻共同靶点基因的网络图分析通过TCMSP数据库预测到103个基因靶点,在GeneCards数据库检索到5 600个基因靶点,在OMIM数据库检索到25个基因靶点,总共得到了5 625个基因靶点。然后将苦参止痢颗粒的基因靶点与泄泻的基因靶点在基迪奥生物网站用任务韦恩图做出网络图,其中相交的89个基因分别为PGR、NR3C2、TNF、IL6、CD14、LBP、PTGS2、KCNH2、CHRM3、CHRM2、ADRB2、OPRM1、JUN、CASP3、CASP8、NOS2、AR、PPARG、ACHE、RELA、MMP1、HMOX1、CYP1A1、SELE、NR1I2、ALOX5、GSTP1、SLC2 A 4、NR1I3、SLPI、ESR1、RXRA、CAT、NR3C1、HTR3A、ADRA1D、ESR2、MAOB、IL4、MT-ND6、MMP2、MYC、CD44、VEGFA、BCL2L1、MMP9、IL10、TP53、NFKBIA、MDM2、MCL1、BIRC5、IL2、TYR、IFNG、TOP2A、CD40LG、ADCY2、MET、CXCL8、MMP3、FOS、PLAU、POR、SOD1、RUNX1T1、CAV1、GJA1、IL1B、CCL2、PTGER3、DUOX2、NOS3、HSPB1、PLAT、SERPINE1、IL1A、PPARD、CRP、SPP1、CTSD、IGFBP3、IGF2、IRF1、HK2、ADRA2A、MAOA、ADRB1和EGF,韦恩图结果如图2所示。

图2 药物疾病共靶venn图

2.3苦参止痢颗粒在猪体内蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络图分析图3为苦参止痢颗粒作用于泄泻靶点的蛋白-蛋白互相作用（PPI）网络图,该网络图共有62个节点也就是62个靶点蛋白,200边条,也就是200种关系。根据节点连接度绘制出了前30个靶点蛋白的条形图（图4）,如TNF、IL6、TP53、IL8、VEGFA、MMP9、IL10、JUN、IL1B、ASP3、MYC、CD44、MMP2等。节点连接度越大,其成为核心基因的概率就越大,也就越可能在治疗猪的湿热泄泻中起到关键作用。

图3 苦参止痢颗粒-猪靶点蛋白-蛋白相互作用网络图

图4 苦参止痢颗粒-猪靶点PPI网络图关键靶点

2.4苦参止痢颗粒在猪体内GO富集及KEGG的分析将苦参止痢颗粒与泄泻交集的基因导入DAVID数据库,进行GO和KEGG的富集分析。GO富集分析结果如图5所示,主要涉及有protein heterodimerization activity（蛋白质异二聚活性）、protein homodimerization activity（蛋白质均二聚活性）、steroid hormone receptor activity（类固醇激素受体活性）、cytokine activity（细胞因子活性）、transcription factor activity（转录因子活性）,sequencespecific DNA binding（序列特异性DNA结合）、identical protein binding（相同的蛋白质结合）等方面。KEGG富集分析结果如图6所示,主要是pathways in cancer（癌症信号通路）、transcriptional misregulation in cancer（癌症中的转录失调通路）、chagas disease（American trypanosomiasis）（查加斯病（美国锥虫病通路））、pertussis（百日咳通路）、Leishmaniasis（利 什 曼 病 通 路）、TNF signaling pathway（TNF信号通路）等。

图5 GO富集分析结果

图6 KEGG通路富集分析结果

3 讨论

苦参止痢颗粒是由苦参、白芍和木香等3种中药组成的方剂,具有较好的止泻、调节胃肠蠕动、抗炎、镇痛等作用[1],但是其作用机理目前尚不清楚。笔者应用中药系统药理学分析平台TCMSP按照口服利用度和类药性为筛选条件,得到了方剂中的3味中草药的有效成分及其靶点,并且通过Uniport数据库进行了校正。通过GeneCards数据库和人类孟德尔遗传OMIM数据库对泄泻的基因进行挖掘。将挖掘出的疾病基因和药物的基因相交,随后将相交的基因通过STRING数据库构建PPI网络图,与此同时将这些相交的基因导入DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。通过对“药物-有效成分-靶点-疾病”网络及对相关的通路的分析,揭示了苦参止痢颗粒治疗湿热泄泻“多成分-多靶点-多途径”的作用机制。

根据节点连接度可知该复方药物中可能的有效成分,排名前10位的有效成分分别为槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、芒柄花黄素（formononetin）、β-谷固醇（beta-sitosterol）、菜豆蛋白（phaseolin）、胺（inermine）、山槐素（inermin）、苦参碱（matrine）。目前,这10种化合物中已报道可入血的成分只有苦参碱（matrine）[16-24],因为入血的成分是发挥作用的有效成分,因此苦参碱是其发挥作用的主要有效成分之一,其他9种成分还需进一步试验验证。

苦参止痢颗粒作用于泄泻的靶点蛋白-蛋白互相作用网络图（PPI）分析结果表明,其作用的重要靶 点 主 要 是TNF、IL6、TP53、IL8、VEGFA、MMP9、IL10、JUN、IL1B、CASP3、MYC、CD44和MMP2等,其中最为重要的是TNF。TNF家族有TNF-α和TNF-β细胞因子,TNF-α为促炎因子,主要由活化的巨噬细胞产生,但其他一些细胞,包括淋巴细胞、成纤维细胞和角质形成细胞在感染、炎症和环境应激的情况下也会分泌。TNF-β由活化的淋巴细胞产生,可以传送许多信号。TNF能在免疫调节、炎症反应和机体防御中起到关键作用,生物学活性主要表现在2个方面,介导抗肿瘤免疫及免疫调节作用和引起机体多种病理改变而损伤机体[25]。有学者[26]提出TNF可以有效治疗结肠炎从而减少泄泻的发生。其次是IL-6,它是一种经典的促炎细胞因子,由多种细胞产生,如T淋巴细胞、B淋巴细胞、成纤维细胞、单核细胞、角质形成细胞、系膜细胞、内皮细胞以及肿瘤细胞[27]。此外,它还能够调节各种生理过程,包括急性时相反应、炎症、免疫反应、宿主防御机制、造血和细胞生长等[28]。通过对苦参止痢颗粒与泄泻相交的靶点基因的KEGG通路进行分析,发现KEGG通路富集中癌症通路的错误发现率最小,代表富集显著程度最高。与癌症有关的通路有癌症信号通路、癌症中的转录失调、膀胱癌（bladder cancer）和癌症中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）等。已知在癌症信号通路中TP53是一个重要的抗癌基因可以使癌细胞发生细胞凋亡,从而预防癌变,也可以介导细胞信号传导调节细胞正常生命活动[29],这也预测苦参止痢颗粒可能具有抗肿瘤的作用,但需要体内外试验验证。除了与肿瘤相关的通路有关外,苦参止痢颗粒还与一些通路有关:寄生虫相关的通路如美国锥虫病、利什曼病、疟疾（malaria）、弓形虫病（toxoplasmosis）和阿米巴病（Amoebiasis）；细菌相关的通路如百日咳、沙门菌感染（Salmonellainfection）、肺结核（tuberculosis）、军团杆菌病（legionellosis）；免疫相关的通路如TNF信号通路、Toll样受体信号通路（Tolllike receptor signaling pathway）、NF-κB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、T细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）；炎症相关的通路如类风湿关节炎（rheumatoid arthritis）、炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）等等；这预示着苦参止痢颗粒可能具有抗寄生虫、抗菌、抗炎和调节免疫功能的功能,但尚需进行试验验证。

因为网络药理学是挖掘已报到的数据来进行分析,会因研究的热度或者数据库的更新快慢而导致数据出现偏差,所以在得出KEGG通路后,需将所富集出的通路进一步进行分析。因为有学者提出[30]湿热泄泻与溃疡性结肠炎的病因相符,且苦参碱可通过调控细胞因子如TNF、IL6等通过炎症性肠病（IBD）通路来降低泄泻的发生[31-32],所以IBD通路可能为苦参止痢颗粒治疗湿热泄泻的的最优通路。

本试验结果表明,苦参止痢颗粒主要通过苦参碱调控肿瘤坏死因子、白介素6等靶点蛋白,调控IBD通路发挥治疗湿热泄泻的作用。